Name: Doença de Charcot-Marie-Tooth In Vitro de modelagem por Transfecting Mouse motoneurônios primários (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Aprenda a isolar e transfectar motoneurônios primários de camundongos para modelar doenças neurodegenerativas como Charcot-Marie-Tooth. Este método enriquece culturas celulares e permite estudar mecanismos patológicos in vitro.

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Gostaríamos de agradecer a "Association pour le développement de la neurogénétique" para comunhão e AFM-Teleton do Dr. Jacquier seu apoio através do plano estratégico de MyoNeurAlp. Também gostaríamos de agradecer o Dr. Chris Henderson, Dr. William Camu, Dr. Brigitte Pettmann, Dr. Cedric Raoul e Dr. Georg Haase, que participaram de desenvolver e melhorar a técnica e difundir seus conhecimentos.

Todos os procedimentos que envolvam animais foram aceites pelo Comité de ético da instituição.
1. preparação da solução
<ol><li>Prepare-se 10 mL de 4% de que BSA diálise no meio de L-15.<ol>
<li>Dissolva o pó de albumina de soro bovino em 4% (p/v) em 10 mL de meio de L-15.</li>
		<li>Adicione a solução para uma gaveta de diálise de 20 mL com um disco de corte 20 kDa. Dialize contra 500 mL do meio de L-15 por 3 dias sob agitação a 4 ° C. Altere o meio de L-15 todos os dias.</li>
		<li>Filtre a solução através de um 0,22 µm membrana e alíquota em tubos de 15 mL. Armazenar os tubos a-20 ° C. Nota: Este protocolo utiliza as seguintes referências: cru sem modificações L-15 médio = L-15 médio, meio ácido L-15 = pH L-15 e meio L-15 básico = bicarbonato L-15.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare 200 mL de pH L-15.<ol>
<li>Ajustar o pH do meio L-15: primeiro, encha um frasco de lavagem com alguns pedaços de gelo seco. Injetar gás (CO2) no meio de L-15, até que a cor se laranja (~ pressões pH 6,4 e ~ 40). O pH pode também ser ajustado com um medidor de pH padrão.</li>
		<li>Filtro de médio porte e um 0,22 µm membrana e loja a 4 ° C por um mês.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare 100 mL de bicarbonato de L-15.<ol>
<li>Adicionar 2,5 mL de bicarbonato de sódio de 7% a 97,5 mL do meio de L-15 e armazenar a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare os suplementos de IPCS (Selenito de Conalbumin de Putrescin de insulina).<ol>
<li>Dissolva 2,5 mg de insulina em 0,5 mL de 0.1 M HCl. Add 4,5 mL de água bidestilada.</li>
		<li>Dissolva 8 mg de putrescina em 5 mL de tampão fosfato salino (PBS).</li>
		<li>Dissolva 100 mg de conalbumin em 10 mL de PBS.</li>
		<li>Dissolver 1 mg de Selenito de sódio em 19,3 mL de água, ajustar o pH para 7,4 e diluir a solução 10-fold.</li>
		<li>Combinam-se 1 mL de solução de insulina, 1ml de solução de putrescina, 1 mL de conalbumin e 0,1 mL de solução de Selenito de sódio para obter 3,1 mL da solução de suplemento de IPCS. Armazenar a solução a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare uma solução de progesterona de 0,02 mM.<ol>
<li>Dissolva 1 mg de progesterona em 1,6 mL de etanol a 80%.</li>
		<li>Diluir a solução 100 vezes em 100% de etanol e armazená-lo a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare 100 mL de meio de L-15 completo.<ol>
<li>Adicione 1,8 mL de solução de D-glicose (200 mg/mL) para 92 mL de pH L-15 para obter uma concentração final de 3,5 mg/mL de glicose.</li>
		<li>Combinar a 1 mL de 100 x penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL), 2 mL de soro de cavalo inactivados por calor, 3,1 mL da mistura IPCS e 0,1 mL de solução de progesterona (2 x 10-5 M).</li>
		<li>Filtrar o meio numa membrana de 0,22 µm e armazená-lo em 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare-se 5 mL da solução de gradiente de densidade (concentração final de 5,5%) por experiência.<ol>
<li>Adicionar 476 µ l do meio gradiente de densidade 60% comercial 4524 µ l de L-15 (se possível, sem fenol vermelho para aumentar o contraste visual no período do intérfase; razão de diluição de 1:10. 5).</li>
		<li>Armazenar a solução a 4 ° C por 2 semanas ou congelar a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare-se 10 mL de meio de cultura.<ol>
<li>Adicione 200 µ l de meio de suplemento de 9,6 mL de meio de cultura celular de neurônio.</li>
		<li>Adicione 200 µ l de soro de cavalo inactivadas pelo calor (que tende a diferenciar a célula glial precursores e obras contra proliferação) de 25 µ l de glutamina e 10 µ l de 2-Mercaptoetanol.</li>
		<li>Os meios de filtro através de um filtro de 0,22 µm.</li>
