Name: Uma nova técnica cirúrgica como fundamento na Vivo parcial engenharia fígado de rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 27 s
Description: Aprenda uma técnica cirúrgica inovadora para perfusão de lobo hepático in vivo em ratos. Este método estabelece as bases para pesquisas futuras em engenharia hepática parcial e regeneração de órgãos.

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Os autores gostaria de agradecer Jens Geiling do Instituto de anatomia eu, Hospital da Universidade de Jena, para produzir os desenhos esquemáticos da anatomia do fígado de ratos.

A habitação e todos os procedimentos realizados foram em conformidade com a legislação de bem-estar animal alemão. Todos gaze, coberta de roupas e instrumentos cirúrgicos são autoclavados e preparado antes da operação. Todos os procedimentos são realizados sob condições estéreis.
1. preparação do rato para o procedimento cirúrgico
<ol><li>Coloque o rato em uma câmara de indução e anestesiar o rato com isoflurano 4% vaporizados e oxigênio a 100% a 0,5 L/min por cerca de 3 min, até que o rato é completamente anestesiado.</li>
	<li>Leve o rato fora da câmara de indução e medir o peso do seu corpo.</li>
	<li>Raspe a pele da região cirúrgica no abdômen.</li>
	<li>Coloque a animal de volta para a câmara de isoflurano para um adicional 2 min para aprofundar a anestesia.</li>
	<li>Coloque o rato em cima da mesa de operação na posição supina.</li>
	<li>Corrigir a máscara de anestesia a região da boca do rato... e manter o animal anestesiado com um fluxo contínuo de gás de 2% vaporizados isoflurano e 100% de oxigênio em uma taxa de fluxo de 0,5 L/min.</li>
	<li>Corrigi os membros com pedaços de fita.</li>
	<li>Aplique pomada de veterinário em ambos os olhos para evitar ressecamento.</li>
	<li>Administrar a buprenorfina 0,05 mg/kg por via subcutânea, para aliviar a dor durante o período de operação.</li>
	<li>Desinfecte o campo cirúrgico do abdome com 3 rodadas de tintura de iodo, seguido por 2 rodadas de álcool a 70%.</li>
	<li>Lugar esterilizado gaze ao redor da área onde será feita a incisão para deixar apenas o campo de operação do abdômen exposto.</li>
	<li>Proceda para executar a operação quando o reflexo de retirada do dedo do pé-pitada do rato está ausente.</li>
</ol>2. laparotomia do rato
<ol><li>Faça uma incisão da pele e o músculo abdominal transversal usando uma tesoura e um Coagulador elétrica.</li>
	<li>Corrigir e puxe o processo xifoide em direção a cabeça usando uma sutura de polipropileno 4-0. Nota: Atenção ao levantar-se acima do processo xifoide verticalmente para expor melhor o fígado, mas agir com precaução para evitar asfixia e restrição respiratória severa.</li>
	<li>Abra a cavidade peritoneal puxando ambos os lados das paredes abdominais na direcção da cabeça com dois ganchos subcostal para expor o fígado.</li>
	<li>Cobrir o duodeno e o intestino na cavidade abdominal com uma gaze umedecida para evitar a secagem.</li>
	<li>Levante os lobos esquerdos e direito medianos usando uma gaze umedecida e segurá-los contra o tórax para expor melhor o Hilo do fígado.</li>
	<li>Coloque o rato sob um estereomicroscópio (ampliação de X 8).</li>
	<li>Larga solução salina morna no abdómen e na superfície do fígado e intestinos cada vários minutos, para evitar a secagem durante todo o processo.</li>
</ol>3. estabelecimento de uma passagem de Bypass dentro o lobo Lateral esquerdo
<ol><li>Dissecar a veia porta esquerda e ligá-lo com uma sutura de seda 6-0 na base (Figura 2A).</li>
	<li>Bloquear a artéria hepática esquerda, ducto biliar esquerdo junto com a veia portal mediana esquerda, artéria hepática mediana esquerda e ducto biliar mediano esquerdo com micro pinças para evitar um fluxo do perfusato ao lóbulo mediano esquerdo (Figura 2B).</li>
	<li>Separe o lóbulo lateral esquerdo cortando os ligamentos circundantes do lobo com micro tesouras.</li>
	<li>Bloquear a veia hepática lateral esquerda, fixando-se na base do lobo lateral esquerdo com pinças micro (Figura 2). Nota: Certifique-se não fixar a veia porta esquerda também por engano.</li>
	<li>Mosquito de uso grampos para prender a ligadura da veia portal esquerda e manter a veia com tensão adequada para canulação mais tarde.</li>
	<li>Cuidadosamente, fazer uma incisão na parede frontal da veia portal esquerda por puncioná-la com um cateter de agulha-moradia-24G ( Figura 3A). Nota: Para criar um bypass, são necessários pontos de acesso vascular na veia porta esquerda e a veia hepática esquerda. Para esta etapa, é preferido para criar o acesso vascular por perfurar os vasos com uma agulha, ao invés de fazer uma incisão maior com uma tesoura. Isso reduz o risco de sangramento e posteriormente estenose.</li>
