Name: Microscopia de reflectométrica espectral em dendritos In Situ (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Aprenda a técnica de reflectometria espectral para imagem sem marcação de axônios mielinizados em tecido nervoso intacto. Este método permite análise nanométrica da mielina com preparação simples e doses de luz reduzidas.

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Este trabalho foi financiado pelo Instituto de ciência básica (IBS-R015-D1) e pelo programa de pesquisa de ciência básica através da nacional Research Foundation de Coreia (NRF) financiado pelo Ministério da educação (2017R1A6A1A03015642).

Todos os procedimentos cirúrgicos foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) da Universidade de Sungkyunkwan e institucional Cuidado Animal.
1. preparação da amostra
Nota: Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos antes de manipulação de animais. Realizar todo o desempenho cirúrgico em uma sala dedicada para procedimentos cirúrgicos. Luvas e batas cirúrgicas estéreis devem ser usadas por todo o pessoal na sala cirúrgica em todos os momentos.
<ol><li>
Fixação de tecidos
	<ol>
<li>Prepare duas seringas de 10 mL que cada um preenchido com tampão fosfato salino (PBS) e paraformaldeído 4% (PFA) em PBS.</li>
		<li>Anestesiar um rato de 7-12-semanas, (C57BL/6J ou quaisquer linhas de rato com ambos os sexos) através da administração de uma mistura de zoletil e xilazina (1:1, 20 mg/kg cada) ou um regime alternativo de anestesia adequada (por exemplo, mistura de 80 mg/kg de ketamina e 10 mg/kg xilazina) com uma injeção intraperitoneal.</li>
		<li>Uma vez que o mouse alcançou um plano cirúrgico da anestesia (use o método de pitada-resposta do dedo do pé), expor o coração cortando a pele e a caixa torácica com uma tesoura.</li>
		<li>Cortar o átrio direito com uma tesoura pequena para drenar o sangue e perfundir a solução de PBS e PFA sequencialmente através do ventrículo esquerdo com uma agulha (taxa de perfusão = 4 mL/min, volume = 10 mL de cada solução). Nota: O rato torna-se duro, se o procedimento for concluído com êxito. O uso de pomada ou esterilização não é necessário que o procedimento é terminal. O procedimento de fixação pode ser ignorado. No entanto, esta etapa é recomendada para minimizar deformações estruturais, incluindo danos nos tecidos mecânicos e inchaço axonal isquêmico. Para mais detalhes sobre a fixação de tecidos, consulte o artigo de Gage, et al . G. J. 10
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação da fatia cerebral
	<ol>
<li>Decapitar o mouse com uma tesoura cirúrgica através da ventral do tórax e abdômen.</li>
		<li>Remova o periósteo usando uma tesoura devidamente pequena até expor totalmente o crânio e o couro cabeludo.</li>
		<li>Quebrar o osso frontal e cortar o crânio ao longo da sutura sagital do osso occipital usando tesouras pequenas com cuidado para não danificar o cérebro.</li>
		<li>Remova cuidadosamente o crânio e a dura-máter sequencialmente utilizando pinça fina.</li>
		<li>Extraia o cérebro usando uma colher de plástico macia, tomando cuidado para não danificar o tecido.</li>
		<li>Lave e mergulhe o cérebro extraído em uma solução PFA 4% durante 30 min a 4 ° C.</li>
		<li>Corte o cérebro fixo em 100-150 µm seções usando um vibratome. Nota: Para obter mais detalhes sobre a preparação do tecido, consulte o artigo por Segev et al 11. para os procedimentos subsequentes, o tecido deve ser cortado em seções mais fino que a espessura do espaçador.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montagem da fatia cerebral
	<ol>
<li>Prepare lâmina de 1 vidro e 2 copos de tampa quadrados (22 × 22 × 0,17 mm) para cada pedaço de tecido.</li>
		<li>Cortar um dos copos de tampa quadrados em meia (duas peças retangulares) usando um cortador de vidro.</li>
		<li>Anexe os dois dos copos de capa cortados ao meio, usando uma super cola no vidro do slide. Nota: O espaço entre os dois copos cortados ao meio deve ser ligeiramente maior que o tamanho da fatia do tecido.</li>
		<li>Colher a fatia do cérebro usando um pincel ou uma pipeta e colocar o tecido no vidro entre o espaçador do slide. Tome cuidado para não dobrar o tecido.</li>
		<li>Dispense 100 μL de PBS sobre a superfície do tecido.</li>
		<li>Coloque o outro vidro tampa quadrado em cima do tecido. Evite a inclusão de bolhas de ar durante esta fase.</li>
		<li>Selo em torno do vidro tampa usando um esmalte (ou alternativamente apropriados adesivos) para evitar a evaporação de PBS e contaminação por poeira durante a sessão de imagens subsequente. Nota: O experimentador pode fazer uma pausa nesta fase.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. calibração
<ol><li>Ligue o microscópio pelo menos 1h antes da imagem latente para permitir a estabilização térmica do laser de origem (ver Tabela de materiais). Em seguida, ativar o software para fazer a varredura espectral (ver Tabela de materiais) e clique no botão adquirir no topo do GUI (Figura 3a).
