Rastreio de biblioteca superexpressão de acasalamento-baseado no fermento

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo das doenças neurodegenerativas, como quais fatores genéticos e vias regulam a toxicidade das proteínas associadas à doença. A principal vantagem dessa técnica é que o processo altamente eficiente de acasalamento de leveduras é usado para rastrear modelos de leveduras em relação a uma grande coleção de genes de biblioteca. Embora esse método possa fornecer informações sobre a toxicidade das proteínas de doenças neurodegenerativas, ele também pode ser aplicado ao estudo de outros processos celulares em leveduras, como tolerância a outras condições de estresse.

Comece este procedimento aliquotando cinco microlitros por poço de DNA de plasmídeo de uma biblioteca de plasmídeos dispostos para placas de fundo arredondado de 96 poços. Mantenha as placas a quatro graus Celsius. Em seguida, inocule 150 mililitros de levedura peptona dextrose ou meio YPD em um frasco de 500 mililitros com uma colônia da cepa de levedura haplóide W303 Alpha.

Incube a cultura a 30 graus Celsius com agitação a 200 rpm durante a noite. Na manhã seguinte, após medir o OD600 da cultura noturna, diluir a cultura para um OD600 de 0,1 em dois litros de YPD. Incubar a 30 graus Celsius com agitação a 200 rpm por cerca de cinco horas, até que a cultura atinja um OD600 de 0,4 a 0,6.

Para colher a cultura de levedura, encha oito frascos estéreis de centrífuga de 250 mililitros e centrifugue a 3000 xG por 10 minutos em temperatura ambiente. Despeje o sobrenadante sem interromper o pellet. Lave o fermento conforme descrito no protocolo de texto e consolide as células em dois tubos de centrífuga.

Ressuspenda cada pellet celular em 25 mililitros de uma solução de acetato de lítio 0,1 molar. Combine as células ressuspensas, adicione cinco mililitros de DNA de esperma de salmão e transfira-os para um frasco de 150 mililitros. Incube a 30 graus Celsius com agitação a 225 rpm por 30 minutos.

Após 30 minutos, despeje a mistura de células em um reservatório de reagente descartável estéril. Usando uma pipeta multicanal, transfira 35 microlitros da mistura de células para cada poço das placas de fundo redondo de 96 poços, contendo o DNA do plasmídeo da biblioteca preparado anteriormente. Vortex as placas de 96 poços a 1000 rpm por um minuto.

Incube as placas a 30 graus Celsius sem agitar por 30 minutos. Não empilhe as placas, para que o calor possa ser transferido com mais eficiência. Remova as placas de 96 poços da incubadora de 30 graus Celsius e misture-as a 1000 rpm por 30 segundos.

Adicione 125 microlitros de tampão de transformação a cada poço e, em seguida, vortex as placas a 1000 rpm por um minuto. Incube as placas a 30 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, choque térmico do fermento, colocando as placas em uma incubadora de 42 graus Celsius por 15 minutos.

Centrifugue as placas a 3000 xG por cinco minutos. Remova o buffer de transformação dos poços invertendo as placas sobre uma lixeira e despejando com força o buffer das placas. Seque rapidamente as placas invertidas em uma toalha de papel limpa para remover qualquer líquido em cima das placas.

Enxágue as células adicionando a cada poço 200 microlitros de meio de gota mínima correspondente ao marcador selecionável no plasmídeo da biblioteca. Ura sintético menos meio é usado aqui. Centrifugue as placas a 3000 xG por cinco minutos.

Remova o sobrenadante sobre uma lixeira conforme demonstrado anteriormente. Adicione 160 microlitros de meio mínimo ura menos, contendo 2% de glicose em cada poço e vórtice as placas a 1000 rpm por um minuto. Incube as placas sem agitar a 30 graus Celsius por 48 horas.

Após 48 horas, um pellet de levedura transformada deve estar visível no fundo de cada poço. Usando um dispensador de líquido, adicione 100 microlitros de meio ura menos glicose em cada poço de um novo conjunto de placas de 96 poços. Vortex as placas contendo o fermento transformado a 1000 rpm por 30 segundos.

Usando um replicador de plástico estéril de 96 pinos, coloque os pinos nos poços que contêm a levedura transformada e, em seguida, inocule-os nos poços correspondentes das novas placas cheias de meio. Incube as novas placas a 30 graus Celsius por 24 horas. Após 24 horas, uma pelota de levedura deve estar visível no fundo de cada poço que contém levedura transformada com sucesso.

