Name: Forçado a salivação como um método para analisar a competência vetorial de mosquitos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: Aprenda a técnica de salivação forçada para analisar a competência vetorial de mosquitos Aedes albopictus e Culex para o vírus Zika. Este método permite testar até 50 mosquitos por hora sem uso de animais de laboratório.

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Agradecemos a Ella Weinert, Michelle Helms e Marlis Badusche para obter assistência técnica excelente, Jessica Börstler para análises de mosquitos Culex , Norbert Becker e Björn Pluskota para o fornecimento de ovos de Aedes albopictus e Olli Vapalahti para fornecendo o estoque de vírus. ML foi apoiada pela Associação de Leibniz; conceda número Serra-2014-SGN-3.

1. prepare mosquitos fêmeas
<ol><li>Recolha os mosquitos de uma gaiola grande, usando um aspirador (aproximadamente 400 mosquitos por gaiola grande).</li>
	<li>Anestesiar os mosquitos com dióxido de carbono (CO2) para 7 s.</li>
	<li>Classificar 20 fêmeas por frasco plástico (Ø 50 mm × 100 mm). Nota: Se os mosquitos acordar, use outro 3 s de CO2.
</li>
	<li>Morrer de fome os mosquitos durante a noite.</li>
</ol>2. farinha de sangue artificial
Nota: Todas as etapas são realizadas sob condições de BSL-3.
<ol><li>
Prepare a refeição de sangue infecciosa.
	<ol>
<li>Diluir o estoque de vírus na concentração de 1 x 108 placa formando unidades (PFU) / mL. Nota: A concentração das ações foi determinada através da realização de cultura de tecidos método de dose 50 infecção (TCID50) e calculada pelo Spearman & Karber algoritmo10,11.</li>
		<li>Mix expirou sangue humano (preservação de sangue) no banco de sangue (não é adequado para humano, mas é útil para mosquitos) com frutose (8% solução), filtrado de soro bovino (FBS) e solução de trabalho do estoque de vírus (expirou sangue humano: frutose: FBS: solução de trabalho = 5:3:1:1). Nota: Nós escolhemos sangue humano, porque este é o host conhecido mamífero natural de ZIKV.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Congele a 140 µ l da mistura de farinha de sangue para posterior análise através de TCID50.</li>
	<li>
Realize alimentação artificial usando métodos de alimentação diferentes, dependendo da espécie:
	<ol>
<li>
Aedes aegypti: Use uma membrana que alimentam o sistema por 30 min (1 mL por alimentador).</li>
		<li>
Culex spp.: fornecem o sangue infeccioso através de um stick de algodão durante a noite e não aquecer o sangue (300 µ l por frasco).</li>
		<li>
Aedes albopictus: Coloque duas gotas (50 µ l cada) da mistura de farinha de sangue num frasco de plástico e deixe os mosquitos alimentar por 2 h. Não aquecer o sangue. Nota: Os mosquitos irão alimentar nos primeiro 15 min. O tempo de incubação prolongada é necessário devido a razões de segurança. As gotas de sangue são drenadas depois alimentado de 2 h, que assim, reduzir o risco de contaminação durante a triagem dos mosquitos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Anestesiar os mosquitos com CO2 para 7 s. Nota: Se os mosquitos acordar, use outro 3 s de CO2.</li>
	<li>Classificação e contagem totalmente ingurgitadas mosquitos dentro de um frasco de novo.</li>
	<li>Adicione uma almofada de algodão, saturada com frutose (8% solução) entre o frasco e um plug.</li>
	<li>Mantém os mosquitos à temperatura designada de 18 ° C ou a 27 ° C, na umidade de 80% para 14 ou 21 dias.</li>
	<li>Alimente os mosquitos com almofadas de algodão saturado de frutose. Reabastecer a cada 72 h com 1,5 mL de frutose (8% solução) por frasco (até 20 mosquitos, dependendo a alimentação taxa, consulte a etapa 2.5).</li>
</ol>3. forçado a salivação ensaio no dia 14 ou 21
Nota: Todas as etapas são realizadas sob condições de BSL-3.