	<li>Retirar o cateter e tire a agulha do cateter para obter um cateter 24G-agulha-livre.</li>
	<li>Conectar o cateter a um tubo de perfusão, de que o ponto de extremidade se conecta a uma seringa de 20 mL com 15 mL de 40 U/mL heparinizada em uma bomba de perfusão.</li>
	<li>Ligue a bomba para perfusing o tubo para expulsar o ar para fora do tubo e o cateter com agulha-livre.</li>
	<li>Desligue a bomba de perfusão.</li>
	<li>Mais uma vez, inserir o cateter com agulha-livre a veia portal esquerda através da incisão perfurada na veia (Figura 3B). Nota: Devido ao fato de, há um espaço muito limitado para a fixação do cateter, neste momento não é fixo. Portanto, o cirurgião deve tomar cuidado para evitar o deslocamento do cateter canulado.</li>
	<li>Cuidadosamente, fazer uma outra incisão na margem da região exposta da veia hepática lateral esquerda por puncioná-la com um cateter de agulha-moradia de 22 ou 24-G (Figura 3). Nota: É recomendável que o cateter seja ligeiramente menor do que o navio.</li>
	<li>Retirar o cateter e tire a agulha do cateter para obter um cateter livre de agulha 22-G.</li>
	<li>Ligue a bomba de perfusão para perfundir o soro fisiológico heparinizado para o lobo lateral esquerdo através do 24-G canulado livre de agulha cateter da veia portal à esquerda, a uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min.</li>
	<li>Utilize gaze seca para absorver o líquido resíduos out-fluindo ao redor da área de incisão da veia hepática lateral esquerda.</li>
	<li>Canule a veia hepática lateral esquerda através da incisão perfurada da veia com cateter de agulha-livre de 22-G, para gerar uma saída de fluido para minimizar a contaminação abdominal (Figura 3D). Nota: É tecnicamente difícil fixar o cateter canulado no lóbulo do fígado. Portanto, o cirurgião deve prestar atenção para evitar o deslocamento do cateter. Como alternativa, sem canulação da veia hepática lateral esquerda com um cateter, resíduos líquidos também podem ser absorvidos na região da incisão da veia apenas com uma gaze seca.</li>
	<li>Manter perfusing o lobo lateral esquerdo com soro fisiológico heparinizado para cerca de 20 min (grupo 1) e depois só com soro fisiológico para 2h, 3h ou 4h (grupo 2, grupo 3 e grupo 4, respectivamente).</li>
	<li>Desligue a bomba parar a perfusão.</li>
</ol>4. fisiológica reperfusão do lóbulo Lateral esquerdo
<ol><li>Tire os dois cateteres de veia porta esquerda e veia hepática lateral esquerda.</li>
	<li>Feche a incisão da veia portal esquerda com uma sutura de poliamida 11-0.</li>
	<li>Feche a incisão da veia hepática esquerda lateral com uma sutura de poliamida 11-0 também.</li>
	<li>Desprenda a veia hepática lateral esquerda.</li>
	<li>Desprenda a veia portal mediana esquerda, esquerdo ducto biliar e artéria hepática esquerda.</li>
	<li>Corte a ligadura na veia porta esquerda para reabrir a veia.</li>
</ol>5. fechamento da parede Abdominal
<ol><li>Feche a camada muscular da parede abdominal por sutura interrompida com uma sutura absorvível Poliglactina 910 de 4-0.</li>
	<li>Feche a camada de pele da parede abdominal por sutura interrompida com uma sutura absorvível polydioxanone de 4-0.</li>
	<li>Depois de fechar o abdome, Desinfecte a incisão da pele com álcool a 70%.</li>
</ol>6. tratamento pós-operatório do rato
<ol><li>Coloque o animal em uma almofada de aquecimento para a reanimação por cerca de 10 min e em seguida, colocá-lo em uma gaiola nova.</li>
	<li>Administrar a buprenorfina 0,05 mg/kg por via subcutânea, 2 x por dia para um d 3 consecutivo no pós-operatório liberar a dor.</li>
</ol>

<ol><li>Kim, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OPTN+%2F+SRTR+2016+Annula+Data+Report%3A+Liver%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation.+Suppl%22%5BJournal%5D)">OPTN / SRTR 2016 Annula Data Report: Liver.</a> American Journal of Transplantation. Suppl. 1, 172-253 (2018).</li>
<li>Palakkan, A. A., Hay, D. C., Anil Kumar, P. R., Kumary, T. V., Ross, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+tissue+engineering+and+cell+sources%3A+issues+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+International%22%5BJournal%5D)">Liver tissue engineering and cell sources: issues and challenges.</a> Liver International. 33, 666-676 (2013).</li>
<li>Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix%3A+not+just+pretty+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix: not just pretty fibrils.</a> Science. 326, 1216-1219 (2009).</li>
<li>Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extracellular+matrix+microarray+for+probing+cellular+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation.</a> Nature Methods. 2, 119-125 (2005).</li>
