Name: Análise dos N- glicanos de Raphanus sativus cultivares usando PNGase H+ (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Aprenda a preparar e analisar N-glicanos de cultivares de rabanete (Raphanus sativus) usando PNGase H⁺ sem trocas de tampão. Este método simplificado acelera a caracterização de glicanos em glicociência vegetal.

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Este trabalho foi financiado em parte pela Fundação ciência Natural da China (conceder números 31471703, A0201300537 e 31671854, J.V. e ll, conceder número 31470435 para G.Y.) e o plano de talentos estrangeiros 100 (número de concessão JSB2014012 de J.V.).

1. coleta de amostra
<ol><li>Compra de diferentes cultivares de fresco rabanete (Raphanus sativus L.).</li>
</ol>2. isolamento da proteína de rabanete
<ol><li>Homogeneizar a cerca de 100 g de rabanete fresco com um misturador de cozinha para 10 min.</li>
	<li>Transferi o chorume para um tubo de centrífuga de 50 mL e centrifugação a 14.000 × g a 4 ° C por 20 min remover o material insolúvel.</li>
	<li>Transferir o sobrenadante cuidadosamente para um novo tubo de centrifugação de 50 mL e adicionar um volume igual de solução de ácido tricloroacético (TCA) de 2m. Nota: Adicionar TCA irá precipitar proteínas solúveis (glicogénio).</li>
	<li>Centrifugar a 14.000 × g a 4 ° C por 30 min e retirar o sobrenadante as proteínas peletizadas (glicogénio).</li>
	<li>Lave a pelota com 20 mL de água desionizada e centrifugação a 14.000 × g a 4 ° C por 5 min remover polissacarídeos e oligossacarídeos solúveis.</li>
	<li>Repita a etapa 2.5. quatro vezes.</li>
	<li>Re-suspenda as pelotas em 1 mL de água desionizada e transferir para um tubo de centrífuga de 1,5 mL.</li>
</ol>3. preparação da N- os glicanos
<ol><li>Mix 50 µ l da solução da proteína da etapa 2.7. (igual a 5 g de rabanete fresco) com 0,2 mU de recombinantes PNGase H+ no ácido acético de 10 mM.</li>
	<li>Incube a mistura a 37 ° C por 12 h. Após a incubação, centrifugar a 14.000 × g por 5 min remover a proteína extra e a enzima.</li>
	<li>Transferi o sobrenadante para um tubo de centrífuga de 1,5 mL.</li>
</ol>4. purificação de N- os glicanos
<ol><li>Preparar a coluna de extração de fase sólida (SPE) para enriquecer os N- glicanos e remover os sais e outras impurezas da mistura da reação, aumentando a seletividade do fluorogenic 2-aminobenzamide (2-AB) rotulagem agente para N- glicano derivatização.<ol>
<li>Adicione 3 mL de água desionizada para lavar a coluna.</li>
		<li>Adicione 3 mL de solução de acetonitrila 80% contendo ácido trifluoroacético (TFA, 0,1% v/v) para o ativo a SPE-coluna.</li>
		<li>Adicione 3 mL de água desionizada para equilibrar a coluna da SPE.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transferir a amostra da etapa 3.3 na coluna e descartar o escoamento.</li>
	<li>Adicione 1,5 mL de água desionizada para lavar a coluna e descartar o escoamento.</li>
	<li>Eluir os lançado N- os glicanos da coluna usando 1,5 mL de solução aquosa de 20% acetonitrila, contendo 0,1% TFA (v/v) em um tubo de centrífuga de 2 mL.</li>
	<li>Remova o solvente por evaporação centrífuga à temperatura ambiente. Evapore até que a amostra esteja completamente seca.</li>
</ol>5. fluorescência derivatização de N- os glicanos
<ol><li>Prepare-se 1 mL de solução 2-AB, consistindo de 35 mM 2-AB e 0,1 M cyanoborohydride de sódio em solução de ácido acético/sulfóxido de dimetilo (7:3, v/v).</li>
	<li>Adicione 5 µ l de solução 2-AB, para as amostras secas (etapa 4.5.) derivada de seis diferentes rabanetes. Vórtice de cada amostra até completamente dissolvida.</li>