<ol><li>2 x 104 células de Vero de semente / por bem em um 96 bem placa com 200 µ l de meio de crescimento (modificado de Dulbecco´s eagle suplementado (DMEM) com 3% FBS, 100 U/mL penicilina, estreptomicina 100 mg/mL, 5 µ g/mL, anfotericina B, 2 mM L-glutamina 1% não aminoácidos essenciais (timina), piruvato de sódio 1%).</li>
	<li>
Prepare o dispositivo salivação:
	<ol>
<li>Coloque uma placa de vidro quadrada (20 × 20 cm) no banco em um ângulo de 30°. Nota: Isto é necessário devido a sub-pressão no laboratório de segurança. Se a placa for horizontal ou vertical, o líquido irá vazar.</li>
		<li>Coloque a fita de adesivo dupla face em cima da placa de vidro.</li>
		<li>Papel a argila de modelagem até que ela atinge um diâmetro de 0,5 cm e anexá-lo horizontalmente 1 cm a fita adesiva de dupla face.</li>
		<li>Corte o primeiro 0,3 cm da ponta de uma ponta do filtro de 10 µ l. Nota: É aconselhável preparar isto antes de iniciar o experimento fora do laboratório de biossegurança.</li>
		<li>Encha as filtro dicas com 10 µ l de soro de tampão fosfato (PBS, pH 7,4).</li>
		<li>Coloque as pontas de filtro sobre a argila de modelagem com a ponta em direção a fita-cola.</li>
		<li>Segura as pontas do filtro com uma pressão suave.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Prepare os mosquitos:
	<ol>
<li>Anestesia os mosquitos com CO2.</li>
		<li>Retire as pernas e as asas para imobilizar os mosquitos.</li>
		<li>Corrigi o mosquito vivos corpos sobre a fita-cola acima uma ponta do filtro.</li>
		<li>Coloque o narigudo suavemente a ponta do filtro.</li>
		<li>Execute o ensaio de salivação durante 30 min.</li>
		<li>Retire as pontas do filtro e descarte o barro e a fita.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. processamento de Saliva
Nota: Etapas 4.1 – 4.6.2 são executadas sob condições de BSL-3.
<ol><li>Expulse o conteúdo para os tubos de reação contendo 10 µ l de PBS.</li>
	<li>Misture delicadamente e transfira o conteúdo para os poços da placa 96 bem preparado usando um bem por amostra.</li>
	<li>Incube a placa por 7 dias a 37 ° C com 5% de CO2.</li>
	<li>Use o binóculo para marcar as células para a presença de efeito citopático (ECP).</li>
	<li>Se o poço é positivo para o CPE, recolher o sobrenadante por pipetagem µ l 140 em um tubo de reação para a extração de RNA.</li>
	<li>
Purifica o RNA usando um kit de extração de RNA.
	<ol>
<li>Mix 140 µ l do sobrenadante com 560 µ l de AVL buffer (tampão de Lise viral) e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente.</li>
		<li>Adicione 560 µ l de etanol (96%) e a amostra de vórtice. Nota: As amostras são inactivadas após esta etapa e podem ser descarregadas fora do laboratório BSL-3.</li>
		<li>Pipeta 630 µ l da amostra em uma coluna e centrífuga com 6.000 x g por 1 min.</li>
		<li>Descartar o filtrado, pipetar os restantes µ 630 l na coluna e repetir a centrifugação.</li>
		<li>Lave o RNA, vinculado à membrana da coluna, adicionando 500 µ l de tampão 1 para a coluna e o centrifugador de lavagem a 6.000 x g por 1 min.</li>
		<li>Descartar o tubo de coleta e colocar a coluna em um novo tubo de coleta. Adicione 500 µ l lavagem buffer 2 e centrifugar a 12.500 x g durante 3 min.</li>
		<li>Descartar o tubo de coleta e colocar a coluna em um tubo de reação de 1,5 mL.</li>
		<li>Adicionar 50 µ l de tampão de eluição e incubar durante 1 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Centrifugar a 6.000 x g por 1 min e em seguida, descartar a coluna.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analise as amostras para o RNA ZIKV via RT-qPCR.</li>
</ol>5. processamento de corpos de Mosquito
Nota: Etapas 5.1 – 5.5 são executadas sob condições de BSL-3.