</li>
	<li>Ative o obturador de software para o laser de luz branca (WLL) e tubo fotomultiplicador (PMT) (Figura 3a).</li>
	<li>Selecione o modo de xyΛ na lista drop-down no Modo de aquisição, em seguida, o modo de entrada de laser é automaticamente alterado de % constante para Poder constante. Desmarque a caixa de seleção do Movimento automático SP. E em seguida, defina a janela espectral do laser entrada para 470 – 670 nm e o tamanho de etapa espectral a 4 nm na Λ-excitação Lambda Scan configurações (Figura 3b).</li>
	<li>Defina o intervalo espectral de PGTO para 450-690 clicando duas vezes ou movendo a barra de ajuste para a faixa espectral (Figura 3C). Nota: Esta faixa espectral deve incluir a largura de banda completa da fonte de entrada.</li>
	<li>Seleccione uma lente objetiva de imersão de água, devidamente com uma abertura numérica elevada (at > 0,7) e dar qualquer valor ao poder de PGTO e laser para ativar o botão configuração AOBS e Live Scan . Mude o caminho óptico, verificando o reflexo na Configuração AOBS (Figura 3d).</li>
	<li>Montar um espelho de referência (ver Tabela de materiais) na fase de microscópio. A superfície do espelho deve ser enfrentada contra a lente objetiva. Se não é fácil de colocar o espelho no palco microscópio, vínculo um espelho na chapa plana (por exemplo, vidro de slide).</li>
	<li>Controle a fase de microscópio para alinhar o plano focal para a superfície do espelho.</li>
	<li>Ajustar o ganho de PGTO e a potência do laser, tendo em conta a gama dinâmica do detector e altere o modo de entrada de laser de constante por cento para Poder constante. Nota: Como é típico, um PGTO ganho de 500 (V) e um poder relativo do laser de 0.1% são utilizados em 570 nm.</li>
	<li>Confirme em um modo de cor pseudo para verificar que não há nenhuma saturação em toda a gama de comprimento de onda. Se for observada a saturação, reduzir a potência do laser (Figura 3a).</li>
	<li>Execute a aquisição de Lambda Scan .</li>
	<li>Retire o espelho do palco e repetir a mesma aquisição sem uma amostra para obter a referência escura (ou seja, deslocamento escuro).</li>
	<li>Salve os dados em um formato TIF Multistacked .</li>
</ol>3. aquisição de imagens provador
<ol><li>Coloque o tecido montado no palco do microscópio. Para aproximadamente alinhar o tecido para o plano focal da lente da objetiva, use o modo de fluorescência de campo amplo através de uma parte do olho.</li>
	<li>Com a Varredura de viver lá, controle a fase de microscópio para alinhar o plano focal para a região de interesse no tecido. Para evitar o ruído de fundo da lamínula, selecione a região alvo de pelo menos 15 μm de profundidade a partir da interface de vidro-tecido.</li>
	<li>Adquira a pilha de imagem espectral para a região de destino usando o mesmo procedimento como descrito nos passos 2.1 – 2.10.</li>
	<li>Salve os dados para o tecido e o deslocamento escuro em formato TIF Multistacked . Nota: O experimentador pode fazer uma pausa nesta fase.</li>
</ol>4. processamento e análise de imagem
<ol><li>Abra os dados espectrais (multistacked TIF) para o espelho de referência e o tecido cerebral no ImageJ.</li>
	<li>Selecione o ROIs (regiões de interesse) para as pilhas de imagem aberto — a área central para o segmento de uma fibra do axônio para o tecido cerebral e o espelho de referência.</li>
	<li>Adquirir os espectros brutos para o ROIs selecionado pela execução imagem → pilhas → eixo z traçar perfil no menu ImageJ.</li>
	<li>Abra os dados de deslocamento escuros, uma tomada para o espelho de referência e os outros que eram levados para o tecido cerebral.</li>
	<li>Adquirir os espectros para os deslocamentos escuros por execução imagem → pilhas → eixo z traçar perfil no menu ImageJ.</li>
	<li>Salve todos os espectros adquiridos usando as opções copiar e colar . Nota: Para a imagem latente do provador, uso do campo de imagem central para minimizar as aberrações ópticas fora do eixo é recomendado. As fibras de axônio podem ser estruturalmente heterogêneas ao longo de seu comprimento. Daí, selecionando o ROI em um segmento do axônio pequenos, tipicamente < 5 µm, para minimizar o volume parcial artefato é recomendado.</li>
</ol>5. linha de base correção e análise de sinal de provador
<ol><li>Subtrai os deslocamento espectros dos espectros do espelho de referência e os tecidos do cérebro.</li>
	<li>Normalize cada espectro dividindo-se a intensidade máxima do espectro.</li>
	<li>Dividir o espectro normalizado do axônio pelo espectro normalizado do espelho de referência e subtrair deslocamento DC do espectro normalizado.</li>
	<li>Medir a frequência de wavenumber encaixando o espectro adquirido para um sinusoidal curva (ver Tabela de materiais) e em seguida, converter o wavenumber adquirida a periodicidade por tomar recíproca.</li>
	<li>Converta a periodicidade wavenumber ao diâmetro do axônio, usando a equação na Figura 4C.</li>
</ol>

