Name: Saccharomyces cerevisiae Metabólica de rotulagem com 4-thiouracil e a quantificação dos recém sintetizado mRNA como um Proxy para a RNA polimerase II atividade (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Aprenda a quantificar mRNA recém-sintetizado em Saccharomyces cerevisiae usando rotulagem com 4-tiouracil. Este método permite medir com precisão a atividade da RNA polimerase II, separando a síntese da degradação do RNA.

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Agradecemos a Laszlo Tora pelo seu apoio e V. Fisher, K. Schumacher e F. El Saafin para suas discussões. Tuberculose foi apoiado por uma bolsa Marie Curie-ITN (documento PITN-GA-2013-606806, NR-NET) e o arco de Fondation. Este trabalho foi financiado por fundos da Agence Nationale de la Recherche (SAGA2 ANR-15-CE11-0022). Este estudo foi suportado também por ANR-10-LABX-0030-INRT, um fundo de Estado francês, gerido pela Agence Nationale de la Recherche sob o quadro programa Investissements d'Avenir ANR-10-IDEX-0002-02.

1. célula de cultivo e rapamicina depleção de uma subunidade da SAGA
<ol><li>Para cada cepa de S. cerevisiae e replicar, incluindo o selvagem-tipo ou cepas de controle, inocular uma única colônia de um prato fresco em 5 mL de meio YPD (2% de peptona, extrato de levedura 1% e 2% de glicose).</li>
	<li>Desenvolvem-se células de S. cerevisiae durante a noite a 30 ° C, com agitação constante (150 rpm).</li>
	<li>Medir a densidade óptica em 600 nm (OD600) e diluir a cultura para uma OD600 de aproximadamente 0.1 em 100 mL de meio YPD e deixe crescer até que o OD600 é em torno de 0,8.</li>
	<li>Em paralelo, inocular uma única colônia de células de S. pombe de um prato fresco em 50 mL de meio de Sim (extrato de levedura 0,5%; 250 mg/L adenina, uracila, histidina, leucina e lisina; 3% de glicose) e crescer as células durante a noite a 32 ° C, com agitação constante (150 rotações por minuto).</li>
	<li>Medir o OD600 de cultura durante a noite de S. pombe e diluir a cultura para uma OD600 de aproximadamente 0.1 em 500 mL de meio de Sim e deixá-lo crescer até o OD600 é aproximadamente 0,8.</li>
	<li>Para cada estirpe âncora-afastado de S. cerevisiae e replicar, incluindo o selvagem-tipo ou cepas de controle, inocular uma única colônia de um prato fresco em 5 mL de meio YPD (2% de peptona, extrato de levedura 1% e 2% de glicose).</li>
	<li>Crescem as células durante a noite a 30 ° C, com agitação constante (150 rpm).</li>
	<li>Na manhã seguinte, medir a OD600, diluir a cultura para uma OD600 de aproximadamente 0.1 em 100 mL de meio YPD e deixá-lo crescer até o OD600≈ 0,8.</li>
	<li>Adicionar 100 µ l de rapamicina para a cultura de uma solução stock de 1 mg/mL (concentração final de rapamicina de 1 µ g/mL) e incubar a 30 ° C, com agitação constante durante o tempo necessário para a proteína de interesse para ser condicionalmente empobrecido do núcleo (deixar que as células Normalmente, 30 min é adequada). Para o controle, use uma cultura de levedura semelhante, mas em vez de adicionar rapamicina, adicionar o volume equivalente de Dimetilsulfóxido (DMSO).</li>
</ol>2. 4tU rotulagem com S. pombe Spike-in (contagem)
<ol><li>
Prepare uma solução fresca de 2 M. 4-thiouracil. Uma vez preparados, mantê-lo em temperatura ambiente e longe da luz.
	<ol>
<li>Com precisão pesar 64,1 mg de 4-thiouracil de cada cultura de S. cerevisiae e dissolvê-lo em 250 µ l de dimetilformamida (DMF) ou em 250 µ l de DMSO.</li>
		<li>Para a cultura de S. pombe ser usado como spike-no, pesa 320,5 mg de 4-thiouracil e dissolvê-lo em 1.250 µ l de DMSO.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicionar a solução de 4-thiouracil de S. cerevisiae e S. pombe culturas para uma concentração final de 5 mM e incube-os por 6 min com agitação constante a 30 ° C e 32 ° C, respectivamente.</li>
	<li>Após 6 min, retire uma pequena alíquota de cada cultura para a contagem de células. Conte as células usando um contador automático de células ou uma câmara de Neubauer.</li>
	<li>Coletar as células através de centrifugação (2.500 x g) por 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Desprezar o sobrenadante, lavar as células com PBS 1x gelada e centrifugar novamente (2.500 x g, 4 ° C, 5 min).</li>
	<li>Calcule o número total de células em cada uma das amostras de S. cerevisiae e S. pombe .</li>
	<li>Ressuspender as células em 5 mL de PBS 1x gelada e misture S. cerevisiae com células de S. pombe , com uma proporção de 3:1.</li>
	<li>Centrifugar as células (2.500 x g, 4 ° C, 5 min), remover a PBS, congelar as células no líquido N2e armazenar a amostra a-80 ° C até utilização posterior.</li>
</ol>3. o RNA extração e tratamento de DNase
<ol><li>Descongele as células no gelo por aproximadamente 20 a 30 min.</li>
	<li>Proceda com a extração do RNA usando um kit de extração de RNA de leveduras (Tabela de materiais) com algumas adaptações.</li>