Para salvar essas cepas de levedura como estoques de glicerol, adicione 50 microlitros de glicerol a 50% em cada poço, vortex as placas a 1000 rpm por 30 segundos, sele as placas com papel alumínio e congele a 80 graus Celsius negativos. Para reviver as cepas da biblioteca do estoque de glicerol, retire as placas de 96 poços do freezer de 80 graus Celsius negativos, remova a folha de alumínio e deixe o fermento descongelar em temperatura ambiente por aproximadamente 30 minutos. Depois que a levedura descongelar, use um replicador de plástico estéril de 96 pinos para inocular os estoques de glicerol em 160 microlitros de meio fresco ura menos contendo 2% de glicose em placas de 96 poços e incube a 30 graus Celsius por 24 horas.

Imediatamente após o uso das cepas da biblioteca, feche as placas e coloque-as de volta no freezer de 80 graus Celsius negativos. No mesmo dia em que as cepas da biblioteca são descongeladas, inocule a cepa de levedura query em 50 mililitros de YPD e cresça a 30 graus Celsius com agitação a 250 rpm durante a noite. Na manhã seguinte, despeje a cepa de levedura em um reservatório de reagente descartável estéril e alíquota de 160 microlitros da cepa de consulta para cada poço de uma placa de 96 poços.

Usando o dispensador de líquido, dispense 160 microlitros por poço de meio YPD em placas de 96 poços. Faça um vórtice breve das placas de 96 poços contendo a cepa de consulta e as placas de deformação de biblioteca e, em seguida, use um replicador estéril de 96 pinos para transferir as cepas de biblioteca para as placas YPD que foram inoculadas com a cepa de consulta. Incube as placas YPD a 30 graus Celsius por 24 horas.

Após 24 horas, uma pelota de fermento ficará visível no fundo de cada poço. Encha as placas de 96 poços com meio de queda mínimo contendo 2% de Rafinose correspondente aos marcadores selecionáveis no plasmídeo na cepa de consulta, bem como no plasmídeo da biblioteca. Use um replicador estéril de 96 pinos para transferir o fermento das culturas de acoplamento YPD para o meio seletivo.

Incube as placas de 96 poços a 30 graus Celsius por 48 horas. Somente células de levedura que se acasalaram e formaram células diplóides e, portanto, contêm o plasmídeo de consulta e o plasmídeo de biblioteca serão capazes de crescer neste meio. Após 48 horas de crescimento no meio seletivo contendo rafinose, observe que um pellet é visível no fundo dos poços que contêm células diplóides.

Vortex as placas de 96 poços a 1000 rpm por um minuto. Use uma máquina de manchar robótica para localizar o fermento em placas de ágar em placas quadruplicadas a ura-his-droupout contendo 2% de galactose e 2% de ágar, e a placas ura-his-droupout contendo 2% de glicose e 2% de ágar. Após a mancha, deixe as placas de ágar secarem e coloque-as de cabeça para baixo em uma incubadora a 30 graus Celsius por quatro dias.

A cada 24 horas, fotografe as placas de ágar para registrar o crescimento da levedura. A toxicidade da proteína FUS associada à ALS foi examinada pela primeira vez em leveduras diplóides. Conforme indicado pela placa de ágar contendo galactose, que induz FUS, a toxicidade do FUS é consistente tanto em diplo

Cinco genes previamente identificados como supressores da toxicidade do FUS a partir de um método baseado em transformação foram testados pelo método de acasalamento. A Lane one é uma cepa de levedura de controle transformada com dois vetores vazios. A pista dois é a cepa de levedura FUS diplóide com um vetor vazio onde a expressão de FUS é muito tóxica.

As pistas três a sete mostram levedura diplóide expressando FUS, bem como um gene de supressão. Todos os cinco genes resgatam a toxicidade do FUS em leveduras diplóides, indicando que o método de acasalamento foi eficaz. Este método baseado em acasalamento foi então aplicado a uma triagem de biblioteca de superexpressão de 940 genes.

E uma foto de uma placa representativa é mostrada. Conforme indicado na placa de galactose, onde os genes FUS e biblioteca são expressos, o FUS foi tóxico para a célula de levedura diplod. O gene da biblioteca, indicado pelo quadrado verde, resgatou a toxicidade do FUS.

Enquanto o gene da biblioteca, indicado pelo quadrado vermelho, aumentou a toxicidade. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 120 horas, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de verificar de antemão se o fenótipo usado para triagem não depende do tipo de acasalamento haplóide.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como identificar fatores genéticos após a superexpressão que resgatam a toxicidade das proteínas associadas a doenças em leveduras. Após seu desenvolvimento, esta técnica pode abrir caminho para pesquisadores na área de doenças neurodegenerativas, explorarem mecanismos de citotoxicidade de proteínas associadas a doenças no modelo de levedura. Após esse procedimento, outros métodos, como o ensaio de beta galactosidase, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como se o resgate é específico.