<ol><li>Fernandez-Moran, H., Finean, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscope+and+low-angle+x-ray+diffraction+studies+of+the+nerve+myelin+sheath%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Electron microscope and low-angle x-ray diffraction studies of the nerve myelin sheath.</a> Journal of Cell Biology. 3, (1957).</li>
<li>Blaurock, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spaces+between+membrane+bilayers+within+PNS+myelin+as+characterized+by+X-ray+diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The spaces between membrane bilayers within PNS myelin as characterized by X-ray diffraction.</a> Brain Research. 210, 383-387 (1981).</li>
<li>Shim, S. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+imaging+of+organelles+in+live+cells+with+photoswitchable+membrane+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , 13978-13983 (2012).</li>
<li>Urban, N. T., Willig, K. I., Hell, S. W., Nägerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+nanoscopy+of+actin+dynamics+in+synapses+deep+inside+living+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">STED nanoscopy of actin dynamics in synapses deep inside living brain slices.</a> Biophysics Journal. 101, 1277-1284 (2011).</li>
<li>Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nature Methods. 5, 155-157 (2008).</li>
<li>Peters, A., Sethares, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+there+remyelination+during+aging+of+the+primate+central+nervous+system%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Is there remyelination during aging of the primate central nervous system?</a> Journal of Comparative Neurology. 460, 238-254 (2003).</li>
<li>De Campos Vidal, B., Silveira Mello, M. L., Caseiro-Filho, A. C., Godo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+properties+of+the+myelin+sheath%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochemica%22%5BJournal%5D)">Anisotropic properties of the myelin sheath.</a> Acta Histochemica. 66, 32-39 (1980).</li>
<li>Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+in+vivo+imaging+of+myelinated+axons+in+health+and+disease+with+spectral+confocal+reflectance+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy.</a> Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).</li>
<li>Kwon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+nanoscale+optical+metrology+on+myelinated+axons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Label-free nanoscale optical metrology on myelinated axons in vivo.</a> Nature Communication. 8, 1832(2017).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> JoVE. (65), e3564(2012).</li>
<li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27341060">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a> JoVE. (112), e54024(2016).</li>
<li>Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+cell+damage+in+live-cell+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15348(2015).</li>
<li>Chang, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14, 593-599 (2017).</li>
<li>Polishchuk, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+light-electron+microscopy+reveals+the+tubular-saccular+ultrastructure+of+carriers+operating+between+Golgi+apparatus+and+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane.</a> Journal of Cell Biology. 148, 45-58 (2000).</li>
</ol>

Os autores declaram interesses financeiros concorrentes: J. Kwon e M. Choi são inventores da patente pendente tecnologia descrito neste artigo.

