Name: Análise de arquiteturas de proteínas e complexos proteína-ligante por espectrometria de massa estrutural Integrativa (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Aprenda a usar espectrometria de massa nativa para analisar complexos proteicos e interações com ligantes em estado nativo. Este método permite estudar oligômeros e estabilidade de complexos com alta sensibilidade.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gostaríamos de agradecer a Karl-Peter Hopfner e Robert Thomas Byrne gentilmente fornecendo HerA e HerA-NurA amostras da proteína e sua ajuda com delineamento experimental. Agradecemos também o Dr. Eamonn Reading para sua revisão do manuscrito. Com gratidão reconhecemos nossos corpos financiamento: Wellcome Trust [109854/Z/Z/15] e a Royal Society [RG150216 de A.P.].

1. amostra preparação para MS nativa de proteínas e complexos proteína-ligante
Nota: Para obter um entendimento da base molecular de uma proteína complexa e vinculação de ligante usando MS nativa, preparação de amostra adequada é a chave. O objetivo desta seção é destacar as etapas de preparação essenciais da amostra antes da análise do MS usando o complexo de HerA-NurA que vincula o DNA e os nucleotídeos como exemplo.
<ol><li>Prepare 20 alíquotas µ l de concentrado proteína purificada (geralmente 15-30 µM) em um tubo de 1,5 mL.</li>
	<li>
Para a análise de ligação de ATP ou ADP Nota: Adicionar o aumento das concentrações da não hidrolisável ATP analógica adenosina 5 '-Ó-(3-thiotriphosphate), tetralithium sal (ATP-γ-S) ou 5 '-difosfato de adenosina (ADP). Non-hidrolisável derivados do ATP geram um complexo estável que permita a proteína ATP-limite ser capturado. Outros análogos de ATP não hidrolisável que poderiam ser testados incluem AMP-PNP e ATP-γ-S-Mg2 +.<ol>
<li>Para estudos de HerA-NurA, misturar 5 µM de proteína purificada com S-γ-ATP e ADP em concentrações que variam de 0-1 mM.</li>
		<li>Para capturar a ligação simultânea de ATP-γ-S e ADP, adicione ambos os nucleotídeos em concentrações iguais ou diferentes.</li>
		<li>Adicionar 2 mM MgCl2 e incubar a 25 ° C em uma incubadora de banho seco por 1h. Nota: Análise de ligação de nucleotídeos usando nESI que MS nativa pode resultar em ligação artefactual em altas concentrações, portanto inespecificas devem ser tidos em conta29. Para investigar a ligação não-específica, adicione uma maior concentração de nucleotídeos entre 2 a 5 mM).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Para a análise de ligação de DNA
	<ol>
<li>Misture a proteína e o DNA em uma relação molar que permite a formação do complexo proteína-ADN. Para HerA e HerA-NurA, misture 5 µM de proteína purificada com DNA na proporção de 1:1.</li>
		<li>Incube a HerA-NurA ou HerA - mistura de DNA por 30 min a 25 ° C em uma incubadora de banho seco, até que ele atinja o equilíbrio. A duração e a temperatura de incubação podem variar dependendo da proteína sob investigação.</li>
		<li>Reserva troca de amostras da proteína para buffers compatíveis MS. Comumente, a solução de acetato de amônio aquoso entre 5m mM-1 a pH 7-8 são usados. Outros buffers compatíveis de MS incluem ethylenediammonium diacetato (EDDA) e trietilamônio acetato (TEAA)30. Para estudos de HerA-NurA, utilize pH de acetato de amônio 200 mM 7. Nota: Existem vários métodos para a troca de reserva antes da análise por MS, como o uso de um concentrador de rotação ou colunas de cromatografia. MS nativa é limitada principalmente pela qualidade da amostra tais como amortecedores e adutos usado durante a purificação. Portanto, é essencial para realizar a dessalinização suficientes para obter picos resolvidos.</li>
		<li>Para estudos de ligação ligante HerA-NurA, buffer de amostras de câmbio 6 - 8 vezes em acetato de amônio 200 mM, utilizando um concentrador. Embora este método é mais demorado, ele garante que resolvido picos são atingidos e permite a determinação da massa exata de ATP/ADP espécies acoplados.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. nativo de MS de aquisição e análise para investigar a complexos de proteínas e complexos proteína-ligante
Nota: Condições de MS devem ser otimizadas para atingir picos altamente resolvidos para permitir medições precisas em massa. Detalhes desta seção otimizado parâmetros em um espectrômetro de massa Q-ToF com um 32 k limite superior m/z quadrupolo.
<ol><li>Preparar os capilares in-house para nano-electrospray e realizar a calibração de instrumentos em massa para medições precisas em massa, como detalhado por Kirshenbaum et al 1.</li>
	<li>Selecione modos TOF de mobilidade, aquisição de íon positivo e sensibilidade.</li>
	<li>Ligue os gases armadilha, API e IMS. Para a separação de IM, usar nitrogênio (60 mL/min) e argônio (8,4 mL/min para a região de armadilha) como pontos de partida e ajuste.</li>
	<li>Defina um intervalo de aquisição adequada m/z. Para uma proteína desconhecida, passos de otimização inicial devem usar uma grande variedade como 500-32.000 m/z.</li>
	<li>Carrega 2 a 3 µ l da solução de complexo da proteína a ser analisado em um capilar revestido ouro e inseri-lo em um suporte de capilar.</li>
	<li>Suavemente aperte o capilar e colocar o capilar na fase de fonte electrospray e deslize o palco para a posição para iniciar a aquisição de dados.</li>
	<li>Aplique pressão de gás de nano-fluxo baixo (0.00-0,05 Bar) até que uma gota é formada na ponta do capilar. A pressão de nano-fluxo então pode ser descartada até que o spray é mantido.</li>
	<li>Ajustar o capilar em relação o cone movendo o capilar x, y, z posiciona e monitorar o íon atual para alcançar um íon estável atual. Aplique uma tensão capilar na faixa de 0,9-1,6 kV.</li>
	<li>Defina o cone de amostragem (50-120 V), deslocamento de fonte (60,0), fonte da temperatura (25 ° C) e fluxo de gás de cone (0.0 L/h). Estas sugeriram condições iniciais podem ser ajustadas.</li>
	<li>Para adquirir um espectro de massa bem resolvido e maximizar a transmissão de íon, ajustar os parâmetros do MS e monitorar a mudança resultante no espectro. Estes incluem ajustar o fluxo de gás na armadilha (2-8 mL/min), ele celular (180 mL/min) e célula IMS (90 mL/min) para alcançar melhor separação na máxima de transmissão.</li>
	<li>Ajuste as energias de colisão de armadilha se deslocamentos de tensão são insuficientes. Ponto de partida ideal é entre 10-50 V. Nota: Aumentando a energia de armadilha pode remover não-covalentemente adutos. No entanto, tenha cuidado para evitar a colisão induzida por dissociação e desdobramento do complexo proteína-ligante. Execute medidas de mobilidade iônica para verificar se as condições do instrumento retêm a proteína no estado nativo dobrado (etapa 3).</li>
	<li>Melhore desolvation, otimizando a tensão de polarização de armadilha. Ponto de partida ideal é V 20-45.</li>
	<li>Otimize a velocidade da onda e a altura de onda para alcançar a melhor separação de mobilidade. Uma explicação detalhada e protocolo podem ser encontrados aqui31. Para os estudos de HerA-NurA, use a velocidade da onda de 40 (m/s) e altura de onda de 550-650 (V).</li>
	<li>Use todos os outros parâmetros como instrumento padrão valores.</li>
	<li>Prepare uma amostra livre de ligante para análise como um controle para cada execução (Figura 1). Para experiências de ligação do ligante, realizar pelo menos três medições independentes.</li>
	<li>Use o software Masslynx para medir massas de espécies gerados e identificar a ligação do ligante, como ligação de ATP e ADP e Estados oligoméricos (Figura 2 e 3). Outros softwares disponíveis incluem UniDec32, PULSAR33 e Amphitrite34.</li>
	<li>Para quantificar a abundância relativa das espécies, use as intensidades de íon correspondente observadas em espectros de ESI-MS crus (por exemplo ligante limite diferentes oligómeros, etc.). Como alternativa, realize a quantificação utilizando software especializado como UniDec e Massign35 (Figura 1 e 3 ).</li>
</ol>3. aquisição e análise de IM-MS
Nota: IM-MS separa íons em fase gasosa com base no seu tamanho (massa), a forma e a carga. Cada característica resolvida no espectro de m/z está associada uma distribuição de tempo de deriva. IM-MS mede o tempo de deriva de um íon que pode ser usado para calcular a secção de colisão (CCS). Valores de tempo de tração medido de IM-MS dados adquiridos usando que um tubo de tração pode ser linearmente correlacionado a CCS valores36. Para viajar a medições de onda IM-MS (TWIMS), calcular os valores de CCS requer uma curva de calibração obtida a partir de padrões de proteína com conhecidos CCS valores37. Estruturas compactas viajam mais rápido que estendida ou estruturas alongadas, devido à reduziram interações com gás de reserva na mobilidade celular38. Portanto, IM-MS pode ser usado para detectar se a estrutura nativa dobrada foi mantida no gás fase39,40. Esta seção descreve como medir IM-MS e calcular o CCS de proteína usando TWIMS.
<ol><li>Após otimizar condições de instrumento de transmissão estável (etapa 2), reduza a energia de colisão e cone de amostragem mais baixa possível, mantendo a qualidade boa espectros.</li>
	<li>Use a velocidade da onda otimizado e altura de onda para adquirir IM-MS (etapa 2).</li>