	<li>Por cada amostra, despeje 750 µ l de grânulos de Zirconia gelados em um tubo de 1,5 mL de tampão de parafuso fornecido com o kit. Lembre-se que por cada tubo, RNA de até 109 células pode ser eficientemente extraído. Portanto, prepare-se o número de tubos necessários para cada amostra. Por exemplo, uma cultura de S. cerevisiae de 100 mL (OD600≈ 0,8) pode processar em torno de 2 x 109 3 x 109 células, levando até um total de 2.7 x 109 4 x 109 células no total (após o pico-com um terço da S. pombe células). Neste caso, até 3-4 tubos de reação por cada amostra/condição/mutante/replicar seria necessária.</li>
	<li>Por cada 1 x 109 células, adicione 480 µ l do lysis buffer fornecido com o kit, 48 µ l de SDS 10% e 480 µ l de álcool isoamílico: fenol: clorofórmio (25:24:1, v/v/v).</li>
	<li>Misture as células usando um misturador do vortex e transferi-los para os tubos contendo os grânulos de Zirconia gelados.</li>
	<li>Acomodar os tubos em um adaptador de misturador de vórtice, vire o vórtice na velocidade máxima e bata por 10 min lisar as células de levedura (em um quarto a 4 ° C). Como alternativa, realize a Lise das células em um grânulo-batedor automático.</li>
	<li>Centrifugar tubos a 16.000 x g durante 5 min à temperatura ambiente e cuidadosamente, coletar a fase superior (fase contendo RNA) para um tubo de Falcão de 15 mL. Normalmente, o volume recuperado por cada tubo é em torno de 500 – 600 µ l.</li>
	<li>Para os tubos de 15 mL contendo o RNA parcialmente purificado, adicione o buffer de ligação fornecido com o kit e misturar cuidadosamente. Por cada 100 µ l de solução de RNA, adicionar 350 µ l de tampão de ligação (ou seja, quando o volume da fase aquosa solução é 600 µ l, 2,1 mL de tampão de ligação deve ser adicionado).</li>
	<li>Para a mistura anterior, adicione o etanol 100% e misture bem. Por cada 100 µ l de solução de RNA, acrescentar 235 µ l de etanol 100% (ou seja, quando o volume da fase aquosa solução é 600 µ l, adicionar 1,41 mL de etanol).</li>
	<li>Aplica até 700 µ l da mistura da etapa 3,9 para um cartucho de filtro montado em um tubo de coleta, ambos fornecidos com o kit.</li>
	<li>Centrífuga para 1 min a 16.000 x g. Se a duração da centrifugação não foi suficiente para o volume total de passar através do filtro, repetir a centrifugação por 30 s.</li>
	<li>Descartar o escoamento e reutilizar o tubo da mesma coleção. Adicione outro 700 μL de solução de tampão-etanol de RNA-obrigatórias para o filtro e centrifugar novamente 16.000 x g por 1 min.</li>
	<li>Descartar o escoamento e repita os passos 3.11 e 3.12 até a solução do RNA é terminada.</li>
	<li>Lavar o filtro 2 x com 700 µ l de solução 1 de lavagem. Recolher a lavagem solução através de centrifugação a 16.000 x g por 1 min e mantenha sempre o tubo de coleta.</li>
	<li>Lavar o filtro 2 x com 500 µ l de solução 2 de lavagem. Recolher a lavagem solução através de centrifugação a 16.000 x g por 1 min e mantenha sempre o tubo de coleta.</li>
	<li>Centrifuga os tubos mais uma vez em 16.000 x g por 1 min secar completamente o filtro.</li>
	<li>Transferir o refil do filtro para o tubo de coleta final (tubo apropriado de RNA) e eluir RNA com 50 µ l de DEPC tratada, livre de RNase H2O (pré-aquecido a 100 ° C).</li>
	<li>Centrífuga para 1 min a 16.000 x g.</li>
	<li>Eluir RNA novamente (para o mesmo tubo) com 50 µ l de pré-aquecido DEPC tratada, livre de RNase H2O. Certifique-se de que todo o volume passou através do filtro; caso contrário, centrifugue durante períodos mais longos.</li>
	<li>Se forem utilizados tubos múltiplos para uma única amostra, piscina-los todos em um tubo.</li>
	<li>Quantificar e verificar a pureza da amostra usando o equipamento apropriado. Nota: Enquanto 4tU só é incorporado dentro RNA recém sintetizado, há uma chance de menor contaminação com DNA. Por esse motivo, é sempre aconselhável para tratar as amostras com DNase eu. Para isso, use os reagentes fornecidos com o kit de extração de RNA-(Tabela de materiais), seguindo as recomendações do fabricante.</li>
</ol>4. tiol específicas Biotinylation do RNA recém sintetizado
<ol><li>Ajuste a concentração do RNA obtido com a seção 3 do protocolo de 2 mg/mL. Alíquota de 200 microgramas de RNA total, aqueça-a durante 10 min a 60 ° C e chill-lo imediatamente no gelo por 2 min.</li>
	<li>
A alíquota do RNA, adicionar os reagentes mencionados abaixo na seguinte ordem: 600 µ l de DEPC tratada, livre de RNase H2O, 100 µ l de tampão de biotinylation (100 mM Tris-HCl [pH 7.5] e 10 mM de EDTA e de DEPC tratada, livre de RNase H2O) e 200 µ l de Biotina-HPDP de um estoque de 1 mg/mL biotina-HPDP em DMSO ou DMF.
	<ol>
<li>Em algumas situações, a solução de biotina-HPDP tende a precipitar, provavelmente devido à sua baixa solubilidade em água. Nesta situação, aumentar o volume de DMSO/DMF até 40% sobre o volume de reação (com a amostra de RNA, adicione 400 µ l de DEPC tratada H2O, 100 µ l de tampão de biotinylation e 400 µ l de biotina-HPDP de um estoque de 0,5 mg/mL).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubar a amostra em temperatura ambiente e protegido da luz por 3 h, com leve agitação.</li>
	<li>Após a incubação, adicionar um volume aproximadamente igual de clorofórmio para os tubos e misture vigorosamente.</li>