		<li>Adicionar os seguintes fatores neurotróficos: fator neurotrófico ciliar (CNTF) em uma concentração final de 10 ng/mL e fator de neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e células gliais derivada o fator neurotrophic (GDNF) em concentrações finais de 1 ng/mL.</li>
		<li>Armazenar a mídia a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare 50 mL de mídia de dissecação.<ol>
<li>Adicionem 47,05 mL de HBSS 2,25 mL de glicose (200 mg/mL). Adicione 700 µ l de 1m HEPES pH 7,4. Armazenar a mídia a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare uma solução PFA 4%.<ol>
<li>Dissolva 20 g de PFA em 500 mL de PBS.</li>
		<li>Sob uma capa de química, aquecer a solução a 60 ° C e adicionar algumas gotas de 1 M de NaOH até que a solução torna-se claro.</li>
		<li>Filtrar a solução através de um filtro de papel e ajustar o pH para 7.2. Armazená-lo a-20 ° C. Nota: Como alternativa, outras soluções comerciais de PFA podem ser usadas e diluídas a 4% em PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Limpar as ferramentas de dissecação, incluindo a pinça, tesoura e pratos do silicone com etanol a 70% antes do uso e com sabão e água limpa após o uso.</li>
</ol>2. revestimento do prato poli-ornitina/laminina (Po/L)
Nota: Volumes são adaptados para revestir uma placa de 24.
<ol><li>Se necessário, colocar uma lamela de 12mm estéril no poço.</li>
	<li>Revestimento de poços com 500 µ l de 10 µ g/mL poli-L-ornitina solução dissolvida em água.</li>
	<li>Deixe os poços contentar 1h à temperatura ambiente.</li>
	<li>Remover a solução de poli-L-ornitina e secar ao ar durante 30 min.</li>
	<li>Revestimento dos poços durante a noite a 37 ° C, com 500 µ l de 3 µ g/mL laminina em bicarbonato L-15. Nota: Poços podem ser armazenados a 37 ° C por 7 dias na incubadora. Para incubação do tempo, adicionar PBS estéril entre os poços pode ajudar a evitar a evaporação média.</li>
</ol>3. dissecação
<ol><li>Sacrifica um rato grávido quando os embriões estão em fase embrionária, E12.5. Limpe a barriga com etanol a 70%.</li>
	<li>Remover o útero cortando os dois ovidutos e o vagina e colocá-lo em uma placa de Petri preenchida com PBS frio (sem o Ca2 + Mg2 +).</li>
	<li>Coletar todos os embriões e transferí-los para fresco, frio PBS (sem o Ca2 + Mg2 +) em uma placa de Petri.</li>
	<li>Coloque um embrião em um prato cheio de mídia de dissecação (com HBSS, glicose de 4,5 g/L e 7 mM HEPES pH 7,4) e revestido com silicone. Nota: Dissecação do embrião é realizada sob um microscópio usando uma tesoura e pinça limpa bem. Como alternativa, um prato de Petri regular sem silicone pode ser usado para dissecação.</li>
	<li>Retire a cabeça, cauda e vísceras, usando fórceps como tesouras.</li>
	<li>Manter o embrião com a barriga contra o silicone com fórceps.</li>
	<li>Com um segundo par de pinças, insira uma das pontas do canal central da medula espinhal rostral.</li>
	<li>Feche a pinça para rasgar o tecido dorsal alguns milímetros.</li>
	<li>Repita esta operação em direção ao lado caudal até a medula espinhal inteira está aberta (figura 1B).</li>
	<li>Retire a parte rostral da medula espinhal (tronco cerebral) do corpo.</li>
	<li>Vire o embrião para manter a medula espinhal aberta contra o silicone.</li>
	<li>Aperte a parte rostral da medula espinhal... e puxe o embrião pela cabeça para extrair a medula espinhal. Nota: Meninges e gânglios da raiz dorsal (DRGs) devem permanecer anexados para o embrião. Caso contrário, cuidadosamente afastar qualquer restantes meninges e DRGs ainda presas à medula espinhal. Neste passo, DRGs também poderiam ser coletadas para cultura de neurônio sensíveis (ver discussão).</li>
	<li>Achate a medula espinhal em silicone e remover a metade dorsal da medula por corte ao longo do meio de cada lado usando um bisturi. Corte a parte do meio em 10 pedaços usando um bisturi e transferir as peças para um novo tubo.</li>
</ol>4. suspensão de células de medula de
<ol><li>Repita este procedimento de dissecação para 6 a 8 espinais.</li>
	<li>Deixa a medula espinhal peças coletar no fundo do tubo e substituir o HBSS com 1 mL de meio de presunto-F10.</li>
	<li>Adicione 10 µ l de tripsina (2,5% p/v; concentração final 0.025%). Incubar o tubo durante 10 minutos a 37 ° C.</li>
	<li>Para parar a digestão enzimática, transferi os fragmentos para um novo tubo de 15 mL contendo 800 µ l de meio L-15 completo, 100 µ l de 4% (p/v) BSA e 100 µ l de DNase (1 mg/mL em meio de L-15).</li>
	<li>Triture duas vezes por aspirar 1 mL com uma pipeta P1000. Deixe os fragmentos se contentar com 2 min. recolher o sobrenadante em um tubo 15 mL.</li>
	<li>Aos fragmentos, adicione 900 µ l de meio L-15 completo, 100 µ l de 4% (p/v) BSA e 100 µ l de DNase (1 mg/mL em meio de L-15).</li>