<ol><li>Retire os corpos do mosquito e coloque cada corpo em um tubo de reação. Nota: É possível pausar o experimento neste ponto e armazenar as amostras a-80 ° C.</li>
	<li>Adicione 500 µ l de mídia de homogeneização (DMEM sem qualquer adendos) no tubo de reação.</li>
	<li>Homogeneizar o corpo usando batedeira motor e usar um pistilo novo para cada amostra.</li>
	<li>Adicione 200 µ l do homogeneizado em uma 96--placa para purificação. Nota: É possível pausar o experimento neste ponto e armazenar as amostras a-80 ° C.</li>
	<li>Desativar a placa de incubação para 60 min a 60 ° C.</li>
	<li>Purifica o RNA pela purificação automatizado do ácido nucleico. Nota: É possível pausar o experimento neste ponto e armazenar as amostras a-80 ° C.</li>
</ol>6. análise
<ol><li>Quantificar as cópias de RNA Viral usando RT-qPCR. Nota: As cópias de RNA foram em média sobre todos os corpos de mosquito ZIKV-positivo e sem incluir os mosquitos ZIKV negativo.</li>
	<li>Calcule o IR, definido como o número de corpos de mosquito ZIKV positivo por número de fêmeas alimentadas.</li>
	<li>Calcule a TR, definida como o número de mosquitos com saliva ZIKV positivo por número de corpos de mosquito ZIKV-positivo. A taxa de transmissão não pode ser calculada para combinações de temperatura-espécies com nenhum corpo de ZIKV-positivo.</li>
</ol>

<ol><li>Musso, D., Gubler, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Zika Virus.</a> Clinical Microbiology Reviews. (3), 487-524 (2016).</li>
<li>World Health Organization Regional Office for Europpe (WHO/Europe). No Title. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.euro.who.int/en/health-topics/emergencies/zika-virus/technical-reports-and-guidelines-on-zika-virus/zika-virus-technical-report.-interim-risk-assessment-for-who-european-region">http://www.euro.who.int/en/health-topics/emergencies/zika-virus/technical-reports-and-guidelines-on-zika-virus/zika-virus-technical-report.-interim-risk-assessment-for-who-european-region</a> (2016).</li>
<li>Epelboin, Y., Talaga, S., Epelboin, L., Dusfour, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus%3A+An+updated+review+of+competent+or+naturally+infected+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Zika virus: An updated review of competent or naturally infected mosquitoes.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 11 (11), e0005933(2017).</li>
<li>Aliota, M. T., Peinado, S. A., Osorio, J. E., Bartholomay, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culex+pipiens+and+Aedes+triseriatus+Mosquito+Susceptibility+to+Zika+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Culex pipiens and Aedes triseriatus Mosquito Susceptibility to Zika Virus.</a> Emerging Infectious Diseases. (10), 1857-1859 (2016).</li>
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<li>Cornel, A. J., Jupp, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+three+methods+for+determining+transmission+rates+in+vector+competence+studies+with+Culex+univittatus+and+West+Nile+and+Sindbis+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Mosquito+Control+Association%22%5BJournal%5D)">Comparison of three methods for determining transmission rates in vector competence studies with Culex univittatus and West Nile and Sindbis viruses.</a> Journal of the American Mosquito Control Association. 5 (1), 70-72 (1989).</li>
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<li>Anderson, S. L., Richards, S. L., Smartt, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+determining+arbovirus+transmission+in+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Mosquito+Control+Association%22%5BJournal%5D)">A simple method for determining arbovirus transmission in mosquitoes.</a> Journal of the American Mosquito Control Association. 26 (1), 108-111 (2010).</li>
<li>Heitmann, A., Jansen, S., Lühken, R., Leggewie, M., Badusche, M., Pluskota, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+transmission+of+Zika+virus+by+mosquitoes+from+central+Europe%5BTitle%5D)+AND+%22Eurovsurveillance%22%5BJournal%5D)">Experimental transmission of Zika virus by mosquitoes from central Europe.</a> Eurovsurveillance. 22 (2), (2017).</li>
