Name: Rastreio de biblioteca superexpressão de acasalamento-baseado no fermento (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Aprenda a realizar rastreio de superexpressão em levedura por acasalamento para investigar toxicidade de proteínas associadas a doenças neurodegenerativas. Este método eficiente utiliza bibliotecas de plasmídeos em placas de 96 poços.

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Somos gratos as discussões pensativo com membros do laboratório Ju e laboratório de Zhong e o apoio financeiro de Wright State University.

Nota: O protocolo descrito aqui é projetado para triagem plasmídeos biblioteca contidos em dez placas de 96 poços, mas pode ser escalado para cima ou para baixo em conformidade. O protocolo deve ser repetido para completar o rastreio de toda biblioteca. Normalmente, triagem contra 10 placas de genes biblioteca cada vez pode ser confortavelmente manipulada por 1 pessoa.
1. preparação para a transformação de leveduras de 96 poços
Nota: Este passo é feito como anteriormente descrito7,10.
<ol><li>Alíquota de 5 µ l (aproximadamente 50 – 100 ng) do plasmídeo de uma biblioteca de matriz do plasmídeo em cada poço de uma placa de 96 poços de fundo redondo. Nota: Um exemplo de uma biblioteca seria um fermento gene superexpressão biblioteca10.</li>
	<li>Semear em 150 mL de levedura peptona dextrose (YPD) meios de comunicação em um balão de 500 mL com uma colônia (2 – 3 mm de diâmetro), da cepa de levedura haploide W303α. Incube-los durante a noite a 30 ° C, com agitação (200 rpm).</li>
	<li>Na manhã seguinte, medir a OD600 da cultura durante a noite e diluir a cultura de levedura para OD600 = 0.1 em (até) 2 L de YPD. Incubar a 30 ° C, com agitação (200 rpm) para ~ 5 h até a cultura atinge OD600 = 0.4-0.6.</li>
</ol>2. fermento transformação
<ol><li>Colheita da cultura de levedura enchendo 8 garrafas de centrífuga estéril 250 mL e centrifugação-los à temperatura ambiente a 3.000 x g por 10 min. decantar o sobrenadante sem perturbar o sedimento. Nota: Realize todas as etapas de centrifugação à temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavagem do fermento com destilada estéril H2O. Para isso, adicionar 100 mL de estéril H2O para cada garrafa de centrífuga e vórtice para Ressuspender as células. Combine as células lavadas em 2 garrafas e centrífuga-los a 3.000 x g durante 5 min. decantar o sobrenadante.</li>
	<li>Lavar as células em cada frasco em 100 mL de 0.1 M LiOAc/1XTE (100mm LiOAc; 10 mM Tris, pH 8,0; 1 mM EDTA) e os de centrifugação a 3.000 x g por 5 min. deite fora o sobrenadante.</li>
	<li>Durante a centrifugação, ferva 5 mL de esperma de salmão DNA (10 mg/mL) a 100 ° C, usando um aquecedor do bloco por 3 min e depois resfriá-lo no gelo.</li>
	<li>Ressuspender as células em 25 mL de 0.1 M LiOAc/1XTE em cada garrafa, combinar as células ressuspensa e transferi-los para um balão de 150 mL. Adicionar 5 mL do esperma de salmão pre-cooled DNA e ele incube a 30 ° C, com agitação (225 rpm) por 30 min.</li>
	<li>Despeje a mistura de células em um reservatório de reagente descartável estéril e, usando uma pipeta multicanal, transferir 35 µ l da mistura de célula para cada poço da placa de 96 poços de fundo redondo contendo o plasmídeo de biblioteca. Placas de vórtice de 96 poços, usando uma placa reaccional para 1 min a 1.000 rpm. Incube as placas durante 30 minutos a 30 ° C sem tremer. Nota: Não empilhe os pratos, para que o calor pode transferir mais eficientemente. Descobrimos que num Vortex as placas de 96 poços em 1.000 rpm não causa líquido derramar fora dos poços, mas uma velocidade vórtice seguro deve ser testada antes de executar o passo.</li>
	<li>Num balão, prepare 200 mL de tampão de transformação contendo uma concentração final de 40% PEG3350, 10% de DMSO e 0.1 M LiOAc. Preparar o tampão de transformação imediatamente antes da utilização e homogeneizar por agitação.</li>
	<li>Placas de remover 96 poços da incubadora a 30 ° C e misture-os por 30 s a 1.000 rpm usando a placa reaccional. Adicione 125 µ l de buffer de transformação para cada poço e, em seguida, vórtice as placas por 1 min em 1.000 rpm.</li>
	<li>Incubar as placas a 30 ° C por 30 min e depois aqueça o choque o fermento colocando as placas em uma incubadora de 42 ° C por 15 min. Nota: Não empilhe as placas.</li>