	<li>Incubar a mistura durante 2 h a 65 ° C.</li>
	<li>Deixe a amostra esfriar até à temperatura por 5 min e adicione 5 µ l de água deionizada e 40 µ l de acetonitrilo. Centrifuga os tubos a 14.000 x g, durante 3 min.</li>
	<li>Transferi 48 µ l do sobrenadante para um tubo HPLC de alta recuperação de µ l 300. Armazene as pyrazole N- glicano amostras a-20 º C por até um mês.</li>
</ol>6. UPLC-uma caracterização das N- os glicanos
<ol><li>Analise as amostras usando um sistema UPLC padrão conectado a um detectorset de fluorescência on-line em comprimentos de onda de excitação/emissão de 330 nm/420 nm, respectivamente.</li>
	<li>Use uma cromatografia líquida de interação hidrofóbica (uma)-coluna de glicano UPLC à temperatura de 60 ° C, para a análise de coluna.</li>
	<li>Preparar o solvente A diluir 50 mL da solução (solução de formiato de amônio 1 M, pH 4,5) com 950 mL de líquido cromatografia / espectrometria de massa (LCMS)-grau de água. Prepare a solução-mãe da seguinte maneira:<ol>
<li>Adicionar 43 mL de ácido fórmico a 700 mL de LCMS-classe H2O.</li>
		<li>Ajuste o pH para 4,5 por adição gota a gota de solução aquosa de amoníaco (25% w/w).</li>
		<li>Transferir o solvente para uma proveta graduada e encher a 1000 mL com LCMS-classe H2O. loja a 4-6 ° C por até 3 meses.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Usar o LCMS-grau acetonitrilo como solvente B.</li>
	<li>Separe os N- glicanos com a seguinte gradiente eluição:<ol>
<li>Comece adicionando 95% do solvente B em solvente r. conjunto a taxa de fluxo em 0,5 mL/min de 0 para min 44,5.</li>
		<li>De min 0 a 6 min, gradualmente diminua a proporção do solvente B com um % to78 gradiente linear.</li>
		<li>De 6 min a min 44,5, gradualmente diminua a proporção do solvente B com um gradiente linear para 55,9%.</li>
		<li>De 44,5 min a min 46,5, rapidamente diminuir a proporção do solvente B com um gradiente linear de 55,9% para 0% e segurar a 0% por 2 min e iniciar a lavagem da coluna. Reduza a taxa de fluxo para 0,25 mL/min de 44,5 a 55 min.</li>
		<li>Lavar a coluna ainda mais aumentando o solvente B a 95% de 48,5 min a min 50,5 e segurar a 95% para 4,5 min.</li>
		<li>Re-equilibrar a coluna para as condições de partida de 95% solvente B em 0,5 mL/min de 50,5 para 57 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Injecte 45 µ l da amostra no sistema UPLC.</li>
	<li>Eluir os N- os glicanos por UPLC com tempos de retenção entre 15 e 40 min.</li>
	<li>Recolher a cada fração de pico UPLC observada usando tubos de centrífuga de 2ml e secar as amostras por evaporação centrífuga.</li>
	<li>Injete aproximadamente 1 pmol de 2-AB rotulado dextrano padrão (2−20 unidades de glicose) para calibrar a planta -N- glicano perfis e atribuir seus tempos de eluição em unidades de glicose padronizada.</li>
</ol>7. MALDI-TOF MS Analysis
<ol><li>Dissolver as amostras da etapa 6,8 em 5 µ l de LCMS-grau de água. Misturar 1 µ l da solução da amostra e 1 µ l de solução (ATT) (0,3% p/v em acetonitrila aquosa 70% v/v) 6-aza-2-thiothymine e a pipeta a mistura sobre o transportador de amostra de MALDI-TOF.</li>
	<li>Analise as amostras usando um instrumento de espectrômetro de massa MALDI-TOF em íon positivo modo pressionando o botão Iniciar .</li>
	<li>Analise os espectros de massa usando o software de análise que acompanha MALDI-TOF-MS.</li>
	<li>Interprete os espectros usando uma fonte aberta glicano interpretação software19. Definir os parâmetros de pesquisa para 2-AB etiquetando, [Na + M]+e definir o parâmetro de precisão Da 2.0.</li>
</ol>