Provador é uma nova modalidade de imagem livre de rótulo baseada na interferometria espectral, que pela primeira vez, oferece a informação de nanoescala em axônios mielinizadas ao vivo. No actual protocolo de aquisição, a resolução espacial para o diâmetro do axônio é da ordem de 10 nm. Além disso, o provador utiliza ordens de magnitude menor dose leve em comparação com outros microscopies de super-resolução; assim, é livre de fototoxicidade e fotobranqueamento. Provador forneceria uma nova avenida para estudar a dinâmic...

No sistema nervoso dos mamíferos, mielina fornece condução nervosa rápida e integridade axonal por enwrapping as fibras de axônio com bainhas membranosas em várias camadas. É composta por sua estrutura várias camada alternando nanoescala fino-filmes compostas por membranas de plasma (~ 5 nm), citoplasma (~ 3 nm) e espaços extracelulares (~ 7 nm)1,2. Microscopia ótica, incluindo a recente microscopia de super-resolução, não são adequados para observar a dinâmica de mielina nanoescala devido a sua resolução insuficiente devido à difração óptica3,4,5. Apesar de microscopia eletrônica pode fornecer detalhes de nanostructure a mielina, não é compatível com os sistemas biológicos vivos devido a preparações altamente invasivo amostra envolvendo fixação química e,ultrasectioning67 . Até recentemente, não houve nenhuma técnica aplicável para observar a dinâmica de nanoescala de dendritos em situ.
Schain et al relataram anteriormente que dendritos exibem refletância de luz colorido8. Adotando a análise espectroscópica da luz refletida, criámos uma nova modalidade de imagem para a imagem latente de nanoescala de axônios mielinizados, chamado reflectometria espectral (provador)9. Provador baseia-se a interferência de filme fino que ocorrem na estrutura multi-camadas da bainha de mielina (Figura 1). Por simulação óptica em vários axônios, revelamos que o espectro de refletância é uma função periódica do número de onda e sua periodicidade (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57965/57965eq1.jpg">) é inversamente proporcional ao diâmetro do axônio (d). Esta relação simples (<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57965/57965eq2.jpg">) oferece fácil quantificação do diâmetro do axônio a partir dos dados do provador. Utilizando este, revelamos o axônio prevalente abaulamento sob leve traumatismo crânio-encefálico em nosso relatório prévio.
O sistema de provador baseia-se na microscopia confocal e consiste de uma fonte de laser especializado e filtros (Figura 2). A fonte de entrada é um laser de luz branca, fornecendo banda larga saída espectral visível para regiões de infravermelhas. Para a varredura espectral, o sistema é equipado com dois dispositivos óptico-acústico: um filtro sintonizável Acusto-óptica (AOTF) para a entrega de um comprimento de onda selecionado de fonte entrada de banda larga e um divisor de feixe óptico-acústico (AOBS) para guiar o selecionado refletido comprimento de onda do detector. O software para a microscopia confocal hiperespectral (ver Tabela de materiais) oferece uma opção de varredura espectral personalizável para adquirir sequencialmente as imagens de reflectância em vários comprimentos de onda de entrada. Além disso, a aberração cromática criticamente pode interferir na medição espectral; Portanto, recomenda-se uso de uma lente objetiva de apochromat.
Digno de nota, lasers de luz branca produzir uma saída espectral desigual e componentes ópticos também afetam o perfil espectral. Portanto, os espectros adquiridos precisam ser calibrados para posterior análise quantitativa. Um espelho de prata protegido é geralmente usado como uma referência, que fornece uma reflectância quase constante (&gt; 97%) sobre a região completamente visível. Os espectros adquiridos dividem-se em seguida pelos espectros de referência do espelho.
O tamanho de etapa espectral para a varredura espectral determina a velocidade de aquisição; assim, ele precisa ser otimizado. Como um axónio maior tem um período maior de espectral, requer mais fino amostragem espectral. Por exemplo, um axônio com um diâmetro de 10 µm, dentre os axônios fisiológicos maiores, tem um período espectral de ~ 8 nm. Aplicando os critérios de amostragem de Nyquist, utilizamos o intervalo de amostragem espectral de 4 nm para cobrir todos os axônios fisiológicos nos tecidos nervosos do mouse. Esta abordagem geralmente leva vários segundos para uma varredura espectral completa e, portanto, não é adequada para aplicações na vivo , onde o movimento fisiológico (por exemplo, respiração e batimentos cardíacos) interfere aquisição espectral estável. Anteriormente, resolvemos esse problema por instrumentação um microscópio vertical personalizado, concebido para adquirir todo o espectro para cada ponto usando um espectrômetro de matriz (aquisição velocidade ≈ 30 ms por pixel).
Neste relatório, descrevemos um protocolo detalhado do provador de imagens sobre uma fatia de cérebro fixa, que pode ser executada em um microscópio hiperespectrais comercial (ver Tabela de materiais). Assim, o protocolo pode ser concluído por experimentadores sem especialização em instrumentação óptica. Também abordamos os problemas potenciais e solução de problemas para a aquisição e análise de dados do provador.