	<li>Medir a tração de íon tempo com IM-MS em três velocidades diferentes de onda (por exemplo, 550, 600 e 650 m/s), mantendo a mesma altura da onda (por exemplo, 40 V).</li>
	<li>Para determinar os íons proteína CCS, medida proteína calibrants sob as mesmas condições de instrumento usadas para proteína sob investigação. Calibração de deriva-tempo ideal requer medição de proteínas com CCS conhecido.<ol>
<li>Selecione quatro calibrants, dois com uma massa acima e dois com uma massa inferior da proteína sob investigação37. O mais importante, certifique-se que a altura da onda e a velocidade da onda são os mesmos que gravou para a proteína sob investigação.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calcular manualmente CCS41 ou usando um software especializado como o PULSAR33 e Amphitrite34 (Figura 5).</li>
	<li>Para verificar se a proteína é como de um nativo em fase gasosa, comparar CCS experimental para CCS teóricos obtidos de estruturas de alta resolução. Para HerA-NurA, calcule teórica CCS usando o método de aproximação de projeção (PA), usado em MOBCAL42. Outros métodos incluem a trajetória método (TM)42 e exata esfera difícil espalhamento (EHS)43.</li>
</ol>4. em solução de interrupção de complexos de proteínas para MS nativa e IM-MS levou a determinação da estrutura
Nota: Sub complexos da proteína podem em alguns casos ser identificados a partir da mesma solução como o complexo intacta. No entanto, outras informações estruturais tais como subunidade inter conectividade e montagem complexa podem ser alcançados de perturbar as interações da proteína em solução, para formar complexos sub. Isto pode ser conseguido de várias maneiras tais como a adição de solvente orgânico, aumento da força iônica ou manipulando o pH. Para obter informações sobre a conectividade do subunit complexo de HerA-NurA e montagem complexa, sub complexos foram gerados na solução pela adição de solventes que perturbam as interações de subunidade.
<ol><li>Prepare a troca de amostra e tampão de proteína em acetato de amónio, conforme descrito na etapa 1.</li>
	<li>Adicione 10-40% de solvente em incrementos de 10%. Solventes normalmente utilizados são o metanol (MeOH), dimetilsulfóxido (DMSO) ou acetonitrila (ACN). Nota: Isso pode ser realizada dentro de um tubo de polipropileno microcentrifuga.</li>
	<li>Incube a mistura no gelo por 1h.</li>
	<li>Adquira um espectro IM-MS para cada condição (etapas 2 e 3) (Figura 4).</li>
	<li>Use o SUMMIT software44 para atribuir sub complexos da proteína e gerar redes de interação de proteínas. Alternativamente, manualmente gere uma lista de massas teóricas das espécies esperadas.</li>
	<li>Para garantir subcomplexes são dobradas, calcular os valores de CCS experimentais para os sub complexos e comparar a CCS teórica, conforme explicado na etapa 3 (tabela 1, Figura 5 e Figura 6).</li>
</ol>5. investigar a estabilidade de complexos proteína usando colisão induzido desdobramento (CIU)
Nota: Pode ser usado CIU sonda a estabilidade estrutural de proteínas e seus complexos sobre a ligação do ligante. Pacotes de software especialista como PULSAR33, Amphitrite34 e CIU suíte9 então podem ser usados para modelar a fase gasosa desdobramento da proteína sob investigação com e sem ligante. Como exemplo, esta seção descreve o processo de controlo de fase gasosa desdobramento trajetórias e investigando o efeito estabilizador de ligação de DNA e ATP no complexo HerA-NurA.
<ol><li>Gravar dados IM-MS enquanto aumentar a voltagem de aceleração de armadilha de 10 V a 200 V em incrementos de 2-10 V a desenrolar-se progressivamente a proteína na fase gasosa. Nota: Resultados de incrementos menores de gravação mais arquivos de dados ao processo, no entanto, essa abordagem fornece enredo desdobramento mais resolvido, que é importante para analisar os pontos de transição entre espécies dobrado/se desenrolava.</li>
	<li>Analisar os dados adquiridos usando PULSAR33, Amphitrite34 ou CIU suíte9 e gerar parcelas bidimensionais de desdobramento em unidades de CCS em função da aceleração da tensão (etapa 3). Para cada Estado da carga, isto é criado pelo empilhamento as distribuições de CCS intensidade-normalizado em cada tensão de aceleração (Figura 7 A-Bi).</li>
	<li>Gere um enredo desdobramento teórico usando um dos pacotes de software. Os dados serão equipados com um modelo de desdobramento. Isto torna possível quantificar a energia de colisão em que se desenrolam transições ocorrem e determinar a estabilidade das proteínas com e sem limite de ligantes33. Uma transição de desdobramento é quando transições uma espécie de estado (com base em seus valores de CCS experimentais) para outro Estado com um maior CCS.</li>
	<li>Para dosar as transições, calcule o midpoint(s) transição entre Estados usando algoritmos e software como PULSAR33. Isto é comumente relatado como CV50, qual é o valor de tensão de colisão (armadilha) em que 50% de um estado específico está esgotada.</li>
	<li>Usando o valor de50 CV, calcule a energia interna total de um íon usando a colisão do centro de massa energia KE (COM)45. KECOM é definida pela energia interna total disponível para a transição de desdobramento de um íon e é calculado a partir da energia cinética e massas dos parceiros colisão (íon de proteína e gás neutro) conforme descrito na equação (1)10 KEcom (eV) = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57966/57966eq1.jpg"> (equação 1). Onde Z é a carga de íon, MN é a massa do gás neutro eíon de M é a massa do íon proteína. Nota: Isto é porque CIU de proteínas é a carga dependent46, 47. Recomenda-se realizar a análise KECOM para mais de um estado de carga ( Figura 7tudo).</li>
</ol>6. procedimentos de modelagem para simulações de dinâmica Molecular diferencial usado em Integrative MS
Nota: Usando modelos de subunidades proteicas ou complexos tais como estruturas de cristal, simulações de MD diferenciais (proteína complexa com e sem ligante) podem ser usadas para determinar os efeitos da presença de ligante por exemplo na estrutura da proteína e dinâmica. Esta seção detalha um fluxo de trabalho e ferramentas necessárias para modelagem de procedimentos necessários para simulações de dinâmica molecular diferencial de set-up.
<ol><li>Identifica as subunidades que compõem o complexo (Figura 8A, nas etapas 2 e 3). Fonte de modelos existentes de subunidades, por exemplo, estruturas de cristal do banco de dados RCSB (https://www.rcsb.org). A entrada da proteína irá conter uma lista de UniProt sabe estruturas cristalográficas/NMR (http://www.uniprot.org). Se estas não estiverem disponíveis, a sequência teórica pode ser entrada para explosão para identificar modelos adequados para modelização de homologia (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/).</li>
	<li>Monte o complexo na topologia correta (Figura 8A-ii). Isso pode ser feito através de vários métodos. As subunidades individuais podem ser montadas em microscopia de elétron disponível mapas encontrados sobre o EMDB para montar o complexo intacto (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/). Um tutorial para encaixe PDBs EM mapas usando Molecular dinâmica flexível encaixe (MDFF) pode ser encontrado aqui: http://www.ks.uiuc.edu/Training/Tutorials/science/mdff/tutorial_mdff-html/.</li>
	<li>Identifica regiões falta do complexo (Figura 8A-iii). Execute alinhamento múltiplo (MSA) entre o PDB e sequência teórica para identificar resíduos que podem ser inadequados em estruturas de cristal, ou quaisquer mutações herdadas experimentos cristalográficos. MSA pode ser realizada usando os servidores Web tais como T-café (http://tcoffee.crg.cat/apps/tcoffee/do:regular).</li>
	<li>Regenere faltando resíduos através de homologia de modelagem (Figura 8A-iv). Falta de resíduos da proteína complexa pode ser construído usando o programa modelador (https://salilab.org/modeller/). MODELADOR pode output um ensemble de n modelos em diferentes configurações regeneradas. Bons modelos podem ser identificados com base na sua pontuação discreta optimizado proteína energia (droga). Um tutorial completo é fornecido no site do software (https://salilab.org/modeller/tutorial/).</li>
	<li>Realizar simulações de dinâmica molecular diferencial (MD) da proteína complexa (Figura 8-B) para identificar regiões de proteínas que respondem a uma determinada alteração ambiental, por exemplo, a presença de um ligante. Em tais simulações, parâmetros comportamentais de simulação A (só proteína) que age como uma referência, é subtraído de simulação B (proteína + ligante). A flutuação de diferencial raiz quadrada (febre), calculada entre A e B de simulações pode informar sobre as regiões da proteína que aumentam ou diminuem em flexibilidade de forma dependente de ligante.<ol>
<li>Realize simulações de MD e análise a jusante usando GROMACS (http://www.gromacs.org). Um tutorial pode ser encontrado em: http://www.bevanlab.biochem.vt.edu/Pages/Personal/justin/gmx-tutorials/Lysozyme/index.html. Para o viés do modelo elimate, a estrutura do complexo ligante-limite deve ser gerada primeiro. A proteína é então copiada deste sem o ligante, para produzir um modelo de proteína idêntico ao complexo ligante-limite.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