<ol><li>Altmann, F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17033195">The Role of Protein Glycosylation in Allergy.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 142 (2), 99-115 (2007).</li>
<li>Van Ree, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2+%281%2C+2%29-xylose+and+%CE%B1+%281%2C+3%29-fucose+residues+have+a+strong+contribution+in+IgE+binding+to+plant+glycoallergens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">β (1, 2)-xylose and α (1, 3)-fucose residues have a strong contribution in IgE binding to plant glycoallergens.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (15), 11451-11458 (2000).</li>
<li>Biswas, H., Chattopadhyaya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+Curcuma+longa+rhizome+lectin%3A+Role+of+N-linked+glycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Stability of Curcuma longa rhizome lectin: Role of N-linked glycosylation.</a> Glycobiology. 26 (4), 410-426 (2016).</li>
<li>Lefebvre, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+N-glycosylation+sites+and+CXC+motifs+in+trafficking+of+Medicago+truncatula+Nod+factor+perception+protein+to+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Role of N-glycosylation sites and CXC motifs in trafficking of Medicago truncatula Nod factor perception protein to plasma membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (14), 10812-10823 (2012).</li>
<li>Severino, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+glycan+moiety+on+the+structure-function+relationships+of+PD-L1%2C+type+1+ribosome-inactivating+protein+from+P.+dioica+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+BioSystems%22%5BJournal%5D)">The role of the glycan moiety on the structure-function relationships of PD-L1, type 1 ribosome-inactivating protein from P. dioica leaves.</a> Molecular BioSystems. 6 (3), 570-579 (2010).</li>
<li>Lige, B., Ma, S., Van Huystee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+the+site-directed+removal+of+N-glycosylation+from+cationic+peanut+peroxidase+on+its+function%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">The effects of the site-directed removal of N-glycosylation from cationic peanut peroxidase on its function.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 386 (1), 17-24 (2001).</li>
<li>Ceriotti, A., Duranti, M., Bollini, R. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/jxb/article/49/324/1091/481062">Effects of N-glycosylation on the folding and structure of plant proteins.</a> Journal of Experimental Botany. 49 (324), 1091-1103 (1998).</li>
<li>Kamerling, J. P., Gerwig, G. J. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/46698050_Strategies_for_the_Structural_Analysis_of_Carbohydrates">Strategies for the Structural Analysis of Carbohydrates.</a> Comprehensive Glycoscience. , 1-68 (2007).</li>
<li>Huang, Y., Mechref, Y., Novotny, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+nonreductive+release+of+O-linked+glycans+for+subsequent+analysis+through+MALDI+mass+spectrometry+and+capillary+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Microscale nonreductive release of O-linked glycans for subsequent analysis through MALDI mass spectrometry and capillary electrophoresis.</a> Analytical Chemistry. 73 (24), 6063-6069 (2001).</li>
<li>Triguero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+enzymatic+N-glycan+release+comparison+for+N-glycan+profiling+of+monoclonal+antibodies+expressed+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Chemical and enzymatic N-glycan release comparison for N-glycan profiling of monoclonal antibodies expressed in plants.</a> Analytical Biochemistry. 400 (2), 173-183 (2010).</li>
<li>Tretter, V., Altmann, F., Marz, L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1868849">Peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase F cannot release glycans with fucose attached α1 → 3 to the asparagine-linked N-acetylglucosamine residue.</a> European Journal of Biochemistry. 199 (3), 647-652 (1991).</li>
<li>Fan, J. -Q., Lee, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+studies+on+substrate+structure+requirements+of+glycoamidases+A+and+F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Detailed studies on substrate structure requirements of glycoamidases A and F.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 27058-27064 (1997).</li>
<li>Altmann, F., Paschinger, K., Dalik, T., Vorauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+peptide-N4-%28N-acetyl-%CE%B2-glucosaminyl%29asparagine+amidase+A+and+its+N-glycans%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterisation of peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase A and its N-glycans.</a> European Journal of Biochemistry. 252 (1), 118-123 (1998).</li>
<li>Altmann, F., Schweiszer, S., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+comparison+of+peptide%3A+N-glycosidases+F+and+A+reveals+several+differences+in+substrate+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate+Journal%22%5BJournal%5D)">Kinetic comparison of peptide: N-glycosidases F and A reveals several differences in substrate specificity.</a> Glycoconjugate Journal. 12 (1), 84-93 (1995).</li>
<li>Wang, T., Voglmeir, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PNGases+as+valuable+tools+in+glycoprotein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+and+Peptide+Letters%22%5BJournal%5D)">PNGases as valuable tools in glycoprotein analysis.</a> Protein and Peptide Letters. 21 (10), 976-985 (2014).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+characterization+of+a+novel+extremely+acidic+bacterial+N-glycanase+with+combined+advantages+of+PNGase+F+and+A%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Reports%22%5BJournal%5D)">Discovery and characterization of a novel extremely acidic bacterial N-glycanase with combined advantages of PNGase F and A.</a> Bioscience Reports. 34 (6), 00149(2014).</li>
<li>Du, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+sample+preparation+methodology+for+plant+N-.glycan+analysis+using+acid-stable+PNGase+H%2B%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid sample preparation methodology for plant N-.glycan analysis using acid-stable PNGase H+.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (48), 10550-10555 (2015).</li>
<li>Wang, T., Hu, X. -C., Cai, Z. -P., Voglmeir, J., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualitative+and+Quantitative+Analysis+of+Carbohydrate+Modification+on+Glycoproteins+from+seeds+of+Ginkgo+biloba%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Qualitative and Quantitative Analysis of Carbohydrate Modification on Glycoproteins from seeds of Ginkgo biloba.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (35), 7669-7679 (2017).</li>
<li>Ceroni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GlycoWorkbench%3A+a+tool+for+the+computer-assisted+annotation+of+mass+spectra+of+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">GlycoWorkbench: a tool for the computer-assisted annotation of mass spectra of glycans.</a> Journal of Proteome Research. 7 (4), 1650-1659 (2008).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Apresentamos aqui o protocolo permite a comparação dos perfis de vários cultivares de rabanete - glicano N. Uma vantagem significativa do método comparado com protocolos existentes é que nenhuma alteração de tampão entre a liberação enzimática de N- os glicanos e a reação de derivatização com 2-AB é necessárias. O passo mais crítico deste procedimento é a purificação do N- os glicanos usando a coluna SPE, como falha para remover os sais ou outras impurezas na mistura de reação podem afetar nega...