	<li>Centrifugar as placas por 5 min a 3.000 x g. Retire o tampão de transformação dos poços invertendo as placas sobre um caixote do lixo e despejo vigorosamente a reserva das placas. Rapidamente borre as placas invertidas sobre uma toalha de papel limpo para remover qualquer líquido na parte superior das placas.</li>
	<li>Enxague as células adicionando as placas 200 µ l de abandono mínimo médio correspondente para o marcador selecionável no plasmídeo a biblioteca. Nota: Usamos um sintético Ura-médio.</li>
	<li>Centrifugar as placas por 5 min a 3.000 x g e remover o sobrenadante sobre um caixote do lixo como na etapa 2.10.</li>
	<li>Adicione 160 µ l de mínimo Ura-médio contendo 2% de glicose. Vórtice as placas por 1 min a 1.000 rpm e incube-os a 30 ° C, durante 48 h sem tremer. Após 48 h, observe que uma pastilha de fermento transformado é visível na parte inferior de cada poço.</li>
	<li>Usando um distribuidor de líquido, adicione 100 µ l de glicose contendo Ura-mídia em cada poço de um novo conjunto de placas de 96 poços.</li>
	<li>Vórtice as placas contendo o fermento transformado (da etapa 2.13) a 1.000 rpm por 30 s. usando um replicador de 96-pino plástico estéril, coloque os pinos nos poços contendo o fermento transformado e então lhes inocular nos poços correspondentes das novas placas cheio de mídia. Incube as novas placas a 30 ° C por 24 h. Nota: Se a trabalhar com 10 placas, o médio pode também ser dispensado manualmente usando pipetas multicanais.</li>
	<li>Após 24h, uma pelota de fermento deve ser visível no fundo de cada poço contendo levedura transformada com êxito. Para salvar essas cepas de leveduras como estoques de glicerol, adicionar 50 µ l de glicerol a 50% para cada poço, vórtice as placas por 30 s a 1.000 rpm, selar as placas com fita de vedação e congelá-los a-80 ° C. Nota: Os passos acima só precisam ser executada uma vez. Projeções futuras de modelos diferentes de fermento contra o mesmo reservatório de reagente descartável de biblioteca podem começar das existências glicerol e proceder imediatamente abaixo da escadaria.</li>
</ol>3. acasalamento entre células que contêm Genes de biblioteca e levedura de consulta
<ol><li>Para reavivar as estirpes de biblioteca do estoque glicerol, tire as placas de 96 poços do freezer-80 ° C, retire a fita de vedação e deixar o fermento descongelar à temperatura ambiente por cerca de 30 min.</li>
	<li>Uma vez que o fermento esteja derretido, use um replicador de 96-pino plástico estéril para inocular os estoques de glicerol para 160 µ l de fresco Ura-mídia contendo 2% de glicose em placas de 96 poços e incube-os a 30 ° C por 24 h. imediatamente após as cepas de biblioteca são usadas , selar as placas com fita de vedação e devolvê-los ao congelador a-80 ° C.</li>
	<li>No mesmo dia as estirpes de biblioteca (W303α) são descongeladas, inocular a levedura de consulta (aqui, FUS em W303a) a 50 mL de YPD e cultivá-lo durante a noite a 30 ° C, com agitação a 250 rpm.</li>
	<li>Na manhã seguinte, despeje a cepa de levedura de consulta para um reservatório de reagente descartável estéril e a alíquota µ l 160 da estirpe utilizada na consulta para cada poço de uma placa de 96 poços, com uma pipeta multicanal.</li>
	<li>Usando o líquido dispensador, dispense 160 µ l de mídia YPD em cada poço de 10 placas de 96 poços. Use estas placas mais tarde para a cepa de levedura de consulta com o fermento da biblioteca de acasalamento.</li>
	<li>Brevemente vórtice para as placas YPD Coe a placa de 96 poços, contendo a estirpe de consulta e em seguida, use um replicador de 96 pinos estéril para transferir a consulta.</li>
	<li>Brevemente vórtice a biblioteca Coe placas e, para cada placa de estirpe de biblioteca, use um novo replicador de 96 pinos estéril para transferir as tensões de biblioteca para as placas YPD que têm sido inoculadas com a cepa de consulta. Nota: As células em glicerol perdem sua viabilidade após vários ciclos de gelo-degelo. Retornando as cepas de biblioteca para o armazenamento a longo prazo (-80 ° C congelador) logo que possível vai manter a biblioteca em boa qualidade e pronto para uso futuro. Mantido corretamente, o estoque de glicerol pode ser congelado e descongelado pelo menos 10 vezes. Também é altamente recomendável manter uma cópia de trabalho e cópias de backup da unidade populacional de glicerol. Quando o estoque de trabalho não funciona, imediatamente, fazer um novo trabalho cópia da cópia de backup.</li>