<li>Hierholzer, J. C., Killington, R. A. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780124653306500038">Virus Isolation and Quantitation - Virology methods manual</a>. , (1996).</li>
<li>Horzinek, R. W., Marian, C. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/j.1439-0442.1985.tb01965.x">Kompendium der allgemeinen Virologie.</a> Zentralblatt für Veterinärmedizin R A. 32 (1-10), 480(2010).</li>
<li>Richard, V., Paoaafaite, T., Cao-Lormeau, V. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+Competence+of+French+Polynesian+Aedes+aegypti+and+Aedes+polynesiensis+for+Zika+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Vector Competence of French Polynesian Aedes aegypti and Aedes polynesiensis for Zika Virus.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (9), (2016).</li>
<li>Fortuna, C., Remoli, M. E., Di Luca, M., Severini, F., Toma, L., Benedetti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+studies+on+comparison+of+the+vector+competence+of+four+Italian+Culex+pipiens+populations+for+West+Nile+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">Experimental studies on comparison of the vector competence of four Italian Culex pipiens populations for West Nile virus.</a> Parasites & Vectors. 8, 463(2015).</li>
<li>Weger-Lucarelli, J., Rückert, C., Chotiwan, N., Nguyen, C., Garcia Luna, S. M., et al. Vector Competence of American Mosquitoes for Three Strains of Zika Virus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeger-Lucarelli%2C+J+%22PLOS+Neglected+Tropical+Diseases%22">PLOS Neglected Tropical Diseases</a>. Turell, M. J. 10 (10), (2016).</li>
<li>Dubrulle, M., Mousson, L., Moutailler, S., Vazeille, M., Failloux, A. -B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chikungunya+virus+and+Aedes+mosquitoes%3A+saliva+is+infectious+as+soon+as+two+days+after+oral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Chikungunya virus and Aedes mosquitoes: saliva is infectious as soon as two days after oral infection.</a> PLOS ONE. 4 (6), e5895(2009).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Anteriormente mostrou que os resultados obtidos com salivação forçada são na linha clássica de experimentos re-alimentação6. No entanto, em experimentos de re-alimentação e em nosso método apresentado de salivação forçada, é impossível diretamente a prova de atividade de salivação ou monitorar a liberação de saliva. Para provar a atividade de salivação, as amostras podem ser testadas para outros componentes presentes na saliva (ex., proteínas, carboidratos, etc.). Além disso, qPCRs adicional seria permitir a detecção de cópias de RNA virais. Isto, no entanto, requer separação de amostras de saliva para diversas análises, que podem limitar a sensibilidade no ensaio de cultura celular, em caso de números de partículas muito baixa. Por sua vez, isso pode levar a uma subestimação das taxas de transmissão de determinado.
Para obter resultados reprodutíveis, é necessário garantir que todos os mosquitos ficar vivos até o final do experimento. Isso é controlado pelo monitoramento visualmente a atividade de movimento de corpo dos mosquitos. Além disso, o uso do princípio do ensaio salivação para uma espécie de mosquito determinado tem que ser testado por vírus de controle, que são sabidos para ser transmitido por esta espécie de mosquito específico de alimentação. Vice-versa, cada vírus introduzido um experimento tem que ser testado em um mosquito suscetível.
Ensaios de salivação forçado têm muitas vantagens. Elevado número de mosquitos pode ser testado simultaneamente em um único espécime base em condições controladas e padronizadas sem entrar em conflito com normas de bem-estar dos animais9.
O método é usado por vários laboratórios. No entanto, as configurações exatas podem ser diferentes, que pode levar a diferenças nos resultados entre os laboratórios. Um componente crítico é o capilar para coletar a saliva, que pode ser feita de vidro14 ou15de plástico. Para cumprir com as normas de alta segurança de um insetário de nível 3 de segurança biológica, usamos dicas de filtro plásticas em vez de capilares de vidro, reduzindo assim o risco de lesões. Além disso, o filtro dicas tem a vantagem que o líquido coletado pode ser facilmente transferido usando uma pipeta.