Os N- glicanos em plantas têm chamado a atenção crescente nos últimos anos, como pesquisas anteriores destacou os N- glicanos como uma fonte potencial de reacções imunológicas que podem provocar respostas alérgicas1,2 . Foi demonstrado anteriormente que os N- glicanos em glicoproteínas de planta pode afetar a atividade catalítica de3,4, estabilidade térmica e dobramento5,6 ou Localização subcellular e secreção7. A fim de correlacionar as estruturas glicano com suas respectivas funções, os N- glicanos deve ser lançados de glicoproteínas ou quimicamente ou enzimaticamente. O método químico clássico para liberar N- e O- os glicanos é β-eliminação, em que o tratamento alcalino amostra é acompanhado por redução com borohidreto para produzir um alditol8. No entanto, este procedimento impede a rotulagem com um fluoróforo e causa deterioração significativa de unidades de monossacarídeo do redutor final da estrutura de glicano. Deglycosylation química, com base no tratamento de hidróxido de amônio/carbonato é também um método alternativo comumente usado9. Nenhum desses métodos de liberação química degrada proteínas intactas, que permite a análise de espectrometria de massa de glicano sem rótulo piscinas sem a interferência de fragmentos de peptídeo na mesma faixa de massa. No entanto, um inconveniente desses métodos é a taxa de aumento da degradação de α1, 3-fucosilado N- os glicanos, uma estrutura comum de carboidrato encontrado em plantas,10. Como alternativa, os métodos de liberação enzimática usando peptídeo:N- glycanases (PNGases, CE 3.5.1.52) são também amplamente aplicados. Recombinante PNGase F (de Flavobacterium meningosepticum) é a escolha mais comum e permite a libertação de todos os tipos de N- os glicanos, exceto as estruturas portadoras de um núcleo α1, fucose 311,12. Portanto, A PNGase (isoladas de sementes amêndoas) geralmente é usada para a análise da planta Nos glicanos -13. No entanto, esta enzima deglycosylates apenas proteoliticamente-derivado glicopeptídeos e é incapaz de deglycosylate nativo glicoproteínas14. Portanto, um exame de amostra de várias etapas é necessário antes de mais análise, que provoca a perda extensa dos glicanos, especialmente aqueles de baixa abundância15. O objetivo geral do método é apresentar um fluxo de trabalho otimizado para N- glicano liberação e rotulagem de forma simples e robusta de fluorescência. A lógica subjacente é que o PNGase H+, que recentemente foi descoberto em Terriglobus roseus e pode ser expressa de recombinantes em e. coli, pode hidrolisar os N- glicanos diretamente do andaime proteína em ácido condições de16. A principal vantagem de usar PNGase H+ sobre métodos alternativos é que reações de rotulagem fluorescentes podem ser executadas em tubo de reação mesmo sem alterar a reação amortecedores17,18. As condições de preparação simples e alta recuperação de oligossacarídeos de baixo-abundância fazem esse método uma ferramenta valiosa na análise do N- os glicanos. Este protocolo é apropriado para a análise de N- os glicanos de várias espécies de plantas.