	<li>Triture 6 vezes por aspirar 1 mL com uma pipeta P1000. Deixe os fragmentos se contentar com 2 min. Adicionar o sobrenadante no tubo de 15 mL obtido na etapa 4.5.</li>
	<li>Aos fragmentos, adicione 900 µ l de meio L-15 completo, 100 µ l de 4% (p/v) BSA e 100 µ l de DNase (1 mg/mL em meio de L-15).</li>
	<li>Triture 10 vezes por aspirar 1 mL com uma pipeta P1000. Deixe os fragmentos se contentar com 2 min. Adicionar o sobrenadante no tubo de 15 mL obtido na etapa 4.5. Prossiga com o sobrenadante.</li>
	<li>Usando uma pipeta P1000, coloque delicadamente um coxim de 4% (p/v) 2 mL BSA na parte inferior do tubo de sobrenadante. Centrifugar a 470 x g durante 5 min.</li>
	<li>Remover o sobrenadante e ressuspender as células com 2 mL de meio de L-15 completo.</li>
</ol>5. MN enriquecimento pela densidade gradiente
<ol><li>Dividi a suspensão de células em dois tubos de 15 mL (1 mL cada uma). Em seguida, adicione 2 mL de meio de L-15 completo. Se começar com 6 embriões, uso o equivalente a 3 embriões pelo tubo em 3 mL de meio.</li>
	<li>Adicione 2 mL de solução de gradiente de densidade adicionando lentamente a solução no fundo de cada tubo para obter uma interface afiada.</li>
	<li>Centrifugar a 830 x g durante 15 minutos à temperatura ambiente. Após esta etapa, pequenas células devem ser na parte inferior do tubo, que convém células grandes como MNs na interface de solução/médio gradiente de densidade.</li>
	<li>Coletar as células na interface por aspiração 1 ou 2 mL e transfira para um tubo 15 mL. Ajuste o volume para 10ml com médias de pH L-15.</li>
	<li>Adicione 2 mL da almofada da BSA 4% para o fundo do tubo e centrifugar 470 x g por 5 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Remover o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 3 mL de meio de L-15 completo.</li>
	<li>Repita a etapa 5.5.</li>
	<li>Remover o sobrenadante e ressuspender as células em 2 mL de meio de cultura completo. Conte o número de telemóvel e viabilidade sob um microscópio de contraste de fase com um hemocytometer. Nota: Para 6 espinais, o número de células está previsto para ser em torno de 1 x 105 MNs.</li>
</ol>6. MN cultura
<ol><li>Dilua os MNs para a densidade adequada, normalmente de 5.000 a 10.000 células em 500 µ l do meio de cultura por bem em uma placa de 24. Nota: Densidade de semeadura é em torno de 30.000 e 1.500 células para placas de 96 e 6 --bem, respectivamente.</li>
	<li>Remova a solução de laminina com um P1000.</li>
	<li>Transferi imediatamente os MNs diluídos em meio de cultura para as placas de revestimento para evitar a secagem.</li>
	<li>Incubar a cultura 2 dias a 37 ° C.</li>
</ol>7. Magnetofection de MNs
Nota: Nas etapas a seguir, as quantidades utilizadas são destinadas o transfeccao de um poço de uma placa de 24. Refira por favor o protocolo do fabricante para outro formato.
<ol><li>Para a preparação de DNA, resuspenda 1 µ g/ml de DNA 50 µ l de meio de cultura neuronal e vórtice para 5 s.</li>
	<li>Para a preparação do tubo do grânulo, resuspenda 1,5 µ l de grânulos em 50 µ l de meio de cultura neuronal.</li>
	<li>Adicionar a solução de grânulo de 50 µ l da solução de DNA de 50 µ l e incubar durante 20 min em temperatura ambiente (total volume = 100 µ l).</li>
	<li>Durante esta incubação, retire o poço que será transfected em 100 µ l de meio de cultura. Nota: Colocar a placa magnética na incubadora para aquecê-lo a 37 ° C.</li>
	<li>Transferir 100 µ l do mix DNA/pérola para o poço e incubar a placa de 20 a 30 min na placa magnética a 37 ° C.</li>
	<li>Espere pelo menos 24 h antes da detecção da expressão do cDNA.</li>
</ol>8. fixação e coloração
<ol><li>Lave a cultura 2 vezes com PBS.</li>
	<li>Incubar a cultura por 20 min em temperatura ambiente em 4% PFA/PBS.</li>
	<li>Lave a cultura 2 vezes com PBS.</li>
	<li>Incube a cultura em 500 µ l de tampão de bloqueio (PBS, BSA 4%, 2% de soro normal, 0,3% Triton X-100, glicina 0,1 M) por 1h à temperatura ambiente. Nota: Soro Normal deve ser proveniente da mesma espécie que o anticorpo secundário (por exemplo, soro de cabra Normal).</li>
	<li>Incube a cultura durante a noite a 4 ° C com anticorpo primário diluído em 250 µ l de tampão de bloqueio. Nota: por exemplo, TUJ1 é usado em 1/1000, SMI32 é usado em 1/1.000 e Lc3b é usado em 1/200.</li>
	<li>Lave a cultura 3 vezes com PBS.</li>
	<li>Incube a cultura com anticorpos secundarios conjugados fluoróforo diluídos em 250 µ l de tampão de bloqueio por 1 hora em temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave a cultura 3 vezes com PBS.</li>
	<li>Montagem em lâminas de vidro usando o meio de montagem.</li>
</ol>