MS está desempenhando um papel cada vez mais importante em caracterizar a estequiometria, interações e arquitetura de subunidade de complexos de proteínas. IM-MS dados podem ser usados para definir topológicos de subunidades dentro multicomponentes complexos. Em comparação com outros métodos existentes de biologia estrutural, MS tem várias vantagens. MS nativa é uma técnica rápida e altamente sensível e pode ser usada para sondar amostras heterogêneas da proteína. Quando acoplado com experiências na solução de interrupção, caminhos de dissociação dos assemblies de proteína podem ser monitorados. Juntamente com a homologia modelos ou estruturas de cristal, as informações oferecidas pelo MS estrutural oferece uma ferramenta para investigar as interações proteína-ligante e fornecer modelos quase nativo e montagem vias11.
Aqui, descrevemos os procedimentos experimentais necessários para analisar a estequiometria e composição das interações da proteína-ligante, com um ou mais ligantes, usando MS integrativa. Isso inclui a preparação da amostra MS, aquisição de dados, análise de dados e a integração de dados de MS usando ferramentas computacionais. Para fazer isso, usamos a DNA-ressecção HerA-NurA hétero-oligoméricas proteína complexa, vinculado a três ligantes (DNA, ATP e ADP), como nosso sistema de modelo. O protocolo mostra o uso do software atualmente disponível para auxiliar a apresentação e análise de dados.
Aquisição de espectros de alta qualidade é importante para a análise de ligação do ligante, portanto, as etapas de preparação de amostra cuidado são críticas, incluindo a purificação de proteínas, titulação de ligante e troca de amortecedor. Uma limitação de nESI MS nativa ao estudar a ligação do ligante é inespecificas. Ligação não-específica ocorre durante a desolvation da gota durante todo o processo de electrospray. Isso aumenta as concentrações de ligante e, portanto, altera a proporção de proteína/ligante29. A ligação de nucleotídeos resulta em uma diferença de massa relativamente pequena entre a apo e proteína de nucleotídeos ligados que não altera a eficiência de ionização50,51.
Usamos o sistema Synapt G2-Si MS para o nosso trabalho, mas os protocolos são aplicáveis para diferentes investigações de outros complexos proteína-ligante usando outros espectrómetros de massa de nano-electrospray comercialmente disponível. Integrativa MS estruturais cada vez mais está desempenhando um papel importante na resolução de problemas biológicos de maior complexidade. O fluxo de trabalho e as técnicas descritas aqui são well-suited para compreender as consequências estruturais e construindo mecanismos de complexo de proteínas e formação da proteína-ligante, que caso contrário são difíceis de estudar usando técnicas estruturais convencionais .