<table><tbody><tr><td><forte>Produtos Químicos:</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido tricloroacético&nbsp;</td><td>SCR, Xangai</td><td>80132618</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Huada, Guangzhou</td><td>64-19-7</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrila</td><td>Reagente geral</td><td>G80988C</td><td></td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético</td><td>Energia química</td><td>W810031</td><td></td></tr><tr><td>2-aminobenzamida</td><td>Heowns, Tianjin</td><td>A41900</td><td></td></tr><tr><td>Cianoborohidreto de sódio</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>314162</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido Huada</td><td>, Guangzhou</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>Escada de dextrano marcada com 2AB, 200 pmol</td><td>Agilent Technologies</td><td>AT-5190-6998</td><td></td></tr><tr><td>6-Aza-2-tiotimina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>275514</td><td></td></tr><tr><td>Ferramentas/Materiais:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kitchen blender</td><td>Bear, Guangzhou</td><td>LLJ-A10T1</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Techcomp</td><td>CT15RT</td><td></td></tr><tr><td>Evaporador Centrífugo</td><td>Hualida, Taicang</td><td>LNG-T120</td><td></td></tr><tr><td>Coluna SPE</td><td>Supelco</td><td>Supelclean ENVI Carb Coluna SPE</td><td></td></tr><tr><td>Espectrômetro de massa MALDI-TOF</td><td>Bruker</td><td>Autoflex</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Analysis:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>High-recovery HPLC vial</td><td>Agilent Technologies</td><td>&nbsp;# 5188-2788</td><td></td></tr><tr><td>Sistema HPLC</td><td>Shimadzu</td><td>Nexera</td><td></td></tr><tr><td>Detector de Fluorescência para HPLC</td><td>Shimadzu</td><td>RF-20Axs&nbsp;</td><td></td></tr> Coluna de glicano Acquity UPLC BEH da HPLC de <tr><td>Hengxin</td><td>CO-2000</td><td></td>do <td>forno de coluna</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>2,1 &times; 150 milímetros, 1,7 &mu; m tamanho de partícula</td></tr><tr><td>LCMS-grade Água</td><td>Merck Millipore</td><td>#WX00011</td><td></td></tr><tr><td>LCMS-grade Acetonitrila</td><td>Merck Millipore</td><td># 100029</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Aladdin</td><td>F112034</td><td></td></tr><tr><td>Solução de amônia</td><td>Aladdin</td><td>A112080</td><td></td></tr></tbody></table>