	<li>Girar a amostra a 13.000 x g por 5 min, a 4 ° C. Esta etapa permite a remoção de excesso biotina que fez não biotinylate o RNA. Como alternativa, execute esta etapa usando tubos de captura de fase (pesados). Por isso, spin para baixo os tubos de captura de fase por 1 min a 13.000 x g, adicione a mistura de RNA e uma quantidade igual de clorofórmio, misturá-los vigorosamente e centrifugá-los a 13.000 x g durante 5 min, a 4 ° C.</li>
	<li>Transferi com cuidado a fase superior para novos tubos de 2 mL.</li>
	<li>Adicionar um décimo do volume de 5 M NaCl e misturar a amostra.</li>
	<li>Adicionar um volume igual de isopropanol, homogeneizar bem a amostra e girá-lo em 13.000 x g , durante pelo menos 30 min, a 4 ° C.</li>
	<li>Cautelosamente, remover o sobrenadante e adicionar 1 mL de etanol gelado de 75%.</li>
	<li>Girar a 13.000 x g durante 10 minutos, a 4 ° C.</li>
	<li>Cuidadosamente remova o sobrenadante, rápido-rotação do tubo e a restante da solução de etanol. Certifique-se que a pelota do RNA não seca.</li>
	<li>Suspender o RNA em 100 µ l de DEPC tratada, livre de RNase H2O.</li>
</ol>5. purificação da fração recentemente sintetizada de RNA Total e sem rótulo usando grânulos magnéticos Streptavidin-revestido
<ol><li>Aqueça o biotinilado RNA durante 10 minutos a 65 ° C e em seguida relaxar as amostras no gelo por 5 min.</li>
	<li>Adicione 100 µ l de grânulos magnéticos streptavidin-revestido para o RNA biotinilado (em um volume final de 200 µ l). Especificamente, é recomendável usar os grânulos indicados na Tabela de materiais, desde que, após conversas com outros laboratórios, estes parecidos ser a mais consistente e confiável.</li>
	<li>Incube a amostra com ligeira agitação por 90 min, à temperatura ambiente.</li>
	<li>Coloque as colunas fornecidas com o kit (Tabela de materiais), no suporte magnético.</li>
	<li>Adicionar 900 µ l de tampão de lavagem temperatura (100 mM Tris-HCl [pH 7,5], EDTA 10 mM, 1 M NaCl e 0,1% de Tween 20, em DEPC tratada, livre de RNase H2O) para as colunas (pre-executar e equilibrar).</li>
	<li>Aplique a mistura de grânulos/RNA (200 µ l) para as colunas.</li>
	<li>Coletar o escoamento em tubos de 1,5 mL e aplicá-lo novamente para a mesma coluna magnética. Se necessário, manter esta passagem como ele representa a fração de RNA sem rótulo.</li>
	<li>Lavar as colunas 5 x com crescentes volumes de tampão de lavagem (600, 700, 800, 900 e 1.000 µ l).</li>
	<li>Eluir o RNA recém sintetizado com 200 µ l de 0,1 M de TDT.</li>
	<li>Execute uma segunda eluição, 3 min mais tarde, com igual volume de 0,1 M de TDT.</li>
	<li>Após a eluição do RNA, adicionar 0,1 volumes de NaOAc 3 M (pH 5.2), 3 volumes de gelada 100% de etanol e 2 µ l de glicogênio 20 mg/mL (RNA-classe) e deixe a RNA precipitado durante a noite, a-20 ° C.</li>
	<li>Recuperar o RNA por centrifugação (13.000 x g durante 10 minutos, a 4 ° C) e Resuspenda-lo em 15 µ l de DEPC tratada, livre de RNase H20. A proporção de rotulado-para total do RNA é esperada para ser ao redor 2% - 4% (geralmente mais em direção a extremidade inferior), renderização de aproximadamente 2,0 µ g de RNA recém sintetizado. Esta quantidade é suficiente para fazer várias experiências de qPCR, bem como para análises microarray/sequenciamento.</li>
</ol>6. RT-qPCR validação das diferentes frações
<ol><li>Sintetiza o cDNA de 2 µ g de RNA total ou 10 µ l de RNA etiquetado usando hexâmeros aleatórios e o transcriptase reversa de escolha, de acordo com as instruções do fabricante (Tabela de materiais).</li>
	<li>Amplifica o cDNA por qPCR em tempo real, usando um protocolo padrão (Tabela de materiais). Nota: Todas as amostras devem ser executadas em triplicado desde um mínimo de duas repetições biológicas. Corrigi todos os valores brutos para a expressão de S. pombe tubulina.</li>
</ol>7. Microarray hibridização
<ol><li>Hibridizam amostras de RNA em fichas de microarray preferencial de acordo com as instruções do fabricante (para este protocolo específico, consulte Tabela de materiais). Brevemente, preparar biotinilado cRNA alvos de 150 ng do RNA usando o Premier RNA Amplification Kit (Tabela de materiais), de acordo com as instruções do fabricante. Hibridizam 4mg de cRNAs fragmentada para 16 h a 45 ° C e 60 rpm em chips de microarray.</li>
	<li>Lavar, mancha e digitalizar as fichas usando a estação indicada e scanner (Tabela de materiais). Extrai os dados brutos (arquivos de intensidade CEL) das imagens digitalizadas usando o console de comando (AGCC, versão 4.1.2).</li>
	<li>Mais processe os arquivos do CEL com versão de software do Console de expressão 1.4.1 para calcular a sonda conjunto intensidades de sinal, usando os algoritmos baseados em estatísticas MAS 5.0 com as configurações padrão e a escala global, como método de normalização. Nota: A intensidade de alvo média aparada de cada chip foi arbitrariamente definida como 100. Execute todos os experimentos usando pelo menos duas repetições biológicas independentes. Normalizar os dados brutos para o sinal de S. pombe e calcular prega mudanças nos níveis de RNA totais e recém sintetizadas.</li>
</ol>8. dados análise usando um Pipeline R existente
<ol><li>Calcular a síntese e decadência taxas usando um pipeline e o pacote R/Bioconductor publicamente disponível, como descrito anteriormente8,10.</li>
</ol>