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<li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Research Notes. 9, (2016).</li>
<li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+method+for+gene+delivery+into+mouse+dorsal+root+ganglia+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Highly efficient method for gene delivery into mouse dorsal root ganglia neurons.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8 (2), (2015).</li>
<li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity.</a> Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).</li>
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Os autores não têm nada para divulgar.

Um dos pontos críticos no presente protocolo é que os embriões de rato são dissecados em uma janela de tempo preciso durante o desenvolvimento (E12.5) para otimizar a quantidade de MNs obtidos no final. Além disso, para um rendimento ideal, a dissecação deve ser realizada pela manhã ou no início da tarde. Antes de E12.5 (por exemplo, em E11.5), a dissecação é difícil, principalmente no que tange a eliminação das meninges. Depois de E12.5, o número de MNs obtidos cai significativamente. Para controlar a fase embr...

Doenças neuromusculares englobam uma variedade de patologias clinicamente e geneticamente distintas que caracterizam-se pela alteração do músculo e/ou o sistema nervoso. Devido aos avanços nas tecnologias de sequenciamento, centenas de genes responsáveis por estas doenças raras foram identificadas durante a última década (lista disponível no centro de doença Neuromuscular, http://neuromuscular.wustl.edu/index.html). A variedade de mutações identificadas indica que diferentes mutações em um único gene podem causar diferentes fenótipos e doenças1,2,3 e que mutações em genes diferentes podem produzir fenótipos similares 4 , 5. neste contexto, há esforços para desenvolver modelos de celulares que podem se tornar poderosas ferramentas para analisar as consequências de mutação e mecanismos patológicos.
MNs espinhais tem grandes somas localizados nos cornos ventrais da medula espinhal, axônios longos de formulário de fibras musculares esqueléticas de destino e permitir movimentos voluntários através da liberação de acetilcolina na junção neuromuscular. Desde MNs são afetados por doenças neuromusculares como esclerose lateral amiotrófica, doença de Charcot-Marie-Tooth (CMT), e atrofia muscular espinhal, Dr. Henderson e colegas desenvolveram o primeiro protocolo6 permitidos para cultivo de in vitro MNs da coluna vertebral e a descoberta de neurotrophic factor GDNF7 (fator neurotrófico derivado de célula glial). Refinamentos técnicos desde então têm permitido para purificação mais precisa de MNs da coluna vertebral e seus subtipos usando FACS8, mas o enriquecimento por gradiente de densidade permanece poderosa e amplamente utilizado em laboratórios, atualmente trabalhando com MNs espinhais primários 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. posteriormente, também é possível obter um maior grau de purificação MN através de immunopanning, tirando proveito do marcador de superfície p75(NTR)15,16,17.
A medula espinhal contém diferentes subtipos de MNs cervicais, torácicas e lombares, bem como medianos e laterais motor as colunas que diferem entre sua localização no Corno anterior em um eixo dorso-ventral e entre os alvos que eles inervam8, 18. culturas primárias MN podem recuperar todos esses subtipos de MN em proporções fisiológicas. A principal limitação dessa técnica é o baixo número de MNs obtidos ao final do procedimento; na verdade, pode presumir-se obter em torno de 105 MNs de seis embriões, que é apropriada para a microscopia, mas limitando para experimentos de bioquímica. A realizar experimentos com mais padronizados subtipos e MNs abundantes (> 106 células), embrionárias MNs de células-tronco derivadas devem ser considerados18.
Transfection do selvagem-tipo/mutante transgenes ou knockdown genes endógenos em MNs primários é uma ferramenta rápida e útil para decifrar vias fisiopatológicas, especialmente quando modelos de rato não estão disponíveis. Magnetofection é uma técnica para transfecting os neurônios primários, semelhantes ao lipofection sem a neurotoxicidade relacionada. Além disso, transfecção pode ser executada em neurônios maduros depois de vários dias em vitro, ao contrário de técnicas baseadas em electroporation9. No entanto, uma desvantagem dessa técnica é que os grânulos ligam a ácidos nucleicos na cultura, causando barulho na rotulagem de DAPI. Infecção viral é provavelmente a técnica mais eficiente para MNs transfecting; no entanto, magnetofection não requer determinados procedimentos de segurança necessários para a produção viral e infecção celular.