Análise de espectrometria de massa nativa das proteínas intactas e seus complexos é realizado usando electrospray e nano-electrospray ionização (nESI), que preservam o enrolamento de proteínas e interações não covalentes durante o processo de ionização1, 2. Em MS nativa, a estrutura das proteínas e seus complexos são mantidas em um estado quase nativo na fase gasosa3,4. MS nativa detecta vários íons de proteína carregada, que são separadas de acordo com sua massa de cobrar proporção (m/z), permitindo que a massa da proteína ou proteína-ligante complexas para serem calculadas. Esta informação permite a determinação da estequiometria de uma proteína intacta, composição de subunidade, ligação do ligante e interação redes3,4,5,6. MS nativa tem várias vantagens em comparação com outras técnicas como espectroscopia de cristalografia de raios-x e ressonância magnética nuclear5. Em primeiro lugar, MS nativa é uma técnica rápida e altamente sensível, exigindo apenas alguns microlitros (2-3 µ l) de amostras com concentrações de complexas finais relativamente baixas ao nM elevado de gama baixa µM6. Em segundo lugar, MS nativa pode ser usada para interrogar amostras heterogêneas proteína tornando possível analisar várias proteínas e oligoméricos Estados simultaneamente. Em terceiro lugar, MS nativa não requer amostras da proteína a ser modificada antes da análise por reticulação química ou rotulagem de proteína. Estas vantagens tornaram estruturais MS uma poderosa ferramenta de investigação estrutural de complexos de proteínas.
MS nativa pode ser combinada com mobilidade do íon (IM), uma técnica que mede o tempo que um íon de proteína leva para viajar através de um campo elétrico, permitindo a colisão seção transversal (CCS) para ser determinado. O CCS fornece informações estruturais baixa resolução, que permite que informações de heterogeneidade conformacional de proteínas a serem obtidos e topologia. Além disso, permite a análise dos modelos estruturais de proteínas geradas por abordagens computacionais.
Estabilidade de fase gasosa de proteína pode ser investigada usando colisão desdobramento induzido (CIU) medido pelo IM-MS. Durante o processo CIU, proteína íons são acelerados e ativadas por meio do aumento de aceleração colisões com um gás inerte reserva dentro de um espectrômetro de massa7,8,9. Este processo de ativação de colisão faz com que a proteína parcialmente desdobrar, que se traduz em aumento da CCS. Esta mudança na CCS e a energia necessária para desdobrar a proteína pode ser medido usando IM-Sra. esta abordagem, o efeito da ligação do ligante na estabilidade da proteína pode ser medidos10. Subcomplexes podem ser geradas na solução usando métodos de perturbação na solução, tais como a adição de solventes orgânicos para monitorar topologias como de um nativo de complexos de proteínas. Perturbação dos complexos proteína é principalmente devido a ruptura de interações não covalentes intra. Os complexos sub mantêm como de um nativo de topologias e, após a detecção de MS, revelam informações sobre conectividade inter subunidade.
Abordagens integradoras em biologia estrutural combinam diversos métodos para estudar a estrutura e a dinâmica das proteínas e seus complexos3,4,5,6. Nativo MS e IM-MS têm sido usado para descobrir os detalhes moleculares dos sistemas biológicos desafiadoras. Há vários exemplos de aplicações, incluindo o estudo de proteínas montagem vias11,12,13,14, estudando de redes de interação da proteína-proteína15 , 16 , 17, membrana proteínas6,18,19,20,21e interações da proteína-ligante, tais como ácidos nucleicos22,23 ,24.
No entanto, MS nativa também tem suas limitações. Medições de MS nativas muitas vezes são executadas nos buffers de voláteis, tais como acetato de amônio aquoso em que algumas proteínas não reterá seu estado nativo dobrado3,25. No entanto, trabalhos recentes tem demonstrado que essa limitação pode ser superada pela otimização de pulverização diâmetro de ponta de agulha (dicas de 0,5 mm), tais que a proteína e proteína complexa íons podem ser formados diretamente de buffers de não-volátil com alta força iônica que melhor imite o ambiente fisiológico26. Além disso, MS nativa utiliza electrospray para ionizar e transferir conjuntos não-covalente de solução para a fase gasosa; Portanto, a abundância relativa de complexos detectados não inteiramente representar isso em solução5,27. Além disso, em comparação com em solução, as interações hidrofóbicas de fase gás tornam-se mais fracas e interações eletrostáticas tornam-se mais fortes e, portanto, favoreciam3,28.
Neste artigo, nós fornecemos interpretação, análise de dados e protocolos para identificação de proteínas e ligand binding usando MS nativa, IM-MS, CIU, em solução de interrupção e modelagem. O complexo de reparação do ADN, HerA-NurA, é usado como um sistema modelo. Quebras de dupla-hélice do DNA (DSBs) são uma das formas mais citotóxicas e deletérias dos danos do DNA, resultando em instabilidade genética e o eventual desenvolvimento de câncer em seres humanos. Recombinação homóloga é o mecanismo de reparação que erradica DSBs, um processo que é orquestrada por ATP dependente helicase-nuclease complexo, HerA-NurA22.
Combinando o MS nativa e IM-MS com ensaios funcionais e modelagem permitiram a investigação de: i) o papel de Nurarihyon na montagem, conformação e estabilidade do complexo, ii) a interação entre o complexo e dsDNA e sua influência sobre o total estabilidade do complexo e iii) a estequiometria e o impacto de ligação de ATP no conjunto22. Em geral, este trabalho levou a uma melhor compreensão da base molecular do complexo HerA-NurA vinculando mudanças conformacionais complexo de proteínas e estabilidade com ligação de nucleótidos. Este protocolo é genérico para qualquer complex(es) de proteína que interage com um ou vários tipos de ligand(s).