análise dos n- glicanos de raphanus sativus cultivares usando pngase h+

Analysis of N-glycans from Raphanus sativus Cultivars Using PNGase H+

Nos últimos anos, as metades de hidrato de carbono de plantas têm recebido atenção considerável, como eles são uma fonte potencial de cross-reactive, alergia, provocando reacções imunológicas. Além disso, estruturas de carboidratos também desempenham um papel fundamental no metabolismo da planta. Aqui, apresentamos um método simples e rápido para preparar e analisar N- os glicanos de diferentes cultivares de rabanete (Raphanus sativus) usando um N- glycanase específico para o lançamento de estruturas de carboidratos de origem vegetal. Para conseguir isso, cru ácido tricloroacético precipitados de rabanete homogenates foram tratados com PNGase H+e rotulados usando 2-aminobenzamide como uma etiqueta fluorescente. N- glicano amostras etiquetadas foram analisadas posteriormente pela separação de ultra desempenho cromatografia líquida (UPLC) e laser assistida por matriz dessorção ionização tempo de voo (MALDI-TOF) espectrometria de massa para uma detalhada estrutural avaliação e a quantificação relativas abundancies das estruturas rabanete-derivados N- glicano. Este protocolo também pode ser usado para a análise de N- os glicanos de várias outras espécies de plantas e pode ser útil para posterior investigação da função e efeitos da N- os glicanos na saúde humana.

A Figura 1 mostra uma visão esquemática do protocolo descrito, incluindo o isolamento de proteínas (Glico-) de rabanete, a preparação de N- os glicanos, a análise UPLC e a análise de MALDI-TOF-MS desses componentes. A Figura 2 mostra representativas cromatogramas UPLC do pyrazole N- os glicanos dos cultivars rabanete analisados. A Figura 3 mostra os resultados obtidos das estruturas...

Nós descrevemos um método simples e rápido para a preparação e análise de N- os glicanos de diferentes cultivares de rabanete (Raphanus sativus).

Análise dos N- glicanos de Raphanus sativus cultivares usando PNGase H+

In recent years, the carbohydrate moieties of plants have received considerable attention, as they are a potential source of cross-reactive, ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas no campo da glicociência vegetal, como a forma como os N-glicanos de origem vegetal podem ser rapidamente analisados e caracterizados. A principal vantagem desta técnica é que ela não requer nenhuma troca de tampão entre a liberação enzimática de N-glicanos e as reações de derivatização com 2-aminobenzamida. Demonstrando o procedimento estarão a senhorita Ya-Min Du e a senhorita Shen-Li Zhen; dois alunos de pós-graduação do Centro de Pesquisa em Bioengenharia de Glicômica e Glicano da Universidade Agrícola de Nanjing.Para começar a isolar as proteínas, use um liquidificador de cozinha para homogeneizar aproximadamente 100 gramas de rabanete fresco por dez minutos. Transfira a pasta resultante para um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Centrifugue a 14.000 vezes a gravidade a quatro graus Celsius por 20 minutos para remover o material insolúvel.Depois disso, transfira cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo de centrífuga de 50 mililitros. Adicione uma quantidade igual de uma solução de ácido tricloroacético de dois molares. Centrifugue a 14.000 vezes a gravidade a quatro graus Celsius por 30 minutos.E então remova o sobrenada

analysis-of-n-glycans-from-raphanus-sativus-cultivars-using-pngase-h

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Nós descrevemos um método para análise da alteração da N-glicanos ligados através do início da vida de glicoproteínas após a sua biossíntese em células de mamíferos. Isto é conseguido através de pulso-chase análise de glicanos metabolicamente marcados, a liberação enzimática das glicoproteínas e análise por HPLC.