<table><tbody><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prato de dissecação</td> de <td>silicone Instrumentação de sistemas vivos</td><td>DD-90-S-BLK-3PK</td><td>Sylgard</td></tr><tr><td>lamínula redonda</td><td>NeuVitro, vidro Knittel</td><td>GG-12-Pre</td><td>12 mm</td></tr><tr><td>Slide a Lyzer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>66030</td><td>20.000 MWCO ; 30 mL</td></tr><tr><td>Unidade de filtro</td><td>Filtros</td> de seringa estéril <td>Millipore SCGVU02RE</td><td></td></tr><tr><td>GP</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>placa de 4 poços</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>167063</td><td>Nunclon Delta pinça de placa tratada</td></tr><tr><td></td><td>FST por Dumont</td><td>11252-20</td><td>#5 pinça</td></tr><tr><td>tesoura</td><td>FST por Dumont</td><td>14060-10</td> bisturi <td>de tesoura fina</td></tr><tr><td></td><td>FST por Dumont</td><td>10035-20</td><td></td></tr><tr><td>bisturi</td> de lâmina curva <td>FST by Dumont</td><td>10316-14</td><td>bisturi de microfaca</td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Greiner</td><td>663102</td><td>&oslash; x h = 100 x 15 mm</td></tr><tr><td>Tubo de polipropileno de 15 mL</td><td>Papel</td> de filtro Falcon <td>352096</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Watman</td><td>1001125</td> circle, corrediça de câmara de vidro de <td>125 mm de diâmetro</td></tr><tr><td></td><td>Lab-Tek</td><td>154526</td><td>4 câmaras</td></tr><tr><td>Plasmídeo pCAGEN</td><td>Addgene</td><td>#11160</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Soluções e meios</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumina</td> <td>de soro bovinoSigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>L-15 médio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11415056</td><td></td></tr><tr><td>L-15 médio, sem fenol vermelho</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21083027</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>Putrescina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Conalbumina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7786</td><td></td></tr><tr><td>Selenito de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Progesterona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Poli-DL-Ornitina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8638</td><td></td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>tripsina 2,5%, 10x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>PBS sem Ca Mg</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190144</td><td>sem Mg2+ Ca2+</td></tr><tr><td>sodium bicarbonato</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25080094</td><td></td></tr><tr><td>Meio de cultura de células neuronais</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A3582901</td><td>Neurobasal Plus</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6648-500ML</td><td></td></tr><tr><td>HEPES tampão 1 M</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15630056</td><td></td></tr><tr><td>Densidade meio radiante</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td>Optiprep</td></tr><tr><td>suplemento médio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A3582801</td><td>B-27 Plus</td></tr><tr><td>Soro de cavalo inativado por calor</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina 200 mM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>penicilina/estreptomicina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td>10.000 U/mL</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo<</td><td>strong>Comentários</td></tr><tr><td>Immuno fluorescência</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS, 10x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>X0515</td><td>sem Mg2+ Ca2+</td></tr><tr><td>Paraformaldeído (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>441244</td><td></td></tr><tr><td>soro de cabra normal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6767</td><td></td></tr><tr><td>glicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Colina Acetil Transferase (CHAT)</td><td>Chemicon</td><td>Ab144P</td><td></td></tr><tr><td>Neurofilamento H não fosforilado (SMI32)</td><td>Biolegends</td><td>SMI-32P</td><td>IF em 1/1000</td></tr><tr><td>Ilhota-1</td><td>DSHB</td><td>40.2D6</td><td></td></tr><tr><td>Ilhota-2</td><td>DSHB</td><td>39.4D5</td><td></td></tr><tr><td>Hb9</td><td>DSHB</td><td>81.5C10</td><td></td></tr><tr><td>Meio de montagem Vectashield</td><td>Vector Lab</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Beta3 tubulina (clone Tuj1)</td><td>Biolegends</td><td>801201</td><td>IF a 1/1000</td></tr><tr><td>Lc3b</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#2775</td><td>IF a 1/200</td></tr></tbody></table>