<table><tbody><tr><td>Adenosina 5&prime;-(3-tiotrifosfato) sal de tetralítio</td><td>Merck Millipore</td><td>119120-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina 5&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>20398-34-9</td><td></td></tr><tr><td>Solução de acetato de amônio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2706</td><td></td></tr><tr><td>Micro Bio-Spin Colunas de cromatografia</td><td>Bio-Rad</td><td>7326204</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin Concentrador</td><td>Sartorius</td><td>Z614041-25EA</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio hexahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>246964</td><td></td></tr><tr><td>Water TraceSelect</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95305</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de Borosilicato</td><td>Harvard Apparatus</td><td>300060</td><td></td></tr></tbody></table>

análise de arquiteturas de proteínas e complexos proteína-ligante por espectrometria de massa estrutural integrativa

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

As proteínas são uma importante classe de macromoléculas biológicas que desempenham muitos papéis-chave em funções celulares, incluindo a expressão de gene, catalisando reações metabólicas, reparação de DNA e replicação. Portanto, uma compreensão detalhada destes processos fornece informações essenciais sobre como células função. Estrutural Integrativa MS métodos oferecem informações estruturais e dinâmicas na montagem complexa de proteínas, complexa, estequiometria de subunidade, oligomerização de proteína e conectividade ligação do ligante. Avanços recentes em MS estrutural Integrativa permitiram a caracterização dos sistemas biológicos desafiadoras, incluindo grandes proteínas de ligação de DNA e proteínas da membrana. Este protocolo descreve como integrar diversos dados do MS, tais como MS nativa e íon mobilidade / espectrometria de massa (IM-MS) com simulações de dinâmica molecular para obter insights sobre um DNA helicase-nuclease reparo complexo proteico. A abordagem resultante fornece uma estrutura para estudos detalhados de ligação do ligante a outros complexos de proteínas envolvidas em processos biológicos importantes.