	<li>Incube as placas YPD a 30 ° C por 24 h. nota que uma pelota de levedura será visível no fundo de cada poço após 24 h.</li>
	<li>Preenchimento de 96 poços placas com um meio de evasão mínima contendo 2% rafinose, correspondente as marcadores selecionáveis no plasmídeo o esforço de consulta, bem como sobre o plasmídeo de biblioteca (por exemplo, Ura aqui - seu-).</li>
	<li>Utilize um replicador de 96 pinos estéril para transferir levedura da YPD culturas para os meios selectivos de acasalamento. Incubar as placas de 96 poços a 30 ° C, durante 48 h; fermento apenas células que tem acasalado e células diploides formado e, portanto, conter ambos o plasmídeo de consulta e o plasmídeo biblioteca será capaz de crescer nessa mídia. Depois de 2 dias, observe que uma pelota é visível no fundo dos poços.</li>
</ol>4. ensaio da mancha
<ol><li>
Após 48 h de crescimento nos meios seletivos contendo rafinose, aviste o fermento em placas de ágar.
	<ol>
<li>Prepare-se 2 conjuntos de placas de Ura-His-desistente contendo 2% de ágar usando placas de poliestireno clara, contendo um 2% galactose e o outro contendo 2% de glicose.</li>
		<li>Placas de vórtice de 96 poços para 1 min a 1.000 rpm, então detectar o fermento para as placas de Ura-His-desistente contendo galactose 2% e 2% de ágar (FUS e biblioteca de genes são induzidos) e as placas de Ura-His-desistente contendo 2% de glicose e 2% de ágar (FUS e biblioteca de genes reprimido) usando uma máquina de spotting robótica, pelo qual a cultura em cada um é bem vista nas chapas de ágar em quadriplicado (i.e., a cultura em 1 bem está manchada de 4 pontos na placa de ágar).</li>
		<li>Após a mancha, deixe as placas de ágar secar e depois colocá-los de cabeça para baixo em uma incubadora de 30 ° C. Fotografe as placas de ágar cada 24h para registar um crescimento mais rápido/mais fermento na qual a toxicidade para a cepa de consulta é resgatada ou para registrar um crescimento mais lento/menos no qual a toxicidade para a cepa de consulta é exacerbada. Incube as placas durante 4 dias. Nota: A cultura em cada bem pode ser manchada em placas de ágar 1-para-1, como mostrado em um anterior método baseado na transformação de10. No entanto, o 1-a-4 manchas aqui (que pode ser convenientemente configurado usando a máquina robótica spotting) aumenta significativamente a robustez do ensaio, reduzindo o número de falsos positivos. Sucessos positivos são considerados apenas quando todas as 4 colônias da mesma bem mostram um fenótipo semelhante.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Dujon, B. A., Louis, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+diversity+and+evolution+in+the+budding+yeasts+%28Saccharomycotina%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome diversity and evolution in the budding yeasts (Saccharomycotina).</a> Genetics. 206 (2), 717-750 (2017).</li>
<li>Khurana, V., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+neurodegeneration+in+Saccharomyces+cerevisiae%3A+why+cook+with+baker%27s+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: why cook with baker's yeast.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).</li>
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<li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinants+and+genetic+modifiers+of+aggregation+and+toxicity+for+the+ALS+disease+protein+FUS%2FTLS%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular determinants and genetic modifiers of aggregation and toxicity for the ALS disease protein FUS/TLS.</a> PLoS Biology. 9 (4), 1000614(2011).</li>
<li>Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+TDP-43+proteinopathy+model%3A+Exploring+the+molecular+determinants+of+TDP-43+aggregation+and+cellular+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (17), 6439-6444 (2008).</li>
<li>Fleming, M. S., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+yeast+plasmid+overexpression+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">High-throughput yeast plasmid overexpression screen.</a> Journal of Visualized Experiments. (53), e2836(2011).</li>
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<li>Barmada, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amelioration+of+toxicity+in+neuronal+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+by+hUPF1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (25), 7821-7826 (2015).</li>