doença de charcot-marie-tooth in vitro de modelagem por transfecting mouse motoneurônios primários

Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

Neurodegeneração de motoneurônios da coluna vertebral (MNs) está implicada em um grande espectro de doenças neurológicas, incluindo a esclerose lateral amiotrófica, doença de Charcot-Marie-Tooth e atrofia muscular espinhal, que são todos associados com atrofia muscular. Culturas primárias de MNs espinhais têm sido usadas amplamente para demonstrar o envolvimento de genes específicos em tais doenças e caracterizar as consequências celulares de suas mutações. Esta cultura de modelos um primário MN protocolo derivada do trabalho seminal de Henderson e colegas há mais de vinte anos. Primeiro, detalhamos um método de dissecar os cornos anteriores da medula espinhal de um embrião de rato e isolando os MNs de vizinhas células usando um gradiente de densidade. Em seguida, apresentamos uma nova forma de forma eficiente transfecting MNs com plasmídeo de expressão usando magnetofection. Finalmente, ilustramos como corrigir e delgados primário que MNS. usando mutações de Neurofilamento que causam a doença de Charcot-Marie-Tooth tipo 2, este protocolo demonstra uma abordagem qualitativa para expressar proteínas de interesse e estudar o seu envolvimento em Crescimento de MN, manutenção e sobrevivência.

Depois de 24 horas na cultura, motoneurônios (MNs) já devem mostrar significativo crescimento axonal (pelo menos 6 vezes mais do que o tamanho da soma). Nos dias seguintes, axônios devem continuar a crescer e exibir ramificação (Figura 2). Vai haver diferentes morfologias devido às especificidades do subtipo. Por exemplo, coluna mediana MNs que inervam músculos axiais têm axônios mais curtos e mais ramificados do que a coluna lateral motor MNs que inervam o m...

O objetivo desta técnica é preparar uma cultura altamente enriquecida de motoneurônios primários (MNs) de murino da medula espinhal. Para avaliar as consequências das mutações causadoras de doenças MN, descrevemos aqui o isolamento destes isolados MNs e seu transfeccao por magnetofection.

Doença de Charcot-Marie-Tooth In Vitro de modelagem por Transfecting Mouse motoneurônios primários

Neurodegeneration of spinal motoneurons (MNs) is implicated in a large spectrum of neurological disorders including amyotrophic lateral sclerosis, ...