A instalação do forçada salivação ensaio apresentado aqui é baseada em dois investigadores trabalhando juntos e compartilhando direitos. Desmobilização do mosquito é executada por uma pessoa, enquanto o outro simultaneamente prepara a instalação forçada de salivação. Isto reduz tempo de manuseio e minimiza o risco da amostra como mudar entre a desmobilização-local de trabalho e a salivação-placa de comutação não é necessário. Além disso, ele permite colocar os mosquitos no dispositivo de salivação forçada imediatamente após a desmobilização. Este mosquito bastante curto tempo de tratamento é essencial para o sucesso salivação forçada. Por último, os mosquitos podem ser monitorados diretamente para motilidade durante todo o experimento.
O ensaio de salivação apresentado aqui é usado para obter insights sobre o potencial vetor de espécies de mosquito. No entanto, para responder a algumas outras questões específicas (ex., os números de picadas de mosquito que são necessários para infectar os vertebrados), animal experimentos ainda podem ser necessários.

Em 2015, vírus Zika (ZIKV), um vírus transmitidas por mosquitos (mobovirus) pertencente à família Flaviviridae, surgiu na Colômbia e no Brasil e espalhou-se rapidamente através das Américas e do Caribe, causando uma epidemia com um notável número de associados casos clínicos de microcefalia e síndrome de Guillain-Barré1. Mosquitos da espécie Aedes aegypti e Aedes albopictus são considerados os vetores primários e secundários de ZIKV2, mas outras espécies do género Aedes também provaram ter competência vetorial experimental3 . Em contraste com as espécies de Aedes , maior parte das espécies de Culex testadas até agora não é capazes de transmitir o vírus4. Apenas, os dados para o Culex quinquefasciatus fornecido resultados inconclusivos3. Neste momento, informação está faltando na competência de vetor mosquito para ZIKV sob condições de temperatura moderada (< 20 ° C). No entanto, esta informação é substancial para as avaliações de risco dos spreads possíveis para regiões com clima temperado como Europa Central.
Um vetor competente para ZIKV é capaz de adquirir, manter, ampliar e finalmente transmitir o vírus. Portanto, teste o mosquito corpos, ou partes dos corpos, incluindo pernas, intestino, cabeça ou glândulas salivares, para ZIKV não é suficiente para determinar a competência vetorial. É obrigatório para testar partículas infecciosas vírus dentro saliva lançado. Para avaliar a competência vetorial, tanto a taxa de infecção (IR, número de corpos de mosquito ZIKV positivo por número de mosquitos ingurgitados) e a taxa de transmissão (TR, número de mosquitos com saliva ZIKV positivo por número de corpos de mosquito ZIKV-positivo), tem que ser determinado. IRs de mosquitos podem ser facilmente analisados pelos mosquitos simplesmente homogeneização, seguidos de uma reação em cadeia da polimerase em tempo real de transcriptase reversa (RT-qPCR) segmentação ZIKV. Além disso, a infecção pode ser ainda mais caracterizada por determinar o número de cópias virais por mosquito. Em contraste, a análise das taxas de transmissão se baseia na detecção de partículas de vírus viável na saliva de mosquitos individuais. Isto pode ser conseguido pela alimentação dos mosquitos infectados em animais suscetíveis do hospedeiro, seguidos pela análise da virémia no anfitrião5. No entanto, esse método se baseia em organismos-modelo apropriado e é caro e restrito por normas de bem-estar animal. Para evitar o uso de animais de laboratório para a análise de taxas de transmissão e reduzir os custos, artificial, sistemas de re-alimentação usar sangue gotículas tem sido descrito6. No entanto, testes em escala individual, combinada com um elevado número de indivíduos é difícil e demorado. A primeira descrição de um ensaio de salivação na escala individual foi publicada em 19667 e durante os últimos anos, experiências de salivação forçada tornaram-se o método de escolha para avaliar a competência vetorial de mosquitos3,8 .