Pulso-chase Análise de Cadeias N-linked Açúcar de Glicoproteínas em células de mamíferos

Uma maneira rápida é descrito para obter insights sobre a estrutura de polissacarídeos em uma matriz extracelular. O método aproveita a especificidade do glycosylhydrolases ea sensibilidade da espectrometria de massa permitindo que pequenas quantidades de materiais a serem analisados. Esta técnica é adaptável para ser usada diretamente sobre o tecido em si.

Oligo Profiling Massa (OLIMP) de polissacarídeos extracelulares

Usando glicosidases específicas para remover a partir de açúcares glicoproteínas seguido por SDS-PAGE é um método valioso para detectar modificações glicano em amostras de proteína e é uma boa escolha para estudos glycobiology inicial. Seguintes alterações deglycosylation podem ser detectados como mudanças na mobilidade gel ou através da coloração com glicano reagentes sensíveis.

Identificação e caracterização de glicosilação de proteínas específicas usando endo-e exoglycosidases

Profiling glicana de Polímeros da planta da parede celular usando Microarrays

Um protocolo de alto rendimento foi desenvolvido para purificação combinada de proteômica e glicômica e quantificação de LC-MS/MS no plasma. A análise de desamidação de motivos de glicosilação ligados a N foi específica para locais desglicosilados. A quantificação precisa de N-glicanos foi alcançada acoplando a separação de N-glicanos auxiliada por filtro à normalização da individualidade ao marcar com a estratégia de marcadores de hidrazida de glicano.

A Quantitative Glycomics e Proteomics Combinada estratégia de purificação

Este artigo apresenta uma forma aprimorada de uma nova técnica de glicômica de baixo para cima projetada para analisar o perfil de composição agrupado de glicanos em biofluidos não fracionados por meio da decomposição química de glicanos em seus monossacarídeos específicos de ligação constituinte para detecção por GC-MS. As aplicações potenciais incluem a detecção precoce de câncer e outros distúrbios afetivos glicanos.

Glicanos Análise Node: uma abordagem de baixo para cima para Glycomics

Um protocolo para a análise estrutural de polissacarídeos por eletroforese em gel (PACE), usando Medeiros como um exemplo, é descrito.

Caracterização estrutural de polissacarídeos de parede celular Medeiros em plantas usando a ritmo

A imunoglobulina G (IgG) N-glicano é caracterizada por meio de cromatografia de interação hidrofílica UPLC. Além disso, a estrutura do IgG N-glican é claramente separada. Apresentado aqui é uma introdução a este método experimental para que ele possa ser amplamente utilizado em ambientes de pesquisa.

Análise de imunoglobulina G N-Glycan por cromatografia líquida de ultra-desempenho

Microarray polymer profiling (MAPP) é uma técnica de alto rendimento para análise composicional de glicanos em amostras biológicas.

Perfil de polímero de microarray (MAPP) para análise de glicanos de alto rendimento

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para a liberação de O-glicanos das mucinas e a subsequente dessalinização, permetilação e análise usando espectrometria de massa MALDI-TOF.

Perfil de O-glicanos de mucina permetilada usando espectrometria de massa de tempo de voo de dessorção/ionização a laser assistida por matriz

Aprenda a preparar e analisar N-glicanos de cultivares de rabanete (Raphanus sativus) usando PNGase H⁺ sem trocas de tampão. Este método simplificado acelera a caracterização de glicanos em glicociência vegetal.

Análise dos N- glicanos de Raphanus sativus cultivares usando PNGase H⁺

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