Forçado a salivação como um método para analisar a competência vetorial de mosquitos
7 de agosto de 2018
Controlo eficaz de transmissão do vírus a cargo de mosquito, o conhecimento do potencial vetor de respectivos mosquitos é de particular interesse. Descrevemos a salivação forçada como um método para analisar a competência vetorial do Aedes albopictus e três táxons de Culex diferentes para a transmissão de vírus Zika.
Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo de doenças transmitidas por mosquitos, como se uma espécie de mosquito é ou não um vetor competente para um determinado vírus. A principal vantagem desse método é que uma grande quantidade de mosquitos pode ser analisada simultaneamente, sem o uso de animais de laboratório como camundongos. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque ele precisa de habilidades motoras finas que só podem ser adquiridas com a prática.
A demonstração visual dessa técnica é crítica, pois as etapas principais são difíceis de aprender; Eles exigem experiência no manuseio de mosquitos e vírus, e também habilidades motoras finas. Para começar, dilua o estoque de vírus. Em seguida, misture sangue humano vencido com frutose, soro bovino filtrado e o estoque de vírus.
Congele 140 microlitros de mistura de farinha de sangue para análise posterior via TCID50. Em seguida, coloque duas gotículas de 50 microlitros da mistura de farinha de sangue em um frasco de plástico e deixe os mosquitos se alimentarem por duas horas. Depois de anestesiar os mosquitos, conte os indivíduos totalmente ingurgitados e transfira-os para um novo frasco contendo um algodão embebido em frutose.
Em seguida, mantenha os mosquitos a 27 graus Celsius e 80% de umidade por 14 ou 21 dias. Reabasteça as almofadas de algodão saturadas com frutose a cada 72 horas com 1,5 mililitros de frutose. Primeiro, semeie 20.000 células Vero por poço em uma placa de 96 poços com meio de crescimento suplementado.
Para preparar o dispositivo de salivação, coloque uma placa de vidro quadrada na bancada em um ângulo de 30 graus. Em seguida, cole fita dupla-face na parte superior da placa de vidro. Em seguida, enrole a massa de modelar até que tenha 0,5 centímetros de diâmetro e prenda-a na placa horizontalmente a um centímetro de distância da fita dupla-face.
Corte as pontas do número necessário de pontas de filtro de 10 microlitros e encha cada ponta com 10 microlitros de PBS. Em seguida, coloque as pontas na massa de modelar e prenda-as com uma leve pressão. Em seguida, imobilize os mosquitos removendo suas pernas e asas.
Fixe os mosquitos na fita acima das pontas do filtro. Coloque delicadamente a tromba de cada mosquito em uma ponta de filtro. Após 30 minutos, remova as pontas do filtro e descarte a argila e a fita.
Transfira a saliva coletada para tubos de reação contendo 10 microlitros de PBS. Misture a saliva e o PBS delicadamente e transfira a mistura para os poços de uma placa de 96 poços. Incube a placa por sete dias a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.
Usando um microscópio de luz, verifique as células quanto à presença de efeito citopático. Uma vez que um poço seja positivo para efeito citopático, use uma pipeta para colher 140 microlitros do sobrenadante. Em seguida, transfira o sobrenadante para um tubo de reação.
Em seguida, misture 140 microlitros do sobrenadante com 560 microlitros de tampão AVL e incube por 10 minutos em temperatura ambiente. Por fim, adicione 560 microlitros de etanol e inverta a amostra para misturar. Usando este protocolo, várias espécies de mosquitos foram testadas para infecção e transmissão do vírus Zika sob várias condições climáticas.
Sob condições de incubação de 27 graus Celsius, todas as espécies de Aedes exibiram saliva positiva para o vírus Zika. Por outro lado, nenhuma das amostras de saliva dos táxons de Culex continha evidências do vírus. Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada para 50 mosquitos em uma hora, se executada corretamente.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar experimentos de salivação forçada. Não se esqueça de que trabalhar com mosquitos infectados pode ser muito perigoso, portanto, medidas especiais de segurança para o manuseio de mosquitos sob as condições BSA-3 devem sempre ser tomadas durante a realização de qualquer experimento.