Com base no nosso estudo de competência vetorial de Europa Central mosquitos recentemente publicado9, descrevemos salivação forçada, conforme relatado por Anderson et al. 8 , com algumas modificações. Este método permite alto rendimento padronizado experiências sob condições de biossegurança de alto nível (BSL-3) e inclui a identificação do vírus ativo pelos ensaios de cultura à base de célula. Os experimentos descritos aqui incluem 856 mosquitos. Eles foram infectados com ZIKV por refeição de sangue artificial e posteriormente analisados para a presença de partículas infecciosas vírus na saliva. Os mosquitos introduzidos dois experimentos composta por laboratório há muito estabelecidas populações de Ae. aegypti e Culex pipiens pipiens biótipo molestus (Cx. p. molestus), bem como campo pego Culex pipiens pipiens biótipo pipiens (Cx. p. pipiens), Culex torrentium (Cx. torrentium) e duas populações de Ae. albopictus . Com exceção de uma das duas populações Ae. albopictus , que foi recolhida na Itália, todos os mosquitos foram coletados na Alemanha.

<table><tbody><tr><td>Inject+matic Sleeper</td><td>Inject+matic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bugdorm-1 Gaiola de criação de insetos</td><td>BugDorm Store</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de cultivo de Drosophila</td><td>carl roth</td><td>PK11.2</td><td>frasco de plástico para mosquitos</td></tr><tr><td>Plug para tubos de cultivo de drosophila</td><td>carl roth</td><td>PK15.1</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de clima constante</td><td>Binder</td><td>KBF-240</td><td></td></tr><tr><td>Sangue humano depositado em sangue</td><td></td><td></td><td></td>, vencido, não utilizável para aplicação médica</tr><tr><td>Dumont-Pincette Eletrônico SS</td><td>Dumont</td><td>B40c</td><td></td></tr><tr><td>Células Vero</td><td>BNITM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aspirador de luz de flash</td><td>Fita</td><td></td> adesiva dupla face Bioquip 2809 <td></td></tr><tr><td></td><td>nenhum fornecedor específico</td>Gammex Luvas sem pó com <td></td><td></td></tr><tr><td> AMT</td><td>Ansell</td><td></td><td>por razões de segurança necessárias durante o trabalho com picadas no laboratório BSL3</td></tr><tr><td>RealStar Zika Virus RT-PCR-Kit</td><td>altona diagnósticos 591013</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MagMax Pathogen RNA/DNA Kit</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>4462359</td><td>RNA isolamento de corpos de mosquitos</td></tr><tr><td>Qiamp viral RNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>52906</td><td>RNA-Isolamento de filtro sobrenadante</td></tr><tr><td> pontas (20 &micro; L)</td> <td>Sarstedt</td><td>701,116,210</td><td>Corte os primeiros 3 mm da ponta</td></tr><tr><td>misturador de motor manual</td><td>carl roth</td><td>esgotado</td><td></td></tr><tr><td>micro pilões para misturador de motor manual</td><td>carl roth</td><td>CXH8.1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td>P0403550</td><td></td></tr><tr><td>L Glutamina Penicilina / Estreptomicina</td><td>PAN</td><td>P0819100</td><td></td></tr><tr><td>Anfotericina B</td><td>PAN</td><td>P06-0110</td><td></td></tr><tr><td>Frutose</td><td>carl roth</td><td>4981.5</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato tamponado solução salina</td><td>PAN</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>PAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piruvat de sódio</td><td>PAN</td><td>P0443100</td><td></td></tr><tr><td>MEM NAA</td><td>PAN</td><td></td><td></td></tr> P0832100 <tr><td>Hemotek Feeder</td><td>Hemotek</td><td>PS6</td><td></td></tr><tr><td>Light Cycler</td><td>Roche</td><td>480 II</td><td></td></tr><tr><td>Light Cycler Software</td><td>Roche</td><td>480 SW 1.5.1</td><td></td></tr><tr><td>Argila</td><td></td><td></td> de modelagem <td>sem fornecedor específico</td></tr><tr><td>Sistema de purificação King Fisher Flex</td><td>ThermoFisher scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aedes albopictus</td><td></td><td></td><td>eggs foram coletados em Freiburg, Alemanha</td></tr><tr><td>Binóculo</td><td>MOTIC</td><td>SMZ-168</td><td></td></tr><tr><td>Luz binocular</td><td>MOTIC</td><td>MLC-150C</td><td></td></tr><tr><td>CO2-Incubadora</td><td>Thermo scientific</td><td>MIDI 40</td><td></td></tr></tbody></table>

forçado a salivação como um método para analisar a competência vetorial de mosquitos

Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

Competência de vetor é definida como o potencial de uma espécie de mosquito para transmitir um vírus transmitidas por mosquitos (mobovirus) para um hospedeiro vertebrado. Partículas de vírus viáveis são transmitidas durante uma refeição de sangue através da saliva de um mosquito infectado. Ensaios de salivação forçada permitem determinar o potencial de vetor com base único mosquitos, evitando o uso de experiências com animais. O método é adequado para analisar um grande número de mosquitos em um experimento dentro de um curto período de tempo. Ensaios de salivação forçado foram usados para analisar 856 mosquitos individuais presos na Alemanha, incluindo dois diferentes biótipos de Culex pipiens pipiens , Culex torrentium , bem como Aedes albopictus, que foram infectados experimentalmente com vírus Zika (ZIKV) e incubados a 18 ° C ou 27 ° C, para duas e três semanas. Os resultados indicaram a falta de competência vetorial dos diferentes táxons Culex para ZIKV. Em contraste, o Aedes albopictus foi suscetível a ZIKV, mas apenas a 27 ° C, com taxas de transmissão semelhantes a uma colônia de laboratório Aedes aegypti testada em paralelo.