<li>Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+matrix+stiffness+in+regulating+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The role of matrix stiffness in regulating cell behavior.</a> Hepatology. 47, 1394-1400 (2008).</li>
<li>Ren, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+two+decellularization+methods+in+the+development+of+a+whole-organ+decellularized+rat+liver+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+International%22%5BJournal%5D)">Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold.</a> Liver International. 33, 448-458 (2013).</li>
<li>Yagi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-scale+whole-organ+bioengineering+for+liver+transplantation%3A+a+regenerative+medicine+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach.</a> Cell Transplantation. 22, 231-242 (2013).</li>
<li>Jiang, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-chemical+decellularization+of+the+whole+liver+for+mesenchymal+stem+cells-based+functional+hepatic+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Cryo-chemical decellularization of the whole liver for mesenchymal stem cells-based functional hepatic tissue engineering.</a> Biomaterials. 35, 3607-3617 (2014).</li>
<li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+reengineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).</li>
<li>Baptista, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+whole+organ+decellularization+for+the+generation+of+a+vascularized+liver+organoid%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid.</a> Hepatology. 53, 604-617 (2011).</li>
<li>Bruinsma, B. G., Kim, Y., Berendsen, T. A., Yarmush, M. L., Uygun, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer-by-layer+heparinization+of+decellularized+liver+matrices+to+reduce+thrombogenicity+of+tissue+engineered+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+and+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Layer-by-layer heparinization of decellularized liver matrices to reduce thrombogenicity of tissue engineered grafts.</a> Journal of Clinical and Translational Research. 1 (1), (2015).</li>
<li>Park, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+Liver+Extracellular+Matrix+as+Promising+Tools+for+Transplantable+Bioengineered+Liver+Promotes+Hepatic+Lineage+Commitments+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Decellularized Liver Extracellular Matrix as Promising Tools for Transplantable Bioengineered Liver Promotes Hepatic Lineage Commitments of Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Tissue Engineering Part A. 22, 449-460 (2014).</li>
<li>Ko, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+transplantable+porcine+livers+with+re-endothelialized+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Bioengineered transplantable porcine livers with re-endothelialized vasculature.</a> Biomaterials. 40, 72-79 (2015).</li>
<li>Bao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+portal+implantable+functional+tissue-engineered+liver+using+perfusion-decellularized+matrix+and+hepatocytes+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Construction of a portal implantable functional tissue-engineered liver using perfusion-decellularized matrix and hepatocytes in rats.</a> Cell Transplantation. 20, 753-766 (2011).</li>
<li>Pan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vivo+organ+engineering%3A+Perfusion+of+hepatocytes+in+a+single+liver+lobe+scaffold+of+living+rats%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">In-vivo organ engineering: Perfusion of hepatocytes in a single liver lobe scaffold of living rats.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 80, 124-131 (2016).</li>
<li>Madrahimov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marginal+hepatectomy+in+the+rat%3A+from+anatomy+to+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Marginal hepatectomy in the rat: from anatomy to surgery.</a> Annals of Surgery. 244, 89-98 (2006).</li>
<li>Mussbach, F., Settmacher, U., Dirsch, O., Dahmen, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+Livers%3A+A+New+Tool+for+Drug+Testing+and+a+Promising+Solution+to+Meet+the+Growing+Demand+for+Donor+Organs%5BTitle%5D)+AND+%22European+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Bioengineered Livers: A New Tool for Drug Testing and a Promising Solution to Meet the Growing Demand for Donor Organs.</a> European Surgical Research. 57, 224-239 (2016).</li>