<table><tbody><tr><td>Cortador de vidro</td> <td>-</td><td></td> <td>Pode ser comprado em uma loja de conveniência local ou lojas online.</td></tr><tr><td>Esmalte</td> <td>-</td><td></td> <td>Pode ser comprado em uma loja de conveniência local ou em lojas online.</td></tr><tr><td>Objetivo apocromático 40&vezes;, NA 1.1</td><td>Leica Microsystems</td><td>15506357</td><td>Tipo de imersão em água</td></tr><tr><td>Fluoromielina Verde</td><td>Thermo Fisher</td><td>F34651</td><td>Alternativamente, Vermelho de Fluoromielina (F34652) pode ser usado.</td></tr><tr><td>Microscópio Leica SP8 TCS</td><td>Leica Microsystems</td><td>SP8</td><td>Consulte a "Configuração do microscópio" na seção Introdução para obter detalhes.</td></tr><tr><td>Software de imagem</td><td>Leica Microsystems</td><td>LAS-X-Matlab</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>MathWorks</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Mirror</td><td>Thorlabs</td><td>PF10-03-P01</td><td>Revestido com prata protegida.</td></tr><tr><td>Salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Life technologies</td><td>14190-136-Paraformaldeído</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Biosolution</td><td>BP031a</td><td>4% v/v em PBS</td></tr><tr><td>Lamínula</td><td>Thermo Fisher</td><td>3306</td><td>Espessura: #1 (0,13 a 0,17 mm)</td></tr><tr><td>Vidro deslizante</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>5116-20F</td><td>Espessura: ~1 mm</td></tr><tr><td>Super cola</td><td>Henkel</td><td>Loctite 406</td><td>Use um equipamento de distribuição para evitar contato com a pele ou os olhos.</td></tr><tr><td>Bomba de seringa</td><td>Brainetree Scientific</td><td></td> <td>BS-8000 DUAL-Vibratome</td></tr> <tr><td></td><td>Leica Biosystems</td> <td>VT1200S-Laser</td><td></td></tr> <tr><td>de luz branca</td><td>NKT fotônica</td><td>EXB-6</td><td>EXB-6 foi descontinuado e substituído por EXU-6.</td></tr></tbody></table>

microscopia de reflectométrica espectral em dendritos in situ

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

Em um sistema nervoso de mamíferos, mielina fornece um isolamento eléctrico por enwrapping as fibras de axônio em uma espiral de várias camada. Inspirado por sua arquitetura subcellular altamente organizado, desenvolvemos recentemente uma nova modalidade de imagem, chamada reflectometria espectral (provador), que permite que a imagem latente de nanoescala rótulo livre sem precedentes dos axônios mielinizadas ao vivo em situ. O princípio subjacente é obter informações nanoestrutural, analisando o espectro de refletância da estrutura subcelular várias camada. Neste artigo, descrevemos um protocolo detalhado passo a passo para a realização de uma imagem de provador básica dos tecidos nervosos usando um sistema comercial microscópico confocal, equipado com um laser de luz branca e um filtro sintonizável. Cobrimos os procedimentos de preparação da amostra, aquisição de dados espectrais e processamento de imagem para obtenção de informações nanoestrutural.