<li>Jackson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+forelimb+function+by+UPF1+gene+therapy+in+a+rat+model+of+TDP-43-induced+motor+paralysis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced motor paralysis.</a> Gene Therapy. 22 (1), 20-28 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Aqui, descrevemos um protocolo para executar uma tela de superexpressão do plasmídeo no fermento usando o acasalamento para introduzir o modelo de fermento a biblioteca do plasmídeo. Usando essa abordagem, vários modelos de levedura de toxicidade de proteína de doenças neurodegenerativas podem ser selecionados usando a mesma coleção de fermento transformado com uma biblioteca de plasmídeo. O laborioso processo de transformação só precisa ser executada uma vez que, após a qual fermento altamente eficiente acasalamento é u...

A brotamento de levedura Saccharomyces cerevisiae tem sido amplamente utilizada em pesquisa científica básica1 compreender processos celulares diretamente relacionados a doenças humanas. Além disso, ela tem sido usada como um organismo modelo para estudar proteínas humanas associadas a doenças, tais como aquelas ligadas a doenças neurodegenerativas mais comuns, incluindo a doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington e amiotrófica Esclerose lateral (ALS)2. Uma vantagem do modelo de levedura é a facilidade com que uma tela de todo o genoma pode ser realizada para identificar caminhos celulares relacionados à toxicidade de doença relacionada com proteínas, dando assim a visão sobre o mecanismo de sua toxicidade. Um tal tela chama-se uma tela de biblioteca superexpressão, em que cada um dos 5.500 genes fermento em uma biblioteca de matriz é transformado em um modelo de levedura para identificar quais genes podem modificar toxicidade quando overexpressed. Este método de triagem foi aplicado com sucesso nos modelos de levedura de múltiplos neurodegenerativas associadas a doença proteínas, incluindo huntingtina para a doença de Huntington3, α-synuclein para a doença de Parkinson4,5 , Aβ para a doença de Alzheimer,6e FUS e TDP-43 para ALS7,8,9. Enquanto é feito geralmente em uma maneira do elevado-throughput10, o passo mais trabalhoso da tela está transformando individualmente 5.500 genes fermento de uma biblioteca de matriz. Esta etapa deve ser executada cada vez que o rastreio é repetido, e sempre que um modelo de levedura recém-criada precisa ser estudado. É importante encontrar uma maneira mais eficiente para realizar essa tarefa.
Células de levedura podem existir estàvel em formas haploides e diploides. Há dois opostos acasalar tipos de células haploides, tipo de acasalamento um e α. células haploides de cada acasalamento tipo produzem e secretam seu próprios pheromone acasalamento específico, ao qual apenas as células acasalamento tipo oposto respondem. Isso permite que o acasalamento entre um e células α para produzir células diploides estáveis, a/α. Este processo é espontânea e altamente eficiente de11. Que pode tirar proveito deste exclusivo do ciclo de vida de S. cerevisiae para introduzir a biblioteca do plasmídeo. Mais especificamente, cada gene na biblioteca do plasmídeo matriz será transformado em células haploides de um tipo de acasalamento, isto é, células α. Estas células que contêm os genes de biblioteca serão então armazenadas em estoque de glicerol em formato matriz de 96 poços. Para cada modelo de fermento que precisa ser rastreada, células de levedura contendo os genes de biblioteca podem ser descongeladas partir do estoque de glicerol, e o rastreio pode ser feito através de acasalamento com o modelo de leveduras de interesse o acasalamento tipo oposto, ou seja, acasalamento tipo um. A ideia de usar o acasalamento para reunir dois genes em fermento não é nova. Foi aplicado com sucesso no fermento do elevado-throughput rastreio do dois-híbrido, em que uma isca construir (ou seja, fusões de domínio Gal4-DNA-binding) em um tipo de acasalamento é reuniu através de acasalamento com uma presa de construção de uma biblioteca de matriz 12. no entanto, essa estratégia nunca foi aplicada em seleções de biblioteca superexpressão, que sempre usaram métodos de transformação tradicional.