Visão geral
Este artigo discute um método para analisar a competência vetorial de mosquitos, especificamente Aedes albopictus e vários taxa de Culex, para a transmissão do vírus Zika. A técnica de salivação forçada permite a análise simultânea de múltiplos mosquitos sem o uso de animais de laboratório.
Componentes principais do estudo
Área da ciência
- Biologia de vetores
- Virologia
- Doenças transmitidas por mosquitos
Fundo
- Compreender a competência vetorial é crucial para o controle de vírus transmitidos por mosquitos.
- A salivação forçada é um método novo para avaliar o potencial de transmissão de mosquitos.
- Métodos anteriores frequentemente exigiam animais de laboratório, o que esta técnica visa eliminar.
- Habilidades motoras finas são essenciais para este método, necessitando prática e experiência.
Propósito do estudo
- Avaliar a competência vetorial de diferentes espécies de mosquitos para o vírus Zika.
- Demonstrar um método que permite a análise de alto rendimento da saliva de mosquitos.
- Fornecer um guia visual para pesquisadores novos na técnica.
Métodos utilizados
- Preparação de uma mistura de refeição sanguínea para alimentação de mosquitos.
- Técnica de salivação forçada para coletar saliva de mosquitos.
- Métodos de cultura celular para avaliar a presença do vírus Zika.
- Incubação e análise de amostras para efeitos citopatogênicos.
Principais resultados
- Espécies de Aedes mostraram saliva positiva para o vírus Zika sob condições controladas.
- Taxa de Culex não exibiram evidência de vírus Zika em sua saliva.
- O método permite testar até 50 mosquitos em uma hora após ser dominado.
- Demonstrações visuais auxiliam significativamente na aprendizagem da técnica.
Conclusões
- A salivação forçada é um método eficaz para estudar a transmissão de vírus transmitidos por mosquitos.
- Treinamento e prática são essenciais para a implementação bem-sucedida da técnica.
- Medidas de segurança devem ser seguidas ao lidar com mosquitos infectados.
Perguntas frequentes
Executive Industry Relevance
Forced salivation assays enable high-throughput evaluation of mosquito vector competence without animal models, supporting early-stage target validation in antiviral discovery. The method provides quantitative, replication-competent virus detection from individual insects, informing go/no-go decisions for prophylactic or therapeutic candidates against arboviruses. Its scalability and reproducibility enhance predictive confidence in preclinical de-risking of transmission-blocking interventions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring virus transmission potential in individual disease vectors.
- Operational Value: Enables biological de-risking of targets through direct assessment of vector competence under controlled conditions.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying non-competent vector species, reducing false-positive leads in arbovirus programs.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream antiviral screening by confirming virus susceptibility in vector models.
- Operational Value: Standardizes saliva collection and virus detection, ensuring reproducible quantitative outputs across large mosquito cohorts.
- Scalability: Facilitates platform reuse for high-throughput evaluation of transmission-blocking compounds or vaccines.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by testing vector competence under epidemiologically relevant temperatures (18–27°C).
- Operational Value: Ensures continuity from discovery to preclinical validation via consistent saliva-based virus readouts.
- Risk Mitigation: Informs advancement decisions by establishing temperature-dependent transmission thresholds for lead candidates.
Pipeline & Workflow Integration
The forced salivation method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, particularly for arbovirus-directed interventions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying virus presence in mosquito saliva as a functional readout of transmission potential.
- Screening: Delivers assay readiness and reproducibility through standardized saliva collection and TCID50-equivalent virus detection in Vero cells.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements (viral titer in saliva) enabling comparison across species, strains, and environmental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via temperature-stratified transmission data that mirrors field-relevant transmission windows.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for screening multiple arboviruses (e.g., ZIKV, DENV, CHIKV) across vector species without reoptimization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in transmission biology.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability across entomology and virology teams.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in antiviral programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on empirical vector competence data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mosquito handling, virology, and microsurgical techniques under BSL-3 containment.
- Dependent on specialized instrumentation including salivation devices, incubators with precise humidity control, and microscopy for cytopathic effect scoring.
- Necessitates cross-team standardization of bloodmeal preparation, incubation timelines, and saliva collection intervals.
- Adaptation considerations include species-specific proboscis size, feeding behavior, and salivary gland morphology across vector models.
- Practical limitations include the need for extensive training to achieve proficiency and the method’s dependence on viable virus recovery from saliva.