Resultados de MS nativos revelaram o estado oligoméricos, a composição e a topologia do HerA-NurA complexo (Figura 1). Como interações não covalentes são preservadas na fase gasosa, MS nativa de experiências de titulações de ADP e ATP-γ-S determinado a ligação de nucleotídeos emparelhadas de HerA-NurA (Figura 2) e que aumentando a concentração de ATP-γ-S aumenta o parente intensidade de hexamérica HerA (Figura 3). Informações estruturais sobre interações de subunidade foram obtidas de perturbação na solução seguida por MS nativa e estavam em acordo com e massas teóricas (Figura 4 e tabela 1).
Os valores de CCS experimentais de proteínas e seus complexos deriva de experimentos IM-MS (Figura 5). Esses valores são rotacional médio gasoso cálculos transversais da forma molecular e descrevem o estado dimensional da proteína. Valores de CCS são comparados com medições teóricas de cristalografia de raios x e um bom acordo infere que a forma nativa em retidos na fase gasosa (tabela 1). Isto valida usando valores de CCS para a construção de modelos de baixa resolução do proteína montagem48.
CCSs experimentais podem ser calculados para cada íon de estado de carga. Um conformador de proteína como de um nativo pode dar origem para cobrar os íons do estado com valores similares de CCS. Íons de estado maiores carga aumentaram coulombic repulsões que podem levar a proteína fase gasosa se desenrolando e maiores CCS valores em comparação com os teóricos CCSs. O valor de CCS do estado de carga menor íons são, portanto, geralmente usado49. Para HerA-NurA, experiências na solução de interrupção na HerA e HerA-NurA com e sem DNA solicitado a geração de um caminho de montagem começando com monômeros, em seguida, formando a toda hexamérica HerA (HerA6)-complexo de NurA (NurA2) dimérica com o DNA (Figura 6).
Diferenças nas tramas CIU desdobrando-se entre a apo (ligante-free) e ligante vinculado definem a mudança no complexa estabilidade após a ligação do ligante. Uma maior CV50 ou KECOM valor implica um íon mais estabilizado na fase gasosa. CIU e KECOM análise revelou que ligados a DNA HerA-NurA é mais estável que o complexo DNA-livre (Figura 7tudo). Da análise de CIU-MS nos respectivos Estados-ATP-vinculação, estado limite quatro-ATP-γ-S estabilidade complexa reduzida em fase gasosa e o estado de ligado -ATP-γ-S seis onde estão todos os sites está ocupada foi a mais estável (Figura 7Bii). MS nativa pode revelar o nucleotídeo discreto vinculando Estados de HerA; no entanto, ele não consegue distinguir quais subunidades de HerA são vinculativas ATP e onde se efectua essa ligação. Esta informação pode ser derivada de simulações de MD solventes explícitas sobre a hexamérica HerA e a HerA-NurA seguindo o fluxo de trabalho sucinto (Figura 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig1.jpg"> Figura 1. Interrogando o estado oligoméricos, a composição e a topologia do complexo não-covalente HerA-NurA. (A) espectros de massa de HerA, HerA-NurA e HerA-NurA na presença de DNA (DNA de cadeia dupla 15,4 kDa 25 bp). O complexo de HerA sub existe tanto como um hexâmero e um heptamer. Dímero de NurA vincula e um hexâmero de HerA, impondo conversão oligoméricas. O DNA vincula o complexo formado de HerA - NurA (adaptados de Ahdash z. et al, 201722de resultados). (B) relativas intensidades das espécies identificadas são calculadas usando UniDec32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig2.jpg"> Figura 2. Nativo de ESI-MS revela o mecanismo de ligação de nucleotídeos a HerA-NurA. Espectros de massa (A) HerA-NurA e (B) HerA-NurA-DNA com concentrações crescentes de (i) ATP-γ-S e (ii) ADP. Massas medidas são comparadas às massas teóricas e a quantidade de ATP-γ-S ou ADP vinculado são determinados. Medida de massas e número de nucleotídeos ligados são mostrados os espectros. Experimentos de titulações de ATP-γ-S e ADP determinado a ligação de nucleotídeos emparelhadas de HerA-NurA sozinho e quando no complexo com DNA indicando um mecanismo de reação cíclica (adaptados de Ahdash z. et al, 201722de resultados). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig3.jpg"> Figura 3. Medir o efeito de aumentar as concentrações de ATP-γ-S em estado oligoméricas de HerA. (A) espectros de massa de HerA em concentrações crescentes de ATP-γ-S. (B) gráfico mostrando as intensidades relativas de espécies diferentes de nativas MS calculada com o uso de software de deconvolução UniDec32. À medida que aumenta a concentração de ATP-γ-S, a intensidade relativa de hexamérica HerA também aumenta. Número de moléculas de ATP-γ-S vinculado é mostrado os espectros (adaptados de Ahdash z. et al, 201722de resultados). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig4.jpg"> Figura 4. Massa espectros e produtos de dissociação sub complexo de HerA (A) e (B) HerA-NurA (i) em paz e na presença do seguinte (ii) DNA de perturbação na solução. Foram realizados experimentos de interrupção em solução usando 10-40% de acetonitrila, metanol (MeOH) ou dimetilsulfóxido (DMSO) e resultou na formação de vários subcomplexes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig5.jpg"> Figura 5. Íon mobilidade chegada tempo distribuições mostradas um eixo de CCS para complexos e complexos sub gerados. Ícone para cada sub complexo se correlacionam com aqueles anotados sobre os espectros na Figura 4. Experimentais e calculadas massas e valores de CCS de sub complexos estão listados na tabela 1 , os quais mostraram um acordo entre valores experimentais e calculados (depois de considerar a incerteza típica na resolução de viajar íon de onda mobilidade espectrometria de massa de ± 5 - 8%37). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig6.jpg"> Figura 6. Caminho de montagem do complexo HerA-NurA gerado a partir de perturbações na solução nativos círculos MS e IM-Miss coloridas indicam condições onde cada sub complexo foi observado: nativo (verde, antes da ruptura), metanol (amarelo), DMSO (roxo) ou Acetonitrila (vermelho). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig7.jpg"> Figura 7. Investigando o efeito estabilizador do (A) DNA na HerA-NurA e (B) o ATP binding de HerA-NurA-DNA. (i) parcelas de fase gasosa CIU-MS e cálculo de energias (KEcom) (ii) centro-de-massa, uma colisão que mostram que a presença de dsDNA estabiliza o complexo de HerA-NurA e que os seis ATP-γ-S vinculados a estado é o mais estável. Estabilização para diferentes Estados é mostrada. Parcelas foram geradas usando o PULSAR 33. Resultados do (A) adaptados de Ahdash z. et al, 201722. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig7large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig8.jpg"> Figura 8. Fluxo de trabalho para os procedimentos de modelagem para simulações de dinâmica molecular diferencial. (A) gerando o complexo sob investigação através da construção de topologia existente subunidades e reconstruindo a falta de resíduos. (B) fluxo de trabalho para a execução de simulações de dinâmica molecular na proteína complexa com e sem ligante. São simulações de dinâmica molecular correu para a proteína só que atua como uma referência e que é subtraído de simulação de proteína mais ligante. Isto é seguido por cálculo diferencial raiz quadrada flutuação (febre) entre as simulações e determinar o efeito de ligação do ligante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig8large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Complexo / sub complexo</td>
			<td>Massa teórica (kDa)</td>
			<td>Massa experimental (kDa)</td>
			<td>CCS teórico (Å2)</td>
			<td>Experimental CCS (Å2) [comando]</td>
			<td>Condição HN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA6- NurA2
</td>
			<td>416.22</td>
			<td>417.85</td>
			<td>14531</td>
			<td>14577 [42 +] 14599 [43 +] 14608 [44 +] 14637 [45 +]</td>
			<td>10-20% do Grupo ACN, 10-40% DMSO, 10% MeOH</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA6- NurA2- dsDNA</td>
			<td>431.72</td>
			<td>432.27</td>
			<td>-</td>
			<td>14661 [39 +] 14728 [40 +] 14781 [41 +] 14837 [42 +]</td>
			<td>ACN 10%, 10% MeOH</td>
		</tr>
<tr>
<td>NurA1
</td>
			<td>39.12</td>
			<td>38.18</td>
			<td>3254</td>
			<td>2618 [10 +] 2746 [11 +] 2878 [12 +]</td>
			<td>10-40% do Grupo ACN, 10% MeOH, 20-40% DMSO</td>
		</tr>
<tr>
<td>NurA2
</td>
			<td>78.24</td>
			<td>78,36</td>
			<td>4890</td>
			<td>4903 [16 +] 4614 [17 +] 4537 [18 +] 4666 [19 +]</td>
			<td>10-40% MeOH, 20-40% DMSO</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA1
</td>
			<td>56.33</td>
			<td>56.32</td>
			<td>4131</td>
			<td>3647 [14 +] 3792 [15 +] 3950 [+ 16]</td>
			<td>ACN 10-40%, 40% DMSO</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA2
</td>
			<td>112.66</td>
			<td>112,95</td>
			<td>6475</td>
			<td>5648 [20 +] 5747 [21 +] 5842 [22 +] 5996 [23 +]</td>
			<td>Meta de 40%, 10-40% do Grupo ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA3
</td>
			<td>168.99</td>
			<td>169.39</td>
			<td>8607</td>
			<td>7501 [25 +] 7616 [26 +] 7717 [27 +] 7867 [28 +]</td>
			<td>10-40% MeOH, lata de 10-40%, 40% DMSO</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA3 + DNA</td>
			<td>183.99</td>
			<td>184.976</td>
			<td>-</td>
			<td>7655 [26 +] 7990 [27 +] 8107 [28 +]</td>
			<td>10-30% ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA4
</td>
			<td>225.32</td>
			<td>226.2</td>
			<td>10477</td>
			<td>9205 [30 +] 9287 [31] 9493 [32 +] 9961 habitantes [33 +]</td>
			<td>10-40% MeOH, 10-40% do Grupo ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA4 + DNA</td>
			<td>240.82</td>
			<td>241.33</td>
			<td>-</td>
			<td>9637 [31 +] 9756 [32 +] 9830 [33 +]</td>
			<td>10-30% ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA5
</td>
			<td>281.65</td>
			<td>282.75</td>
			<td>11853</td>
			<td>10847 [36 +] 10958 [37 +] 11161 [38 +]</td>
			<td>30-40% ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA6
</td>
			<td>337.98</td>
			<td>339.3</td>
			<td>12517</td>
			<td>12335 [38 +] 12386 [39 +] 12498 [40 +] 12590 [41 +] 12676 [42 +] 13019 [43 +]</td>
			<td>10-40% MeOH, 10-40% do Grupo ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA6 + DNA</td>
			<td>353.48</td>
			<td>354.626</td>
			<td>-</td>
			<td>12890 [40 +] 13081 [41 +] 13184 [42 +] 13273 [43 +] 13463 [44 +] 13576 [45 +]</td>
			<td>30% ACN</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA7
</td>
			<td>394.3</td>
			<td>395.85</td>
			<td>13901</td>
			<td>14154 [42 +] 14219 [43 +] 14261 [44 +] 14285 [45 +] 14335 [46 +]</td>
			<td>10-40% MeOH, 10-40% do Grupo ACN, 10-40% DMSO</td>
		</tr>
<tr>
<td>HerA7 + DNA</td>
			<td>409.8</td>
			<td>410.62</td>
			<td>-</td>
			<td>14414 [41 +] 14510 [42 +] 14558 [43 +] 14598 [44 +] 14630 [45 +] 14641 [46 +]</td>
			<td>10% ACN</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1. Massas experimentais e calculadas e os valores de CCS de HerA-NurA e seus complexos sub geraram estudos de interrupção na solução de formulário.