Nosso laboratório anteriormente estabelecido um modelo de levedura do ALS-associada da proteína FUS7. Descobrimos que cinco genes de levedura(ECM32, NAM8, SBP1, SKO1e VHR1) que resgatar a toxicidade de FUS quando overexpressed através de triagem de superexpressão biblioteca usando o método de transformação. Estes resultados foram confirmados independentemente com um estudo semelhante por outro grupo8. hUPF1, um homólogo humano de ECM32, mostrou-se mais tarde para suprimir a toxicidade em células neuronais primária13 e em um modelo animal de ALS14 também. Usando estes cinco genes como prova de princípio, vamos demonstrar que todos os cinco genes da mesma forma resgatar toxicidade FUS quando são introduzidos no modelo de levedura FUS por acasalamento. Uma vez que as células de levedura contendo os genes de biblioteca podem ser armazenadas permanentemente em estoque de glicerol e revividas sempre que necessário, este método baseado em acasalamento removerá a etapa demorada de transformação cada vez que a biblioteca precisa ser protegidos contra. Desde que o acasalamento é altamente eficiente com nenhuma transformação do plasmídeo envolvida, esta estratégia também significativamente diminui o custo associado a purificação e a transformação de uma biblioteca grande plasmídeo. Vamos com êxito aplicar este método em uma biblioteca de triagem contra modelo de levedura de FUS.
O procedimento para a seleção com base em acasalamento é brevemente descrito na Figura 1. Inicialmente, a biblioteca de matriz do plasmídeo é transformada em uma cepa de levedura haploide de acasalamento tipo α usando um protocolo de transformação de levedura de alta produtividade em que cada poço de uma placa de 96 poços contém fermento transformado com um plasmídeo de biblioteca específica. Esta coleção de fermento transformado é salvo como um estoque de glicerol que pode ser descongelado e ressuscitado para uso mais tarde. O modelo de leveduras de interesse, na toxicidade FUS neste caso, deve ser gerado em uma cepa de levedura haploide com o tipo oposto de acasalamento (tipo de acasalamento um). De forma elevado-throughput usando estéril 96 pinos replicadores, a estirpe FUS e cepas de leveduras contendo a biblioteca do plasmídeo são transferidas para placas de 96 poços contendo mídia rica e permissão para companheiro. Após o acasalamento, um pequeno volume de cada poço de cultura acasalamento é transferido para placas de 96 poços contendo mídia desistente sintético no qual fermento apenas diploide que contém ambos os FUS e genes de biblioteca podem crescer. Uma máquina robótica spotting é usada para transferência de cultura de levedura de cada poço em placas de ágar, onde a expressão de FUS e os genes de biblioteca é induzida.  Além disso, a cultura de levedura está manchada para controlar placas de ágar, onde FUS e os genes de biblioteca não são expressos. Após crescimento em placas de ágar, serão identificados os genes que resgatar ou exacerbam a toxicidade FUS.