Aedes aegypti é conhecido como um vetor competente para ZIKV pelo menos sob condições climáticas tropicais12. Portanto, usamos Ae. aegypti como um controle positivo para estabelecer o ensaio e analisar a receita federal, bem como TRs em uma temperatura de incubação de 27 ° C e uma humidade de 80%. IR e TR... foram definidos conforme descrito por Fortuna et al. 13. desafiado Ae. aegypti mostrou IR de 50% e 72% e TR de 42% e 31% em 14 e 21 dias pós infecção (dpi), respectivamente (figura 1A e 1B). Posteriormente, mosquitos europeus foram testados para infecção ZIKV e transmissão usando condições climáticas tropicais, bem como temperadas.
A temperatura de incubação de 27 ° C, todas as espécies de mosquito mostraram infecção ZIKV 14 dpi, bem como 21 dpi, exceto Cx. pipiens p. e Cx. torrentium indivíduos, que foram positivos em 14 dpi apenas. Todas as espécies de Aedes mostraram maior IRs (entre 50% e 72%) bem como a maior concentração de RNA viral (106 até 10 amostras de9 RNA cópias/mosquito) em comparação com os diferentes táxons de Culex , que revelou o IRs que variam entre 0 % e 32% e cargas virais de 103 a 10 espécimes de cópias/mosquito4 RNA. Todas as espécies de Aedes exibido saliva ZIKV-positivo (TR 13 – 42%), Considerando que nenhuma das amostras de saliva de táxons o Culex contido ZIKV (figura 1A e 1B). Curiosamente, as taxas de transmissão em dpi 21 foram semelhantes nos Ae. aegypti e albopictus Ae... da Alemanha (30%), mas foram substancialmente menores em Ae. albopictus da Itália (13%).
Incubação de mosquitos desafiados a uma temperatura moderada de 18 ° C revelado geralmente baixa vírus carrega na espécie Aedes (4– 10 106 RNA cópias/mosquito), bem como dos diferentes táxons Culex (102-104 Cópias de RNA/mosquito). No entanto, a 18 ° C temperatura de incubação, transmissão de ZIKV não foi observada para qualquer das espécies de mosquito investigadas.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57980/57980fig1.jpg"> Figura 1: taxas de transmissão de mosquitos infectados experimentalmente com ZIKV. Resultados de estudos de competência vetorial com ZIKV em espécies diferentes de mosquitos. Seis táxons diferentes mosquito foram infectados com ZIKV e incubados a 27 ° C ou ° C 18 para 14 (A) ou 21 dias (B). TR é definido como o número de mosquitos com saliva ZIKV positivo por número de corpos de mosquito ZIKV-positivo. O número total de mosquitos investigado foi 856, com um mínimo de 30 indivíduos por táxons de ponto/temperatura/mosquito cada vez. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57980/57980fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Controlo eficaz de transmissão do vírus a cargo de mosquito, o conhecimento do potencial vetor de respectivos mosquitos é de particular interesse. Descrevemos a salivação forçada como um método para analisar a competência vetorial do Aedes albopictus e três táxons de Culex diferentes para a transmissão de vírus Zika.