Este método pode ajudar a abordar questões-chave na neurobiologia, como polaridade do neurônio motor, orientação do axônio, tráfico de axônio e mecanismos neurodegenerativos. A principal vantagem desta técnica é obter uma cultura de neurônio motor altamente enriquecida enquanto tomamos para expressar nossa proteína de knockdown por afeto minucioso. Para iniciar este procedimento, coloque um embrião em um prato de mídia de dissecção codificada com silício.Sob o microscópio, segure o embrião com o abdômen contra o silício com fórceps. Com o segundo par de fórceps, insira uma das pontas no canal central da medula espinhal rostrad. Em seguida, feche os fórceps para rasgar ligeiramente o tecido dorsal.Repita esta operação para o lado connell até que toda a medula espinhal seja aberta. Em seguida, posicione o embrião de modo que a medula espinhal aberta seja contra o silício. Posteriormente, despreze a parte rostrad da medula espinhal do corpo.Belisque a parte rostrad da medula espinhal, e puxe o embrião pela cabeça para extrair a medula espinhal. Retire cuidadosamente quaisquer meninges e DRGs restantes ainda ligados à medula espinhal. Achate a medula espinhal no silício e usando um bisturi, remova a metade dorsal da cordel cortando ao longo do meio de cada lado.Corte a parte do meio em dez pedaços, e transfira-as para um novo tubo. Para preparar a suspensão das células das medulas espinhais, colete as peças da medula espinhal na parte inferior do tubo. Substitua o HBSS por um mililitro de Ham F-10 médio e adicione dez microliters de trippsina.Incubar o tubo por dez minutos a 37 graus Celsius. Para parar a digestão enzimática, transfira os fragmentos para um novo tubo de 15 mililitros, contendo 800 microliters de meio L-15 completo, 100 microliters de 4%BSA e 100 microliters de DNAs e titulação, duas vezes. Deixe os fragmentos se contentarem por dois minutos antes de coletar o supernatante em um tubo fresco de 15 mililitros.Adicione suavemente dois mililitros de 4%BSA na parte inferior do tubo supernante. Centro fundir-o em 470 x gravidade por 5 minutos. Após 5 minutos, remova o supernasce e suspenda a paleta celular com 2 mililitros de meio L-15 completo.Para enriquecimento de motoneuron, divida a suspensão celular em dois tubos de 15 mililitros. Em seguida, adicione dois mililitros de meio L-15 PH a cada tubo. Se começar com seis embriões, use o equivalente a três embriões por tubo, e três mililitros de médio.Adicione lentamente 2 mililitros de solução de gradiência de densidade, ao fundo de cada tubo para obter uma interface afiada. Em seguida, centro fundi-lo em 830 x gravidade por 15 minutos em temperatura ambiente. Após esta etapa, as pequenas células devem estar na parte inferior do tubo, enquanto as grandes células - como o motoneuron - devem estar na solução de gradiente de densidade/interface média.Asperae 1 a 2 mililitros das células na interface e transferi-los para um tubo fresco de 15 mililitros. Ajuste o volume para dez mililitros com meio L-15 PH. Posteriormente, adicione dois mililitros da almofada 4%BSA ao fundo dos dois tubos.E o centro fusível a 470 x gravidade por 5 minutos em temperatura ambiente. Após 5 minutos, remova o supernasce e suspenda a paleta e 3 mililitros de meio L-15 completo. Repita a centrífuga a 470 x gravidade por 5 minutos em temperatura ambiente.Em seguida, remova o supernatante e suspenda novamente a paleta celular e dois mililitros de meio de cultura completa. Para cultivar neurônios motores, dilui-os para 5.000-10.000 células em 500 microliters de cultura média por poço em uma placa de 24 poços. Em seguida, remova a solução de laminás com a ponta de tubulação P-1.000.Transfira imediatamente os neurônios motores diluídos em meio de cultura. às placas de codificação para evitar a secagem. Para preparar o DNA, suspenda 1 micrograma de DNA em 50 microliters do meio de cultura neuronal.E vórtice por 5 segundos. Para preparar o tubo B, suspenda 1,5 microliters de contas em 50 microliters de meio de cultura neuronal. Adicione 50 microliters de solução de contas a 50 microliters de solução de DNA e incubar por 20 minutos em temperatura ambiente.Durante esta incubação, retire 100 microliters de meio cultural do poço que será transfeinado. Posteriormente, transfira 100 microliters da mistura de contas de DNA para cada poço. E incubar a placa de 24 poços, 20-30 minutos na placa magnética a 37 graus Celsius.Mostrado aqui, é a morfologia do neurônio modem revelada pela posição de cadeia pesada de neurofilamento não fosfoilado endógeno após quatro dias de cultura. Nestas imagens, mostram a morfologia do neurônio modem após quatro dias in vitro e transfeccionado para o gene trans EGFP por magnetofecção no segundo dia. Os neurônios do lema foram contra-manchados com o marcador SMI-32 ou o marcador pan-neuro TUJ-1 e as setas indicam a soma dos neurônios.Estas são suas imagens confocais de neurônios motores magneto fected, expressando construções egfp nefh mutantes ou mutantes e manchadas para seu marcador autofágico LC-3B. Setas mostram os agregados mutantes de proteína EGFP NEFH que também são positivos LC-3B Após este procedimento, montoholda curcha pode ser analisada por microscopia de vídeo para visualizar o tráfico de axônio e adicionar alguma orientação. Após seu desenvolvimento inicial para abordar questões fundamentais na biologia neural, essa técnica também se mostra uma poderosa ferramenta para explorar mecanismos fisiopológicos que implicam o espectro de distúrbios motoneuron, como doença da síndrome do choque tóxico, esclerose lateral trófica samuel ou atrofia muscular espinhal.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Células musculares cultivadas são um modelo inadequado para recapitular músculo...