De acordo com o protocolo, uma fatia do cérebro fixa foi preparada com coloração exógenos, um fluoróforo mielina-direcionamento (ver Tabela de materiais). Imagem de provador foi realizada na fatia cérebro usando um microscópio confocal hiperespectrais comercial em conjunto com fluorescência confocal de imagem (figura 4a). Para provador, entrada intensidade óptica foi definida como 5 µW/µm2 com um tempo de interrupção de pixel ~ 1 µ...

Aqui, apresentamos um protocolo passo a passo para imagem mielinizados axônios em uma fatia do cérebro fixo usando uma rótulo livre nanoescala imagem técnica baseada na reflectometria espectral.

Microscopia de reflectométrica espectral em dendritos In Situ

In a mammalian nervous system, myelin provides an electrical insulation by enwrapping the axon fibers in a multilayered spiral. Inspired by its ...

Essa técnica pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da mielina, como plasticidade da mielina e desmielinização. A principal vantagem desta técnica é que ela permite o estudo da nanoestrutura do axônio mielinizado em tecido cerebral intacto sem qualquer marcação complexa ou preparação de amostra. Aqui, demonstraremos a aplicação em uma fatia de cérebro, mas essa técnica pode ser estendida a animais vivos.Depois de fixar e fatiar o tecido cerebral do camundongo de acordo com o protocolo de texto, prepare uma lâmina de vidro e dois vidros de cobertura para cada fatia de tecido. Use um cortador de vidro para cortar um dos vidros quadrados ao meio. Em seguida, crie um espaçador usando supercola para prender as duas peças na lâmina de vidro.Usando um pincel ou pipeta, colha uma fatia de cérebro e coloque o tecido em uma lâmina de vidro entre o espaçador, tomando cuidado para não dobrar o tecido. Dispense 100 microlitros de PBS na superfície do tecido. Em seguida, coloque a segunda tampa quadrada na parte superior do tecido, evitando a introdução de bolhas de ar.Use esmalte para vedar ao redor da lamínula para evitar a evaporação de PBS e contaminação por poeira durante a sessão de imagem subsequente. Pelo menos uma hora antes da imagem, ligue o microscópio para permitir a estabilização térmica da fonte de laser. Em seguida, ligue o software para varredura espectral e clique no botão adquirir na parte superior da GUI.Ligue o obturador de software para o laser de luz branca e o tubo fotomultiplicador. Em modo de aquisição, selecione o modo lambda XY na lista suspensa. O modo de entrada do laser é então alterado automaticamente de porcentagem constante para potência constante.Em excitação lambda, configurações de varredura lambda, desmarque a caixa de movimento automático do SP e defina a janela espectral para o laser de entrada para 470 a 670 nanômetros e o tamanho do passo espectral para quatro nanômetros. Defina a faixa espectral do PMT para 450 a 690 nanômetros clicando duas vezes ou movendo a barra de ajuste para a faixa espectral. Selecione uma lente objetiva de imersão em água adequadamente com uma abertura numérica alta.Dê qualquer valor ao PMT e à potência do laser para ativar a configuração AOBS e o botão de varredura ao vivo. Na configuração AOBS, alterne para o caminho óptico verificando a reflexão. Em seguida, monte um espelho de referência no estágio do microscópio com a superfície voltada para a lente objetiva.Se não for fácil colocar o espelho na platina do microscópio, cole um espelho na placa plana. Ajuste a platina do microscópio para alinhar o plano focal com a superfície do espelho. Em seguida, ajuste o ganho do PMT e a potência do laser, considerando a faixa dinâmica do detector.Sob uma pseudocor, verifique se não há saturação em toda a faixa de comprimento de onda. Se for observada saturação, diminua a potência do laser. Em seguida, execute a aquisição de verificação lambda.Remova o espelho do palco e repita a mesma aquisição sem uma amostra para obter a referência escura. Em seguida, salve os dados em um formato TIF multi-empilhado. Para realizar a aquisição de imagens SpeRe, coloque o tecido montado na platina do microscópio.Para alinhar aproximadamente o tecido ao plano focal da lente objetiva, através de uma ocular, use