Espectrometria de massa (MS) emergiu como uma importante ferramenta para a investigação da estrutura e a dinâmica dos conjuntos macromoleculares. Aqui, nós integramos abordagens baseadas em MS para interrogar a formação do complexo de proteínas e a ligação do ligante.

Análise de arquiteturas de proteínas e complexos proteína-ligante por espectrometria de massa estrutural Integrativa

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

Hoje em dia a espectrometria de massa desempenha um papel importante na biologia estrutural. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre importantes macromoléculas biológicas em seu estado natal, especialmente proteínas e complexos proteicos. A espectrometria de massa nativa é amplamente aplicável a uma variedade de conjuntos biomoleculares, incluindo sistemas multiproteínas e ácidos nucleicos.A principal vantagem desta técnica é que ela é rápida e altamente sensível. Pode ser usado para interrogar amostras de proteína heterogêneas, possibilitando a análise de múltiplas proteínas em estado oligomerico simultaneamente. Demonstrando o procedimento será Andy Lau, um estudante de doutorado do meu grupo.Para iniciar este procedimento, prepare os capilares internos para nanoeletríspray, conforme descrito no protocolo de texto. Prepare uma amostra sem ligante como um controle para cada corrida, pois o buffer troca cada um em acetato de amônio. Em seguida, selecione os modos de sensibilidade, aquisição de íons positivos e tof de mobilidade.Em seguida, ligue os gases da armadilha, API e IMS. Para a separação IM use os pontos de partida de nitrogênio e argônio mostrados aqui e ajuste conforme necessário. Defina uma faixa de aquisição adequada de m/z.Para uma proteína desconhecida, as etapas iniciais de otimização devem usar uma ampla gama. Insira o capilar revestido de ouro em um suporte capilar. Em seguida, carregue entre dois e três microliters da solução complexa de proteína de interesse no capilar.Aperte suavemente o capilar e coloque-o no estágio de origem do eletrospray. Deslize o estágio em posição para começar a adquirir dados. Aplique uma pressão de gás de baixo fluxo nano-fluxo até que uma gota se forme na ponta do capilar.Mova o capilar em relação ao cone e monitore a corrente de íons para alcançar uma corrente de íon estável. Aplique uma tensão capilar na faixa entre 0,9 e 1,6 kilovolts. Em seguida, defina o cone de amostragem, deslocamento de origem, temperatura da origem e fluxo de gás cone conforme descrito no protocolo de texto.Para adquirir um espectro de massa bem resolvido e transmissão de íon maximizada, ajuste os parâmetros de MS e monitore a mudança resultante no espectro. Coloque a energia de colisão da armadilha em um ponto de partida inicial entre 10 e 50 volts. Se os deslocamentos de tensão forem insuficientes, ajuste as energias de colisão da armadilha.Coloque a armadilha através de sua tensão em um ponto de partida inicial entre 20 e 45 volts. Melhore a desolação otimizando essa tensão. Depois disso, otimize a velocidade de onda e a altura das ondas conforme descrito no texto para obter a melhor separação de mobilidade.Para estudos envolvendo HerA e NurA use uma velocidade de onda de 40 metros por segundo e uma altura de onda entre 550 e 650 volts. Para análise de ligação de DNA, misture a proteína e o DNA em uma razão molar que permite a formação do complexo de DNA proteico. Adicione quantidades crescentes de qualquer um dos seguintes, 5'O-3-thio-triphosfato, sal de tetralítico ou ADP.Utilizando software apropriado, mede as massas de espécies geradas e identifica a ligação de ligantes, como a vinculação ATP e ADP e estados oligomericos. Em seguida, use as intensidades de íons observadas no espectro bruto de ESI MS para quantificar a abundância relativa correspondente das espécies. Depois de otimizar as condições do instrumento para transmissão estável, reduza a energia colisal e o cone amostral o mais baixo possível, mantendo ainda boa qualidade de espectro.Use a velocidade de onda otimizada anteriormente determinada e a altura das ondas para adquirir IM MS. Meça o tempo de deriva de íon em três velocidades de onda diferentes, mantendo a mesma altura de onda. Para determinar a proteína íon CCS meça quatro calibrantes proteicos, dois com a massa acima da proteína em investigação e dois com a massa abaixo, utilizando as mesmas condições de instrumentação. Primeiro, prepare as amostras de proteína e troque-as em acetato de amônio, conforme descrito no protocolo de texto.Adicione solvente em incrementos de 10% até atingir a quantidade desejada. Incubar no gelo por uma hora. Depois disso, adquira um espectro IM-MS para cada amostra.Usando o software SUMMIT, atribua subcoplexos proteicos e gere redes de interação proteica. Alternativamente, gerar manualmente uma lista de massas teóricas para as espécies esperadas. Para começar a investigar a estabilidade do complexo proteico, registo os dados do IM-MS enquanto aumentam a tensão de aceleração da armadilha de 10 volts para 200 volts, que se desdobrará progressivamente para a proteína e a fase do gás.Analise os dados usando software apropriado e gere gráficos desdobrados empilhando as distribuições de CCS normalizadas de intensidade em cada tensão acelerada para cada estado de carga. Os resultados nativos de ESM revelam o estado oligomérico, a composição e a topologia do complexo HerA e NurA. À medida que as interações não covalentes são preservadas na fase de gás, os experimentos nativos de gamma S e ADP são usados para determinar a ligação de nucleotídeos em pares no HerA e nurA.Espectros em massa dos estados oligomericos hera revelam que o aumento da concentração de gama S ATP aumenta a intensidade relativa do HerA hexameric. Os valores experimentais do CCS para as proteínas e seus complexos são então derivados dos experimentos IM-MS. Esses valores são vistos como de boa concordância com as medidas teóricas da cristalografia de raios-X, que valida o uso de valores ccs para a construção de modelos de baixa resolução de montagem de proteínas.A análise da CIU e da KEcom revela que o DNA ligado ao HerA-NurA é mais estável do que o complexo livre de DNA. A análise do CIU MS e os respectivos estados vinculantes da ATP mostram que os quatro estados vinculados à ATP gama S reduzem a estabilidade complexa na fase do gás. No entanto, o estado vinculado a seis ATP gama S em que todos os locais estão ocupados, é visto como o mais estável.Medições precisas da massa molecular de um complexo intacto fornecem uma visão valiosa da caracterização biomolecular. Podemos obter informações sobre caminhos complexos de montagem, oligomerização de proteínas e ligação de ligantes. A combinação de todas essas informações permite gerar modelos detalhados de conjuntos biológicos funcionais.