<li>Mussbach, F., Settmacher, U., Dirsch, O., Dahmen, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+engineering+as+a+new+source+of+donor+organs%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Der+Chirurg%22%5BJournal%5D)">Liver engineering as a new source of donor organs: A systematic review.</a> Der Chirurg. 87, 504-513 (2016).</li>
<li>Xie, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+systemic+and+hepatic+hemodynamic+parameters+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Monitoring of systemic and hepatic hemodynamic parameters in mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), e51955(2014).</li>
<li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+and+Recellularization+of+Rat+Livers+With+Hepatocytes+and+Endothelial+Progenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Artificial+Organs%22%5BJournal%5D)">Decellularization and Recellularization of Rat Livers With Hepatocytes and Endothelial Progenitor Cells.</a> Artificial Organs. 40, E25-E38 (2016).</li>
<li>Yagi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-scale+whole-organ+bioengineering+for+liver+transplantation%3A+a+regenerative+medicine+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach.</a> Cell Transplantation. 22, 231-242 (2013).</li>
<li>Otsuka, H., Sasaki, K., Okimura, S., Nagamura, M., Nakasone, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterned+co-culture+of+hepatocyte+spheroids+layered+on+non-parenchymal+cells+to+understand+heterotypic+cellular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Science+and+Technology+of+Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Micropatterned co-culture of hepatocyte spheroids layered on non-parenchymal cells to understand heterotypic cellular interactions.</a> Science and Technology of Advanced Materials. 14, 065003(2013).</li>
<li>Bale, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+coculture+strategies+for+primary+hepatocytes+and+liver+sinusoidal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">Long-term coculture strategies for primary hepatocytes and liver sinusoidal endothelial cells.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 21, 413-422 (2015).</li>
<li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+perfusion-decellularization+methods+of+porcine+livers+for+clinical-scale+whole-organ+bioengineering%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Optimizing perfusion-decellularization methods of porcine livers for clinical-scale whole-organ bioengineering.</a> BioMed Research International. , 785474(2015).</li>
<li>Barakat, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+decellularized+porcine+liver+for+engineering+humanized+liver+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Use of decellularized porcine liver for engineering humanized liver organ.</a> Journal of Surgical Research. 173 (1), e11-e25 (2012).</li>
<li>Navarro-Tableros, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recellularization+of+rat+liver+scaffolds+by+human+liver+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Recellularization of rat liver scaffolds by human liver stem cells.</a> Tissue Engineering Part A. 21 (11-12), 1929-1939 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Através do bloqueio e canulação da veia porta esquerda com um cateter como uma entrada de fluido e a veia hepática lateral esquerda com outro cateter como uma saída de fluido, com êxito geramos na vivo desvio fluido dentro do lóbulo lateral esquerdo, indicando que Embora a técnica é altamente desafiadora devido ao tamanho pequeno dos vasos para canulação e um alto risco de causar hemorragia, é viável. Até os ratos passando por um período longo de perfusão de 4 horas sobreviveram pelo menos 1 semana, mostrando qu...

As indicações para a transplantação de órgãos estão em constante expansão. Em contraste, taxas de doação de órgãos e qualidade geral dos órgãos estão em declínio, levando a uma crescente demanda por enxertos. O número de candidatos adicionado à lista de espera de transplante de fígado continuou a aumentar (por exemplo, nos Estados Unidos, 11.340 pacientes foram adicionados em 2016, em comparação com 10.636 em 2015)1. Apesar dos esforços consideráveis, o número de órgãos disponíveis não satisfaz necessidades clínicas. Devido o aumento da incidência de doença hepática, muitos pacientes com estágio final morrem de doenças hepáticas na lista de espera de transplante antes um órgão doado se torna disponível. Para atender a enorme demanda por enxertos de doadores de fígado, abordagens alternativas usando o tecido hepático, princípios de engenharia estão a ser activamente prosseguido2. Hoje em dia, uma recém-desenvolvida técnica biológica de fígado engenharia potencialmente poderia superar esta falta.