<table><tbody><tr><td>DNA de esperma de salmão (SS-DNA) Sigma-Aldrich</td><td></td><td>&nbsp; D1626</td><td></td></tr><tr><td>YPD caldo</td><td>Research Products International (RPI)</td> <td>Y20090</td><td></td></tr><tr><td>Ágar granulado</td><td>Fisher Sci</td><td>BP97445</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>G32040</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Galactose</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>G33000</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Rafinose Pentahidratada</td><td>Produtos de Pesquisa International (RPI)</td> <td>R20500</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de Amônio</td><td>Fisher Sci</td><td>A702-500</td><td></td></tr><tr><td>Sintético Ura- drop out medium</td><td>Clontech</td><td>630416</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento de queda de aminoácidos de levedura -Histidina/-Uracil</td><td>Clontech</td><td>630422</td><td></td></tr><tr><td>Base de Nitrogênio de Levedura sem Aminoácidos e Sulfato de Amônio</td> Research <td>Products International (RPI)</td> <td>Y20060</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil Sulfóxido (DMSO)</td><td>Fisher Sci</td><td>S67496</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de lítio, anidro</td><td>Fisher Sci</td><td>AC268640010</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenoglicol 3350 (PEG-3350)</td><td>Spectrum Chemical&nbsp;</td><td>Replicador de 96 Pinos PO125-12KG</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td>Placa de ensaio de poço <td>Scinomix</td><td>SCI-5010-OS</td><td></td></tr><tr><td>Nunc OmniTray</td><td>Thermo Sci</td><td>140156</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar 96, fundo redondo com tampa</td><td>Fisher Sci</td><td>07-200-760</td><td>não tratado, estéril</td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; Pipeta Multicanal Research plus</td><td>Eppendorf</td><td>TI13690052</td><td>volume 30-300ul</td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Isotemp Digital Banhos Secos/Aquecedores de Bloco</td><td>Fisher Sci</td><td>88-860-023</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; Centrífuga MixMate</td><td>Eppendorf</td><td>21-379-00</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5810R</td><td>Fisher Sci</td><td>05-413-112</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Avanti J-26 XPI</td><td>Dispensador</td> Multimodo <td>Beckman 393127</td><td></td></tr><tr><td>MultiFlo FX Rotor</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HDA&nbsp; &nbsp;</td><td>Instrumentos Singer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rastreio de biblioteca superexpressão de acasalamento-baseado no fermento

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Brotamento de levedura tem sido amplamente utilizada como modelo no estudo de proteínas associadas a doenças humanas. Rastreio genético de todo o genoma é uma poderosa ferramenta comumente usada em estudos de levedura. A expressão de um número de proteínas de associada a doenças neurodegenerativas no fermento causa citotoxicidade e formação de agregados, sintetizando resultados vistos em pacientes com esses transtornos. Aqui, descrevemos um método para a seleção de um modelo de levedura da esclerose Lateral amiotrófica-associado proteína FUS para modificadores de sua toxicidade. Em vez de usar a transformação, esta nova plataforma de triagem depende do acasalamento de levedura para introduzir o modelo de fermento uma biblioteca matriz de plasmídeos. O método de acasalamento tem duas vantagens claras: em primeiro lugar, é altamente eficiente; em segundo lugar, a biblioteca matriz previamente transformada de plasmídeos pode ser armazenada para a longo prazo como um estoque de glicerol e rapidamente aplicada para outras telas sem a etapa de trabalho intensiva de transformação para o modelo de levedura cada vez. Demonstraremos como esse método pode ser usado com sucesso para triagem de genes que modificam a toxicidade de FUS.

A ALS associada proteína FUS, uma proteína de ligação de RNA/DNA, anteriormente foi estudada em levedura haploide7,8. Genética de seleção usando o método baseado na transformação descobriu vários genes de levedura que suprimem a toxicidade FUS. O homólogo humano de um dos genes fermento demonstrou-se mais tarde para ser eficaz em suprimir a toxicidade em uma célula neuronal primária e o modelo do rato de ALS13</s...

Este artigo apresenta um método baseado em acasalamento para facilitar a triagem de superexpressão em leveduras brotamento usando uma biblioteca de matriz do plasmídeo.