analyzing-protein-architectures-protein-ligand-complexes-integrative

Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

Espectrometria de massa tem provado ser uma ferramenta valiosa para a análise de grandes complexos de proteínas. Este método permite insights sobre a arquitetura de estequiometria, composição e global da subunidade multi-montagens. Aqui, descrevemos, passo-a-passo, como realizar uma análise de espectrometria de massa estrutural, e caracterizar as estruturas macromoleculares.

Analisar grandes complexos de proteínas por espectrometria de massa estruturais

Ion espectrometria de mobilidade de massa é uma tecnologia emergente fase gasosa que separa íons, com base em sua colisão transversal e massa. O método fornece informações tridimensionais sobre a topologia geral e forma de complexos de proteínas. Aqui, descrevemos um procedimento básico para configuração e otimização de instrumento, calibração de vezes drift, e interpretação dos dados.

T-wave Ion Mobility Spectrometry massa: Basic Procedimentos para Análise Experimental Protein Complex

Medição de massa exata representa um passo importante durante a investigação de proteínas. De matriz assistida por laser de dessorção / ionização (MALDI) Espectrometria de massa (MS) pode ser utilizado para tal determinação e a sua principal vantagem é a tolerância para os sais, detergentes e contaminantes. Aqui, ilustramos uma abordagem acessível para a análise de proteínas maiores do que 100 kDa, por MALDI-MS.

Matrix-assisted laser dessorção / ionização Time of Flight (MALDI-TOF) espectrometria de massa Análise de proteínas intactas maior que 100 kDa

Aqui, apresentamos protocolos detalhados para espectrometria de massa de troca de hidrogênio/deutério de amida em estado sólido (ssHDX-MS) e espectrometria de massa de marcação fotolítica em estado sólido (ssPL-MS) para proteínas em pós sólidos. Os métodos fornecem informações de alta resolução sobre a conformação e interações de proteínas no estado sólido amorfo, o que pode ser útil no projeto de formulação.

Mass Spectrometric Abordagens para estudar a estrutura das proteínas e interacções em liofilizados Pós

Aqui apresenta-se os protocolos para a purificação por afinidade de complexos de proteínas e a sua separação por PAGE nativa azul, seguido pelo perfil correlação protea utilizando espectrometria de massa quantitativo livre etiqueta. Este método é útil para resolver interactoma em complexos de proteínas distintas.

Resolver purificada por afinidade complexos de proteínas por Azul Native PAGE e Proteína Correlação Profiling

A arquitetura de complexos de proteínas é essencial para a sua função. Combinar várias técnicas de espectrometria de massa provou poderosa para estudar seu assembly. Nós fornecemos protocolos para cross-linking química e espectrometria de massa nativa e mostrar como essas técnicas complementares ajudam a elucidar a arquitetura de assemblies multi o subunit da proteína.

Combinando reticulação química e espectrometria de massa de complexos de proteínas intactas para estudar a arquitetura de montagens de proteínas com multi- subunidades

Aqui nós apresentamos um protocolo para monitorar a montagem e desmontagem da toxina antraz usando interferometria biolayer (BLI). Na sequência de montagem/desmontagem na superfície biosensor, os grandes complexos de proteínas são liberados da superfície para visualização e identificação dos componentes dos complexos usando microscopia eletrônica e espectrometria de massa, respectivamente.

Analisando a dinâmica da proteína montada sobre e libertado da interferometria Biolayer Biosensor usando espectrometria de massa e de microscopia eletrônica

Os procedimentos experimentais para a realização de rotulagem covalente à base de diethylpirocarbonato com detecção espectrométrica em massa são descritos. O dietilpirocarbonato é simplesmente misturado com o complexo de proteínas ou proteínas de interesse, levando à modificação de resíduos de aminoácidos acessíveis solventes. Os resíduos modificados podem ser identificados após a digestão proteolítica e a análise da cromatografia líquida/espectrometria de massa.

Rotulagem covalente com dietilpirocarbonato para estudar estrutura de alta ordem de proteína por espectrometria de massa

Estudos biofísicos e bioquímicos das interações entre os domínios membrana-proteína embutidos enfrentar muitos desafios técnicos, a primeira das quais é a obtenção de material de estudo adequado. Este artigo descreve um protocolo para a produção e purificação de complexos estabilizados por dissulfureto transmembranares peptídicas que são adequadas para análise estrutural por ressonância solução magnética nuclear (RMN) e de outras aplicações analíticas.

Complexos de produção de transmembrana Disulfide-estabilizados Peptídicos para estudos estruturais

A estrutura da solução de RMN de um peptídeo modelo de metalochaperona com (I) foi determinada, e um protocolo detalhado desde a preparação da amostra e coleta de dados 1D e 2D até uma estrutura tridimensional é descrito.

Determinação da estrutura e coordenação de complexos peptídeo-metal usando RMN 1D e 2D 1H

Aprenda a usar espectrometria de massa nativa para analisar complexos proteicos e interações com ligantes em estado nativo. Este método permite estudar oligômeros e estabilidade de complexos com alta sensibilidade.

Análise de arquiteturas de proteínas e complexos proteína-ligante por espectrometria de massa estrutural Integrativa

Explorar mais vídeos