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<li>Darzacq, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dynamics+of+RNA+polymerase+II+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo dynamics of RNA polymerase II transcription.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 14 (9), 796-806 (2007).</li>
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<li>Schwalb, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TT-seq+maps+the+human+transient+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">TT-seq maps the human transient transcriptome.</a> Science. 352 (6290), 1225-1228 (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Enquanto ainda estão a melhorar todo o genoma de ferramentas para analisar as alterações na transcrição, a análise exclusiva da transcriptoma através da quantificação dos níveis de estado estacionário de RNA pode não refletir com precisão as alterações na atividade do RNA polymerase II. Com efeito, os níveis do mRNA são regulados não só pela síntese do RNA, mas também pela sua maturação e degradação. Para medir a síntese de mRNA desacoplada da degradação do mRNA, protocolos distintos foram desenvolvidos nos últimos anos ...

As células respondem a sinais endógenos e exógenos, através da alteração dinâmica do seu programa de expressão do gene. Nos últimos anos, um enorme desenvolvimento das metodologias de todo o genoma permite a descrição precisa e abrangente de transcriptoma mudanças em condições diferentes. Na maioria dos estudos transcriptomic, sequenciamento de hibridação ou elevado-throughput de microarray são usadas para quantificar os níveis de RNA de uma fração de RNA total estado estacionário. Transcriptional mudanças sob uma perturbação específica podem exibir uma ampla gama de resultados possíveis, com um amplo espectro de genes sendo - up ou ativador ou mudanças de expressão de genes específicos. Expressão do gene é o resultado de um equilíbrio de aperfeiçoá-lo — ou estado estacionário — entre a síntese de RNA pela ARN-polimerase e outros processos que afetam os níveis de RNA. Transcrição de RNA polimerase II, incluindo suas três fases distintas (iniciação, alongamento e término), é altamente e intricadamente associado com processamento, exportação citoplasmática, tradução e degradação do mRNA.
Vários estudos recentes demonstraram que a decadência e a síntese de mRNAs são mecanismos acoplados e mostraram que efeitos transcriptional sobre mutação ou sob estímulos podem ser negligenciados quando quantificar o RNA total de estado estacionário. Em primeiro lugar, a detecção de alterações transcricionais através da análise dos níveis de estado estacionário de mRNA sempre depende de mRNAs Half-Life. Uma vez que a perturbação é introduzida, os níveis de estado estacionário de mRNAs com meia-vida longa serão muito menos afetados do que aqueles dos mRNAs com meia-vida curta. Portanto, a capacidade de detecção das alterações na síntese do RNA é fortemente tendencioso em favor de transcrições de curta duração, enquanto a análise das espécies de mRNA caudais pode falhar para revelar alterações dinâmicas na taxa de transcrição. Em segundo lugar, vários relatos têm demonstrado que, tanto em leveduras e mamíferos, mudanças globais na transcrição podem ser negligenciadas ao analisar os níveis de estado estacionário de mRNA. Isto é provavelmente devido os mecanismos que vinculam a síntese de mRNA e degradação, resultando em buffer de mRNA. Isto levou ao desenvolvimento de novos protocolos para quantificar a síntese de mRNA desacoplada da degradação, através da análise do mRNA recentemente transcrito. Nos últimos anos, foram apresentadas várias alternativas, incluindo sequenciamento pperigoso global (GRO-seq)1e transcrição de alongamento nativo sequenciamento (NET-seq)2,3. Aqui, apresentamos um protocolo desenvolvido inicialmente em células de mamíferos4,5,6 e em seguida adaptado para levedura7,8,9,10, 11, que é baseado no RNA etiquetando com um nucleosídeo thiolated ou base analógica, 4-thiouridine (4sU) ou 4-thiouracil (4tU), respectivamente.
Esse método especificamente purifica recém transcrito de RNA das células no qual ARN são pulso-etiquetadas com 4sU com virtualmente nenhuma interferência na homeostase da célula. Portanto, uma vez que as células são expostas a 4sU, a molécula rapidamente é captação, fosforilada para 4sU-trifosfato e incorporada em RNAs sendo transcritos. Uma vez rotulado de pulso, é possível extrair o RNA celular total (correspondente aos níveis de estado estacionário do RNA), e, posteriormente, a fração de RNA 4sU-rotulado thiol-especificamente modificado, levando à formação de uma ligação dissulfureto entre biotina e a recentemente transcrito de RNA4,5. No entanto, 4sU só pode ser a captação pelas células expressando um transporte de nucleosídeo, como o transporte de nucleosídeo equilibrative humano (hENT1), impedindo a sua utilização imediata em leveduras brotamento ou fissão. Enquanto um pode expressar a hENT1 em S. pombe ou S. cerevisiae, uma abordagem mais fácil pode ser alcançada usando o 4tU base modificado, uma vez que as células de levedura podem demorar até 4tU, sem a necessidade de expressão de um transporte de nucleosídeos10, 11 , 12 , 13. na verdade, o metabolismo do 4tU exige a atividade da enzima uracila Fosforibosiltransferase (UPRT). Em vários organismos, incluindo o fermento mas não mamíferos, UPRT é essencial para uma via de salvamento de pirimidina, reciclagem uracil para monofosfato de uridina.
Um viés importante em estudos de transcriptomic pode ser introduzido pela normalização entre diferentes amostras analisadas em paralelo. De fato, muitos fatores diferentes podem afetar a análise comparativa da transcriptoma do mutante e as estirpes de tipo selvagem: a eficiência do lysis da pilha, as diferenças na extração e recuperação de RNA e desvios na calibração de scanner para análise de microarray , entre outros. Como discutido acima, essas variações podem ser particularmente enganosas, quando são esperados efeitos globais na transcrição do RNA polimerase II. Uma elegante significa precisão comparar taxas de síntese de mRNA entre diferentes amostras foi projetada usando o fermento de fissão distantemente relacionados Schizosaccharomyces pombe como padrão interno. Por isso, um número fixo de rotulado S. pombe células é adicionado para as amostras de S. cerevisiae , células selvagem-tipo ou mutantes, antes da lise celular e de extração de RNA10. Posteriormente, RNAs de estado estacionário e recentemente sintetizadas de S. pombe e S. cerevisiae são quantificados por RT-qPCR ou através do uso de chips de microarray ou arranjar em sequência do elevado-throughput10. Combinando estes dados com modelagem cinética, absolutas taxas de síntese de mRNA e decadência em leveduras brotamento podem ser medidas.
No âmbito do presente manuscrito, vamos mostrar como a análise do RNA transcrito recentemente autorizados a revelar um papel global para os complexos coactivator SAGA e TFIID na transcrição de RNA polimerase II em brotamento fermento14,15, 16. Importante, após estudos quantificar os níveis de RNAm de estado estacionário em S. cerevisiae e sugeriram que a SAGA desempenha uma função predominante em um conjunto limitado de genes de fermento que são fortemente afetadas por mutações na SAGA, mas relativamente resistente à TFIID mutações17,18,19. Surpreendentemente, as atividades enzimáticas SAGA foram mostradas para agir sobre o genoma inteiro transcrito, sugerindo um papel mais amplo para esse ativador co na transcrição do RNA polimerase II. Observou-se diminuição da recrutamento de II de polimerase de RNA em genes mais expressos mediante a inativação da SAGA ou TFIID, sugerindo que estes coactivators trabalham juntos na maioria dos genes. Portanto, a quantificação de mRNA recentemente transcrito revelou que a SAGA e TFIID são necessários para a transcrição dos genes quase todos pela RNA polimerase II14,15,16. A implementação de mecanismos compensatórios emerge como uma maneira para que as células lidar com uma diminuição global da síntese de mRNA que é armazenado em buffer por uma simultânea redução global na degradação do mRNA. SAGA adiciona à lista de fatores, tendo um efeito global na transcrição do RNA polimerase II, a tais como subunidades de RNA Pol II10, o mediador coactivator complexo20, o general transcrição fator TFIIH21,22 e indirectamente, de elementos de degradação do mRNA máquinas9,10,23. Tais eventos compensatórios foram observados universalmente em mutantes SAGA, contabilidade para as modestas e limitadas alterações nos níveis de RNAm de estado estacionário apesar de uma diminuição global e grave na síntese de mRNA14. Análises semelhantes também foram realizadas em uma cepa de exclusão BRE1 , resultando em uma perda completa da ubiquitination histona H2B. Curiosamente, um tanto mais suave mas consistente efeito global na transcrição do RNA polimerase II poderia ser detectado na ausência de Bre1, indicando que a rotulagem metabólica do RNA recém transcrito no fermento pode detectar e quantificar uma vasta gama de mudanças no mRNA taxas de síntese.