Rastreio de biblioteca superexpressão de acasalamento-baseado no fermento

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo das doenças neurodegenerativas, como quais fatores genéticos e vias regulam a toxicidade das proteínas associadas à doença. A principal vantagem dessa técnica é que o processo altamente eficiente de acasalamento de leveduras é usado para rastrear modelos de leveduras em relação a uma grande coleção de genes de biblioteca. Embora esse método possa fornecer informações sobre a toxicidade das proteínas de doenças neurodegenerativas, ele também pode ser aplicado ao estudo de outros processos celulares em leveduras, como tolerância a outras condições de estresse.Comece este procedimento aliquotando cinco microlitros por poço de DNA de plasmídeo de uma biblioteca de plasmídeos dispostos para placas de fundo arredondado de 96 poços. Mantenha as placas a quatro graus Celsius. Em seguida, inocule 150 mililitros de levedura peptona dextrose ou meio YPD em um frasco de 500 mililitros com uma colônia da cepa de levedura haplóide W303 Alpha.Incube a cultura a 30 graus Celsius com agitação a 200 rpm durante a noite. Na manhã seguinte, após medir o OD600 da cultura noturna, diluir a cultura para um OD600 de 0,1 em dois litros de YPD. Incubar a 30 graus Celsius com agitação a 200 rpm por cerca de cinco horas, até que a cultura atinja um OD600 de 0,4 a 0,6.Para colher a cultura de levedura, encha oito frascos estéreis de centrífuga de 250 mililitros e centrifugue a 3000 xG por 10 minutos em temperatura ambiente. Despeje o sobrenadante sem interromper o pellet. Lave o fermento conforme descrito no protocolo de texto e consolide as células em dois tubos de centrífuga.Ressuspenda cada pellet celular em 25 mililitros de uma solução de acetato de lítio 0,1 molar. Combine as células ressuspensas, adicione cinco mililitros de DNA de esperma de salmão e transfira-os para um frasco de 150 mililitros. Incube a 30 graus Celsius com agitação a 225 rpm por 30 minutos.Após 30 minutos, despeje a mistura de células em um reservatório de reagente descartável estéril. Usando uma pipeta multicanal, transfira 35 microlitros da mistura de células para cada poço das placas de fundo redondo de 96 poços, contendo o DNA do plasmídeo da biblioteca preparado anteriormente. Vortex as placas de 96 poços a 1000 rpm por um minuto.Incube as placas a 30 graus Celsius sem agitar por 30 minutos. Não empilhe as placas, para que o calor possa ser transferido com mais eficiência. Remova as placas de 96 poços da incubadora de 30 graus Celsius e misture-as a 1000 rpm por 30 segundos.Adicione 125 microlitros de tampão de transformação a cada poço e, em seguida, vortex as placas a 1000 rpm por um minuto. Incube as placas a 30 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, choque térmico do fermento, colocando as placas em uma incubadora de 42 graus Celsius por 15 minutos.Centrifugue as placas a 3000 xG por cinco minutos. Remova o buffer de transformação dos poços invertendo as placas sobre uma lixeira e despejando com força o buffer das placas. Seque rapidamente as placas invertidas em uma toalha de papel limpa para remover qualquer líquido em cima das placas.Enxágue as células adicionando a cada poço 200 microlitros de meio de gota mínima correspondente ao marcador selecionável no plasmídeo da biblioteca. Ura sintético menos meio é usado aqui. Centrifugue as placas a 3000 xG por cinco minutos.Remova o sobrenadante sobre uma lixeira conforme demonstrado anteriormente. Adicione 160 microlitros de meio mínimo ura menos, contendo 2% de glicose em cada poço e vórtice as placas a 1000 rpm por um minuto. Incube as placas sem agitar a 30 graus Celsius por 48 horas.Após 48 horas, um pellet de levedura transformada deve estar visível no fundo de cada poço. Usando um dispensador de líquido, adicione 100 microlitros de meio ura menos glicose em cada poço de um novo conjunto de placas de 96 poços. Vortex as placas contendo o fermento transformado a 1000 rpm por 30 segundos.Usando um replicador de plástico estéril de 96 pinos, coloque os pinos nos poços que contêm a levedura transformada e, em seguida, inocule-os nos poços correspondentes das novas placas cheias de meio. Incube as novas placas a 30 graus Celsius por 24 horas. Após 24 horas, uma pelota de levedura deve estar visível no fundo de cada poço que contém levedura transformada com sucesso.Para salvar essas cepas de levedura como estoques de glicerol, adicione 50 microlitros de glicerol a 50% em cada poço, vortex as placas a 1000 rpm por 30 segundos, sele as placas com papel alumínio e congele a 80 graus Celsius negativos. Para reviver as cepas da biblioteca do estoque de glicerol, retire as placas de 96 poços do freezer de 80 graus Celsius negativos, remova