o modo de fluorescência de campo amplo. Com a varredura ao vivo ativada, controle a platina do microscópio para alinhar o plano focal à região de interesse no tecido. Para evitar o ruído de fundo da lamínula, selecione uma região-alvo de pelo menos 15 micrômetros de profundidade da interface do tecido de vidro.Adquira a pilha de imagens espectrais para a região de destino usando o mesmo procedimento demonstrado anteriormente neste vídeo. Em seguida, salve os dados para o tecido e o deslocamento escuro no formato TIF multi-empilhado. Para processar as imagens no ImageJ, abra os dados espectrais do espelho de referência e do tecido cerebral.Selecione os ROIs para as pilhas de imagens abertas, a área central para o espelho de referência e o segmento de uma fibra axônica para o tecido cerebral. Em seguida, execute image, stacks, plots perfil do eixo Z para adquirir os espectros brutos para os ROIs selecionados. As fibras axônicas podem ser estruturalmente heterogêneas ao longo de seus comprimentos, portanto, recomenda-se selecionar o ROI em um pequeno segmento axônico normalmente inferior a cinco micrômetros para minimizar artefatos de volume parcial.Abra os dados de deslocamento escuro, um tomado para o espelho de referência e o outro para o tecido cerebral, e plote o perfil do eixo Z como acabamos de demonstrar. Em seguida, use as opções de copiar e colar para salvar todas as opções adquiridas. Para realizar a correção da linha de base e a análise do sinal SpeRe, subtraia os espectros de deslocamento dos espectros do espelho de referência e dos tecidos cerebrais.Normalize cada espectro dividindo a intensidade máxima do espectro. Insira o número de onda tomando o recíproco do comprimento de onda usado no experimento, normalize o espectro do axônio dividindo o do espelho de referência e subtraia o deslocamento DC do espectro normalizado. E então obtenha a frequência do número de onda ajustando o espectro adquirido a uma senóide.Converta a frequência do número de onda adquirida em periodicidade tomando o recíproco e converta a periodicidade do número de onda para o diâmetro do axônio usando a equação mostrada aqui. Neste experimento, fatias de cérebro fixas foram coradas com fluorescência contra mielina e a imagem SpeRe foi realizada com uma dose de luz uma ordem de magnitude menor do que a microscopia confocal de fluorescência convencional. O sinal SpeRe foi localizado ao longo do centro dos axônios mielinizados, conforme esperado pela geometria da reflexão óptica.A partir do espectro refletor de um segmento de axônio, foi obtida a periodicidade do número de onda, que foi posteriormente convertida em diâmetro do axônio. Este gráfico ilustra um perfil transversal da intensidade de fluorescência da região encaixotada aqui, e o diâmetro medido por SpeRe foi encontrado em boa concordância com a medição baseada em fluorescência. A imagem SpeRe é baseada na reflexão óptica.Assim, uma lamínula à base de sílica pode introduzir ruído de fundo significativo. Na configuração óptica, o ruído de fundo foi considerável quando a profundidade de imagem da lamínula foi inferior a cinco micrômetros, mas foi evitado quando a profundidade de imagem é maior que 15 micrômetros. A etapa de calibração não é necessária para todos os experimentos, mas é recomendada pelo menos uma vez por semana.Uma vez concluída a calibração, o procedimento de imagem pode ser concluído normalmente em 20 segundos para cada campo de visão. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de considerar a latência dinâmica do detector para varredura de espectro completo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como obter a nanoestrutura de axônios mielinizados usando imagens de refletância.

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Neuroscience

Neurociência

Uma técnica de imagem para monitoramento de mudanças potenciais de membrana com sub-micrômetro espacial e sub-milissegundo resolução temporal é descrito. A técnica, com base na excitação do laser de corantes sensíveis à voltagem, permite a medição de sinais em axónios e colaterais, ramos terminais axonais e dendríticas individuais espinhas dendriticas.