<table><tbody><tr><td>4-Tiouracil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# 440736</td><td></td></tr><tr><td>Rapamicina</td><td>Euromedex</td><td>Cat# SYN-1185</td><td></td></tr><tr><td>Condessa II FL Contador de Células Automatizado</td><td>ThermoFisher</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Kit de purificação de RNA RiboPure, levedura</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat# AM1926</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 Espectrofotômetro</td><td>ThermoFisher</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Kit TURBO DNA-free</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1907</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link HPDP Biotina</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat# 21341</td><td></td></tr><tr><td>Tiolutina</td><td>Abcam</td><td>ab143556</td><td></td></tr><tr><td>&micro; Kit de estreptavidina MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Cat# 130-074-101</td><td></td></tr><tr><td>Transcritor Transcriptase reversa</td><td>Roche</td><td>03 531 295 001</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I Master</td><td>Roche</td><td>4707516001</td><td></td></tr><tr><td>Genoma de levedura GeneChip 2.0</td><td>ThermoFisher</td><td>900555</td><td></td></tr><tr><td>GeneChip Fluidics Station 450</td><td>ThermoFisher</td><td>00-0079</td><td></td></tr><tr><td>GeneChip Scanner 3000 7G</td><td>ThermoFisher</td><td>00-0210</td><td></td></tr></tbody></table>