Forçado a salivação como um método para analisar a competência vetorial de mosquitos

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo de doenças transmitidas por mosquitos, como se uma espécie de mosquito é ou não um vetor competente para um determinado vírus. A principal vantagem desse método é que uma grande quantidade de mosquitos pode ser analisada simultaneamente, sem o uso de animais de laboratório como camundongos. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque ele precisa de habilidades motoras finas que só podem ser adquiridas com a prática.A demonstração visual dessa técnica é crítica, pois as etapas principais são difíceis de aprender; Eles exigem experiência no manuseio de mosquitos e vírus, e também habilidades motoras finas. Para começar, dilua o estoque de vírus. Em seguida, misture sangue humano vencido com frutose, soro bovino filtrado e o estoque de vírus.Congele 140 microlitros de mistura de farinha de sangue para análise posterior via TCID50. Em seguida, coloque duas gotículas de 50 microlitros da mistura de farinha de sangue em um frasco de plástico e deixe os mosquitos se alimentarem por duas horas. Depois de anestesiar os mosquitos, conte os indivíduos totalmente ingurgitados e transfira-os para um novo frasco contendo um algodão embebido em frutose.Em seguida, mantenha os mosquitos a 27 graus Celsius e 80% de umidade por 14 ou 21 dias. Reabasteça as almofadas de algodão saturadas com frutose a cada 72 horas com 1,5 mililitros de frutose. Primeiro, semeie 20.000 células Vero por poço em uma placa de 96 poços com meio de crescimento suplementado.Para preparar o dispositivo de salivação, coloque uma placa de vidro quadrada na bancada em um ângulo de 30 graus. Em seguida, cole fita dupla-face na parte superior da placa de vidro. Em seguida, enrole a massa de modelar até que tenha 0,5 centímetros de diâmetro e prenda-a na placa horizontalmente a um centímetro de distância da fita dupla-face.Corte as pontas do número necessário de pontas de filtro de 10 microlitros e encha cada ponta com 10 microlitros de PBS. Em seguida, coloque as pontas na massa de modelar e prenda-as com uma leve pressão. Em seguida, imobilize os mosquitos removendo suas pernas e asas.Fixe os mosquitos na fita acima das pontas do filtro. Coloque delicadamente a tromba de cada mosquito em uma ponta de filtro. Após 30 minutos, remova as pontas do filtro e descarte a argila e a fita.Transfira a saliva coletada para tubos de reação contendo 10 microlitros de PBS. Misture a saliva e o PBS delicadamente e transfira a mistura para os poços de uma placa de 96 poços. Incube a placa por sete dias a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.Usando um microscópio de luz, verifique as células quanto à presença de efeito citopático. Uma vez que um poço seja positivo para efeito citopático, use uma pipeta para colher 140 microlitros do sobrenadante. Em seguida, transfira o sobrenadante para um tubo de reação.Em seguida, misture 140 microlitros do sobrenadante com 560 microlitros de tampão AVL e incube por 10 minutos em temperatura ambiente. Por fim, adicione 560 microlitros de etanol e inverta a amostra para misturar. Usando este protocolo, várias espécies de mosquitos foram testadas para infecção e transmissão do vírus Zika sob várias condições climáticas.Sob condições de incubação de 27 graus Celsius, todas as espécies de Aedes exibiram saliva positiva para o vírus Zika. Por outro lado, nenhuma das amostras de saliva dos táxons de Culex continha evidências do vírus. Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada para 50 mosquitos em uma hora, se executada corretamente.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar experimentos de salivação forçada. Não se esqueça de que trabalhar com mosquitos infectados pode ser muito perigoso, portanto, medidas especiais de segurança para o manuseio de mosquitos sob as condições BSA-3 devem sempre ser tomadas durante a realização de qualquer experimento.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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Aprenda a técnica de salivação forçada para analisar a competência vetorial de mosquitos Aedes albopictus e Culex para o vírus Zika. Este método permite testar até 50 mosquitos por hora sem uso de animais de laboratório.

Forçado a salivação como um método para analisar a competência vetorial de mosquitos

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