A Unidade Funcional Motor na placa de cultura: Co-cultivo de explantes da Medula Espinhal e as células musculares

Astrócitos fenotipicamente selvagens e células-tronco neurais colhidas de camundongos modificados com alelos oncogênicos condicionais floxed e transformados por meio de recombinação viral mediada por Cre podem ser usados para modelar a patogênese do astrocitoma in vitro e in vivo por injeção ortotópica de células transformadas em cérebros de irmãos de ninhada singênicos e imunocompetentes.

Modelagem astrocitoma Patogênese In Vitro E In Vivo Usando Cortical astrócitos ou células-tronco neurais de condicional, Geneticamente Modificadas Ratos

Neste protocolo, apresentamos os procedimentos para o estabelecimento de modelos de mioblastos distrofia miotônica 1, incluindo otimizado manutenção C2C12 celular, transfecção gene / transdução e diferenciação dos miócitos.

Modelando Myotonic distrofia 1 em células C2C12 de mioblastos

Este protocolo descreve um método simples para isolar e neurônios de grânulo cerebral principal do rato (CGNs) de filhotes de 6-7 dias de idade, transdução eficiente de CGNs para perda e ganho de estudos de função, de cultivo e modelagem excitotoxicidade neuronal induzida por NMDA, morte celular baixo potássio-induzida, danos ao DNA e estresse oxidativo usando o mesmo modelo de cultura.

Modelagem de morte Neuronal e a degeneração no Mouse grânulo cerebelar primária de neurônios

A medição da condução nervosa é uma ferramenta útil para avaliar modelos de rato de neurodegeneração, mas frequentemente é aplicado apenas para estimular o nervo ciático em membros traseiros. Aqui, descrevemos uma técnica para medir os compostos muscular potencial de ação (CMAP) na vivo dos músculos do membro anterior de rato inervados pelo plexo braquial.

Na Vivo Eletrofisiológica medição do potencial de ação muscular composto de membros dianteiros em modelos de Mouse de degeneração do neurônio Motor

Este protocolo permite a conversão rápida e eficiente de pilhas de haste pluripotentes induzidas em neurônios de motor com uma identidade espinal ou craniana, pela expressão ectópica de fatores da transcrição dos vetores induzível de piggybac.

Conversão de pilhas de haste pluripotentes induzidas humanas (iPSCs) em neurônios de motor espinal e craniano funcionais usando vetores de PiggyBac

Este trabalho apresenta um protocolo para produzir culturas celulares homogêneas de neurônios motores oculomotores primários, trochlear e espinhais. Essas culturas podem ser usadas para análises comparativas das características morfológicas, celulares, moleculares e eletrofisiológicas dos neurônios motores oculares e espinhais.

Isolamento e Cultura dos neurônios oculomotores, trochlear e motores espinhais de pré-natal Islmn:GFP Ratos Transgênicos

Aqui fornecemos um protocolo para gerar NMJs in vitro a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs). Este método pode induzir NMJs com morfologia madura e função em 1 mês em um único poço. Os NMJs resultantes poderiam potencialmente ser usados para modelar doenças relacionadas, para estudar mecanismos patológicos ou para rastrear compostos medicamentosos para terapia.

Junção neuromuscular in vitro induzida de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos

Descrevemos um método para gerar unidades motoras humanas em dispositivos microfluidos comercialmente disponíveis, co-culminando neurônios motores pluripotentes induzidos por células-tronco com miótubos primários derivados do mesoangioblast, resultando na formação de junções neuromusculares funcionalmente ativas.

Geração de Unidades Motoras Humanas com Junções Neuromusculares Funcionais em Dispositivos Microfluidos

Descrevemos um sistema de imagem reprodutível, automatizado e imparcial para caracterizar a função de junção neuromuscular usando tecido muscular esquelético projetado por humanos e motoneurons optogenéticos. Este sistema permite a quantificação funcional da conectividade neuromuscular ao longo do tempo e detecta a função neuromuscular diminuída causada por neurotoxinas e soro do paciente myasthenia gravis.

Engenharia e Caracterização de um Modelo Optogenético da Junção Neuromuscular Humana

A utilização de um modelo de tumor autóctone imunocompetente conduzido por mutações comuns de pacientes para testes pré-clínicos é fundamental para testes imunoterapêuticos. Este protocolo descreve um método para gerar modelos de tumor cerebral em camundongos usando a entrega baseada em eletroporação de DNA plasmidial que representa mutações comuns em pacientes, fornecendo assim um modelo de camundongo preciso, reprodutível e consistente.

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Aprenda a isolar e transfectar motoneurônios primários de camundongos para modelar doenças neurodegenerativas como Charcot-Marie-Tooth. Este método enriquece culturas celulares e permite estudar mecanismos patológicos in vitro.

Doença de Charcot-Marie-Tooth In Vitro de modelagem por Transfecting Mouse motoneurônios primários

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