saccharomyces cerevisiae metabólica de rotulagem com 4-thiouracil e a quantificação dos recém sintetizado mrna como um proxy para a rna polimerase ii atividade

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Globais defeitos na transcrição do RNA polimerase II podem ser ignorados pelos estudos de transcriptomic, analisando o estado estacionário do RNA. Com efeito, a diminuição global da síntese de mRNA foi mostrada para ser compensado por uma diminuição simultânea na degradação do mRNA para restaurar os níveis normais de estado estacionário. Portanto, a quantificação de todo o genoma de síntese de mRNA, independentemente do decaimento do mRNA, é o melhor reflexo direto da atividade transcricional de RNA polimerase II. Aqui, vamos discutir um método usando não-distorçer metabólica rotulagem de RNAs nascentes em Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Especificamente, as células são cultivadas por 6 min com uma uracila analógico, 4-thiouracil, e os rotulado RNAs recém transcritos são purificados e quantificados para determinar as taxas de síntese de mRNA individuais todos os. Além disso, usando rotulado Schizosaccharomyces pombe células como padrão interno permite comparar a síntese de mRNA em S. cerevisiae de diferentes linhagens. Usando este protocolo e encaixe os dados com um modelo cinético dinâmico, as taxas de decaimento do mRNA correspondente podem ser determinadas.

Ao realizar a rotulagem metabólica do RNA recém transcrito, vários aspectos precisam ser controlados: o tempo e a eficiência da rotulagem, a proporção de pico-no, o protocolo de extração e a eficácia de biotinylation (incluindo relação sinal-ruído), entre outros. Estas condições foram extensivamente e metodicamente mostradas por outros7,10,11. Aqui focamos principalmente sobre a interpretação e a...

O protocolo descrito aqui baseia-se a quantificação de todo o genoma de mRNA recentemente sintetizadas purificada de células de levedura rotuladas com 4-thiouracil. Este método permite medir a síntese de mRNA desacoplada do decaimento do mRNA e, portanto, fornece uma medição precisa da transcrição do RNA polimerase II.

Saccharomyces cerevisiae Metabólica de rotulagem com 4-thiouracil e a quantificação dos recém sintetizado mRNA como um Proxy para a RNA polimerase II atividade