a folha de alumínio e deixe o fermento descongelar em temperatura ambiente por aproximadamente 30 minutos. Depois que a levedura descongelar, use um replicador de plástico estéril de 96 pinos para inocular os estoques de glicerol em 160 microlitros de meio fresco ura menos contendo 2% de glicose em placas de 96 poços e incube a 30 graus Celsius por 24 horas.Imediatamente após o uso das cepas da biblioteca, feche as placas e coloque-as de volta no freezer de 80 graus Celsius negativos. No mesmo dia em que as cepas da biblioteca são descongeladas, inocule a cepa de levedura query em 50 mililitros de YPD e cresça a 30 graus Celsius com agitação a 250 rpm durante a noite. Na manhã seguinte, despeje a cepa de levedura em um reservatório de reagente descartável estéril e alíquota de 160 microlitros da cepa de consulta para cada poço de uma placa de 96 poços.Usando o dispensador de líquido, dispense 160 microlitros por poço de meio YPD em placas de 96 poços. Faça um vórtice breve das placas de 96 poços contendo a cepa de consulta e as placas de deformação de biblioteca e, em seguida, use um replicador estéril de 96 pinos para transferir as cepas de biblioteca para as placas YPD que foram inoculadas com a cepa de consulta. Incube as placas YPD a 30 graus Celsius por 24 horas.Após 24 horas, uma pelota de fermento ficará visível no fundo de cada poço. Encha as placas de 96 poços com meio de queda mínimo contendo 2% de Rafinose correspondente aos marcadores selecionáveis no plasmídeo na cepa de consulta, bem como no plasmídeo da biblioteca. Use um replicador estéril de 96 pinos para transferir o fermento das culturas de acoplamento YPD para o meio seletivo.Incube as placas de 96 poços a 30 graus Celsius por 48 horas. Somente células de levedura que se acasalaram e formaram células diplóides e, portanto, contêm o plasmídeo de consulta e o plasmídeo de biblioteca serão capazes de crescer neste meio. Após 48 horas de crescimento no meio seletivo contendo rafinose, observe que um pellet é visível no fundo dos poços que contêm células diplóides.Vortex as placas de 96 poços a 1000 rpm por um minuto. Use uma máquina de manchar robótica para localizar o fermento em placas de ágar em placas quadruplicadas a ura-his-droupout contendo 2% de galactose e 2% de ágar, e a placas ura-his-droupout contendo 2% de glicose e 2% de ágar. Após a mancha, deixe as placas de ágar secarem e coloque-as de cabeça para baixo em uma incubadora a 30 graus Celsius por quatro dias.A cada 24 horas, fotografe as placas de ágar para registrar o crescimento da levedura. A toxicidade da proteína FUS associada à ALS foi examinada pela primeira vez em leveduras diplóides. Conforme indicado pela placa de ágar contendo galactose, que induz FUS, a toxicidade do FUS é consistente tanto em diploCinco genes previamente identificados como supressores da toxicidade do FUS a partir de um método baseado em transformação foram testados pelo método de acasalamento. A Lane one é uma cepa de levedura de controle transformada com dois vetores vazios. A pista dois é a cepa de levedura FUS diplóide com um vetor vazio onde a expressão de FUS é muito tóxica.As pistas três a sete mostram levedura diplóide expressando FUS, bem como um gene de supressão. Todos os cinco genes resgatam a toxicidade do FUS em leveduras diplóides, indicando que o método de acasalamento foi eficaz. Este método baseado em acasalamento foi então aplicado a uma triagem de biblioteca de superexpressão de 940 genes.E uma foto de uma placa representativa é mostrada. Conforme indicado na placa de galactose, onde os genes FUS e biblioteca são expressos, o FUS foi tóxico para a célula de levedura diplod. O gene da biblioteca, indicado pelo quadrado verde, resgatou a toxicidade do FUS.Enquanto o gene da biblioteca, indicado pelo quadrado vermelho, aumentou a toxicidade. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 120 horas, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de verificar de antemão se o fenótipo usado para triagem não depende do tipo de acasalamento haplóide.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como identificar fatores genéticos após a superexpressão que resgatam a toxicidade das proteínas associadas a doenças em leveduras. Após seu desenvolvimento, esta técnica pode abrir caminho para pesquisadores na área de doenças neurodegenerativas, explorarem mecanismos de citotoxicidade de proteínas associadas a doenças no modelo de levedura. Após esse procedimento, outros métodos, como o ensaio de beta galactosidase, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como se o resgate é específico.

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Research

JoVE Journal

Genetics

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