Tensão sensível Gravação Dye de axônios, dendritos e espinhas dendríticas de neurônios individuais em fatias de cérebro

Fonte: Kwon, J., et al., Microscopia Reflectométrica Espectral em Axônios Mielinizados In Situ.  J. Vis. Exp. (2018) Este vídeo demonstra o uso da reflectometria espectral com um microscópio confocal hiperespectral para analisar padrões de interferência e determinar diâmetros de axônios mielinizados em fatias fixas de tecido cerebral.

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Fonte: McCullagh, E. A., et al. Aplicação de Espectroscopia Raman Anti-Stokes Coerente (CARS) para mielinização de imagem em fatias de cérebro. J. Vis. Exp. (2022)O vídeo demonstra imagens de fluorescência e espectroscopia Raman anti-Stokes coerente (CARS) para visualizar a arquitetura neuronal no tecido cerebral de roedores. A coloração de Nissl marca os corpos celulares ligando-se ao RNA ribossômico, enquanto a imagem CARS tem como alvo a mielina rica em lipídios por meio de sinais induzidos...

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Quadridimensional (4D) de imagem é utilizada para estudar o comportamento e as interacções entre os dois tipos de endossomas em terminais nervosos vertebrado vivo. O movimento destas pequenas estruturas é caracterizado em três dimensões, permitindo a confirmação de eventos, tais como a fusão do endossoma e exocitose.

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Apresentamos um protocolo utilizando microscopia de lapso de tempo de excitação de dois fótons para visualizar simultaneamente a dinâmica das lesões de axônio e mielina em tempo real. Este protocolo proposto permite estudos de fatores intrínsecos e extrínsecos que podem influenciar o destino do axônio mielinizado central após a lesão e contribuir para a incapacidade clínica permanente.

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Aqui, descrevemos um protocolo para a visualização de projeção dos neurônios motores e arborização do axônio em embriões de rato transgénicos Hb9::GFP . Depois de imunocoloração para os neurônios motores, usamos a microscopia de fluorescência folha de luz aos embriões de imagem para posterior análise quantitativa. Este protocolo é aplicável a outros processos de navegação do neurônio no sistema nervoso central.

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Aqui nós apresentamos um protocolo para a combinação de duas técnicas de processamento de amostra, de alta pressão congelamento e processamento de amostra assistida por microondas, seguido por resina mínima incorporação para a aquisição de dados com um íon focalizado feixe microscópio eletrônico (FIB-SEM). Isso é demonstrado usando uma amostra do nervo tibial de rato e Caenorhabditis elegans.

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Aqui nós apresentamos um método para preparar organotypic fatia de culturas de cerebelo de rato e bainha de mielina coloração por IHQ apropriado para investigar mecanismos de mielinização e como no sistema nervoso central.

Preparação e imunocoloração de culturas de fatia cerebelar microambiental Organotypic

A microscopia estimulada de dispersão de Raman (SRS) permite imagens livres de rótulos de biomoléculas com base em sua vibração intrínseca de ligações químicas específicas. Neste protocolo, a configuração instrumental de um microscópio de srs e fluorescência de dois fótons integrado é descrita para visualizar estruturas celulares na medula espinhal de camundongos vivos.

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Visualizar a mielinização é um objetivo importante para muitos pesquisadores que estudam o sistema nervoso. CARS é uma técnica compatível com a imunofluorescência que pode fotografar nativamente lipídios dentro do tecido, como o cérebro, iluminando estruturas especializadas, como a mielina.

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A encefalomielite autoimune experimental (EAE) serve como modelo animal de esclerose múltipla. Este artigo descreve uma abordagem para pontuar inflamação medular, desmielinização e lesão axonal em EAE. Adicionalmente, um método para quantificar os níveis de luz solúvel dos neurofilamentos no soro de camundongos é apresentado, facilitando a avaliação da lesão axonal em camundongos vivos.

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Aprenda a técnica de reflectometria espectral para imagem sem marcação de axônios mielinizados em tecido nervoso intacto. Este método permite análise nanométrica da mielina com preparação simples e doses de luz reduzidas.

Microscopia de reflectométrica espectral em dendritos In Situ

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