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

A principal vantagem desta técnica é que ela reflete a atividade de polimerase II do RNA medindo mRNA recém-sintetizado que não são influenciados pela degradação do RNA. Este protocolo foi originalmente descrito usando hibridização de microarray, mas pode ser facilmente adotado para sequenciamento de alta duração de mRNA recém-transcrito. Demonstrando esse procedimento estará Tiago Baptista, ex-aluno de pós-graduação do nosso laboratório.Depois de inocular as células S.cerevisiae, cresça-as durante a noite a 30 graus Celsius com agitação constante a 150 RPM. No dia seguinte, meça a densidade óptica em 600 nanômetros. Diluir a cultura para um OD600 de aproximadamente 0,1 em 100 mililitros de meio YPD.Cresça as células até que o OD600 esteja em torno de 0,8. Depois disso, meça o OD600 da cultura S.pombe da noite para o dia. Diluir esta cultura para um OD600 de aproximadamente 0,1 em 500 mililitros de meio YAS e deixá-lo crescer até que o OD600 seja aproximadamente 0,8.Primeiro, prepare uma nova solução de dois molares de quatro tiocral. Mantenha a solução preparada à temperatura ambiente e protegida da luz. Adicione a solução de quatro tioracil às culturas S.cerevisiae e S.pombe de tal forma que a concentração final seja de cinco mililitros.Incubar as culturas S.cerevisiae e S.pombe a 30 graus Celsius e 32 graus Celsius, respectivamente, com agitação constante por seis minutos. Depois disso, remova uma pequena alíquota de cada cultura e conte as células usando um contador automático de células ou uma câmara de Neubauer. Centrífuga a 2.500 vezes g e quatro graus Celsius por cinco minutos para coletar as células.Descarte o supernasce e lave as células com gelo frio uma vez PBS. Centrifugar novamente a 2.500 vezes g e quatro graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, resuspense as células em cinco mililitros de gelo frio uma vez PBS.Misture as células S.cerevisiae e S.pombe a uma proporção de três para um. Centrifugar as amostras mistas a 2.500 vezes g e quatro graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, remova o PBS e congele as células em nitrogênio líquido.Armazene a amostra a 80 graus Celsius negativo até estar pronto para usar. Quando estiver pronto para prosseguir, descongele as células no gelo por aproximadamente 20 a 30 minutos. Use um kit de extração de RNA de levedura adaptado para extrair o RNA conforme descrito no protocolo de texto.Depois disso, transfira o cartucho do filtro para o tubo de coleta final. Elute o RNA com 50 microliters de água livre de RNase tratada com DEPC que foi pré-aquecido a 100 graus Celsius. Centrifugar a 16.000 vezes por um minuto.Em seguida, use 50 microliters de água pré-aquecido tratado de RNase tratado com DEPC para elutar o RNA novamente para o mesmo tubo. Centrifugar a 16.000 vezes g por um minuto certificando-se de que todo o volume da amostra passou pelo filtro. Se não o fez, centrífuga novamente por um período maior de tempo.Quando terminar, quantifique e verifique a pureza da amostra utilizando o equipamento apropriado. Use água sem nuclease tratada com DEPC para ajustar a concentração do RNA adquirido anteriormente para dois miligramas por mililitro. Alíquota de 200 microgramas de RNA total e aqueça-o a 60 graus Celsius por 10 minutos.Imediatamente esfrie no gelo por dois minutos. Adicione 600 microliters de água sem RNase tratada com DEPC. Adicione 100 microliters de tampão de biotiningação e, em seguida, adicione 200 microliters de biotina HPDP.Se a solução biotina HPDP precipitar-se fora da solução, aumente o volume de DMSO ou DMF em até 40% do volume de reação, conforme descrito no protocolo de texto. Proteja a amostra da luz e incuba-a à temperatura ambiente com agitação suave por três horas. Depois disso, adicione um volume aproximadamente igual de clorofórmio aos tubos e misture vigorosamente.Centrifugar a 13.000 vezes g e quatro graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, transfira cuidadosamente a fase superior para novos dois tubos mililitros. Adicione uma quantidade de cinco cloreto de sódio molar igual a aproximadamente 1/10 do volume amostral.Em seguida, misture a amostra. Primeiro, aqueça o RNA biotinilado a 65 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, esfrie as amostras no gelo por cinco minutos.Adicione 100 microliters de contas magnéticas revestidas de Streptavidin ao RNA biotinilado. Incubar em temperatura ambiente com leve tremor por 90 minutos. Coloque as colunas fornecidas com o kit no suporte magnético.Em seguida, adicione 900 microliters de tampão de lavagem de temperatura ambiente às colunas. Aplique a mistura de 200 microliter e RNA nas colunas. Colete o fluxo em tubos de 1,5 mililitro e, em seguida, aplique-o novamente na mesma coluna magnética.Mantenha este fluxo, se necessário, pois representa a fração de RNA sem rótulo. Para iniciar a validação rt-qPCR das diferentes frações, primeiro sintetize o CDNA conforme descrito no texto. Em seguida, amplie o cDNA por qPCR em tempo real usando um protocolo padrão.Os níveis medidos de transcrições em frações purificadas de células do tipo selvagem cultivadas com e sem quatro tioracil confirmaram que este procedimento purifica especificamente o RNA rotulado. A análise da cepa delta spt20 revela que a quantidade de RNA de estado estável total é em grande parte inalterada ou é apenas levemente reduzida para os genes testados. Resultados semelhantes são vistos para cepas excluídas para bre1.No entanto, a análise do RNA recém-transcrito na cepa delta spt20 revela uma redução de três a cinco vezes na síntese de mRNA para todos os genes testados. Enquanto isso, a perda de bre1 leva a uma diminuição mais discreta, mas ainda visível. Após o esgotamento indutível do spt7, uma subunidade estrutural do complexo da saga, os níveis de mRNA recém-transcritos são reduzidos a uma medida semelhante à cepa de exclusão.Quando os níveis totais de RNA são medidos pela análise em todo o genoma, apenas alguns genes são vistos com seus níveis de expressão alterados após a exclusão do spt20, seja regulando ou regulando. No entanto, a análise do RNA recém-transcrito revela que os níveis de mais de 4.000 genes são significativamente reduzidos pelo menos duas vezes após a exclusão do spt20, o que sugere um efeito positivo global da saga na transcrição da polimerase II do RNA em leveduras brotantes. Embora este método possa fornecer insights na transcrição em Saccharomyces cerevisiae, ele só foi aplicado com pequenas variações ao usar este protocolo, poderíamos detectar uma diminuição global na síntese de mRNA que foi compensada por uma diminuição global na degradação do mRNA.

saccharomyces-cerevisiae-metabolic-labeling-with-4-thiouracil

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

RNA celular total fornece um modelo pobre para estudar mudanças de curto prazo na síntese de RNA e decadência, bem como a cinética de processamento de RNA. Aqui, descrevemos a marcação metabólica de RNA recentemente transcrito com 4-tiouridina seguido por biotinilação específica do tiol e a purificação do ARN recém transcritos que permitam ultrapassar estas limitações.

Marcação metabólica de RNA recém-transcrita para alta resolução Gene Expression Profiling de síntese de RNA, Processamento e Decay em cultura de células

Este protocolo descreve o procedimento experimental para a realização de...

Visualização e análise de moléculas de mRNA Usando Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Este artigo descreve o uso de uma luciferase de pirilampo-GFP proteína de fusão para...

Ensaios para Monitoramento juntamente redobramento de proteínas em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

O nível de estado estacionário de ARNm específicos é determinada pela velocidade de síntese e decaimento do ARNm. Taxas de degradação de mRNA genome-wide ou as taxas de decaimento de mRNAs específicos pode ser medido através da determinação de ARNm de semi-vida. Este protocolo centra-se na medição das taxas de decaimento de mRNA em Saccharomyces cerevisiae.

Medição do mRNA Decay Preços em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Usando<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Cepas

Este protocolo descreve a utilização combinatória de ChIP-seq, seq-4sU, RNA total-seq e Ribossoma profiling para linhas de células e as células primárias. Permite rastreamento de alterações em fator de transcrição vinculativas, novo de transcrição, processamento de RNA, volume de negócios e tradução ao longo do tempo e exibindo o curso geral dos acontecimentos nas células ativadas e/ou rápida mudança.

Análise em tempo real do fator de transcrição, ligação, transcrição, tradução e volume de negócios para exibir eventos globais durante a ativação celular

O uso do uracil swcnts a purificar sensitivamente e especificamente o RNA recentemente transcrito do fermento Saccharomyces cerevisiae.

Rotulagem metabólica extremamente rápida e específica do RNA in vivo com 4-Thiouracil (Ers4tU)

O genoma mitocondrial da levedura de Baker codifica oito polipeptídeos. O objetivo do protocolo atual é rotular todos eles e, posteriormente, visualizá-los como bandas separadas.

Rotulagem e Visualização de Produtos de Expressão do Genoma Mitocondrial no Saccharomyces cerevisiae de Levedura de Baker

Aqui, é apresentado um protocolo para a rotulagem metabólica da levedura com ácido acético de 14C, que é acoplado à cromatografia de camada fina para a separação de lipídios neutros.

Análise da Síntese Lipídica Neutra em Saccharomyces cerevisiae por Rotulagem Metabólica e Cromatografia de Camada Fina

Descrevemos dois protocolos complementares para determinar com precisão a duração da fase S em S. cerevisiae usando EdU, um análogo da timidina, que é incorporado in vivo e detectado usando a química Click por microscopia e citometria de fluxo. Ele permite a fácil caracterização da duração da replicação do DNA e defeitos de replicação negligenciados em mutantes.

Determinação da Duração da Fase S Usando a Incorporação de 5-Etil-2'-desoxiuridina em Saccharomyces cerevisiae

A estrutura secundária do RNA tem sido observada principalmente em RNA maduro com métodos de sondagem estrutural. O sequenciamento co-transcricional de Rastreamento de Estruturas (CoSTseq) unifica o funcionamento nuclear, que tem sido usado para estudar a posição da polimerase em RNA nascente, com sondagem estrutural. Assim, o CoSTseq permite a observação da estrutura secundária do RNA em RNA sob transcrição ativa.

Análise Comparativa da Estrutura de RNA de Transcritos Nascentes e Maduros em Saccharomyces cerevisiae

Aprenda a quantificar mRNA recém-sintetizado em Saccharomyces cerevisiae usando rotulagem com 4-tiouracil. Este método permite medir com precisão a atividade da RNA polimerase II, separando a síntese da degradação do RNA.

Saccharomyces cerevisiae Metabólica de rotulagem com 4-thiouracil e a quantificação dos recém sintetizado mRNA como um Proxy para a RNA polimerase II atividade (Vídeo) | JoVE Journal

Saccharomyces cerevisiae Metabólica de rotulagem com 4-thiouracil e a quantificação dos recém sintetizado mRNA como um Proxy para a RNA polimerase II atividade

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