Engenharia de fígado consiste em duas etapas: a geração de um andaime acelular, seguido de um repovoamento do cadafalso. Para obter um biológico acelular andaime de fígado, o fígado explantado é perfundidos através do sistema vascular com detergentes não iônicos ou iônicos, que pode remover o material celular do fígado. Na maioria dos estudos anteriores, um andaime de fígado acelular biológico foi alcançado por perfusão do fígado com uma combinação de Dodecil sulfato de sódio e TritonX100. Como resultado, todas as células foram removidas, Considerando que foi mantida a estrutura da matriz extracelular. Os andaimes de órgão foram novamente propagados com células maduras, hepatocelular, bem como linhas de células endoteliais e hepatócitos primários com ou sem a aplicação simultânea de células endoteliais ou células-tronco mesenquimais (MSC). Mais foco de pesquisadores em ex vivo fígado engenharia3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. No entanto, na maioria dos estudos anteriores, apenas pequenos pedaços de cubos de andaime repovoado foram transplantados em sites diferentes de implantação heterotópica. Em alguns estudos, andaimes repovoados parciais foram transplantadas como um enxerto de auxiliar. No entanto, o tempo máximo de sobrevivência relatada foi somente 72 h8,14. Tanto quanto sabemos, transplante ortotópico de um enxerto repovoado fígado completo ainda não foi executada ou publicado sobre. A função a longo prazo e a transplantação de órgãos projetados estão ainda em sua infância. Portanto, uma abordagem alternativa para ex vivo fígado engenharia é necessária.
Na vivo fígado engenharia pode representar uma alternativa para estudar o repovoamento hepático sob condições fisiológicas. As vantagens da engenharia na vivo fígado comparado com ex vivo fígado engenharia são múltiplas. Na vivo repovoada parcial fígado cadafalso é submetido a perfusão de sangue fisiológico com temperatura adequada, suficiente oxigênio, nutrientes e fatores de crescimento, em contraste com perfusão ex vivo com meio de cultura artificial. Além disso, o fígado normal parcial restante mantém a função hepática, principalmente permitindo a sobrevivência a longo prazo. Desde que um enxerto fígado implantado ex vivo engenharia é ainda incapaz de sustentar a sobrevivência a longo prazo dos animais experimentais por sua função hepática8, nós encaramos na vivo parcial fígado engineeringwould, finalmente, tornar-se um modelo promissor para um estudo mais aprofundado da evolução da engenharia fígados com observações de sobrevivência mais longos do que ex vivo.
Recentemente, um grupo de pesquisa (Pan e colegas) apresentou, pela primeira vez, uma técnica de fígado na vivo 15de engenharia. Eles alcançaram a perfusão isolada do lóbulo inferior direito fígado em ratos vivos apesar de desafios técnicos e anatômicos. Eles relataram os primeiros resultados no intra-operatório de repovoamento em vivo usando uma linha de celular de hepatócitos primários de rato. No entanto, o modelo de perfusão cirúrgica na vivo de Pan et al tem desvantagens. Eles alcançaram a perfusão único lóbulo hepático em ratos em detrimento de bloquear completamente a veia porta e veia cava inferior, que pode causar danos graves ao animal. Os ratos experimentais foram sacrificados após apenas 6 horas de tempo de observação intra-operatória. Portanto, a técnica de perfusão de fígado lobo na vivo mais precisa de melhoria para alcançar sobrevivência pós-operatória.
Desenvolvemos um modelo de sobrevivência romance na vivo perfusão de fígado lobo, com base em estudos anteriores da anatomia hepática do rato16, a técnica de canulação de veia porta para Monitorização hemodinâmica em ratos17e fígada bioengenharia 18 , 19. as principais etapas para o procedimento estão ilustradas na figura 1A - 1E.
Esta técnica é apropriada para aqueles que querem usar este modelo de perfusão experimental na vivo para a pesquisa básica no tratamento do órgão parcial por infusão com drogas, na vivo decellularization como uma ressecção química para doenças do órgão (por exemplo, , câncer de fígado), na vivo cultura de células em uma matriz de decellularized comparando ex vivo bidimensional e tridimensional de células cultura sistemas20,21,22,23 , 24 , 25 , 26e na vivo fígado engenharia por decellularization e repovoamento.

<table><tbody><tr><td>Bomba de Perfusão</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perfusor VI</td><td>B. Braun, Cateter</td> Melsungen <td></td><td></td></tr><tr><td></td> Versatus-W&nbsp;<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cateter</td><td>Terumo</td><td>SR+DU2419PX</td><td>24G, 0.74&vezes; 19mm</td></tr><tr><td>Versatus-W&nbsp; Cateter</td><td>Terumo</td><td>SR+DU2225PX</td><td>22G, 0.9&vezes; Instrumento</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>micro cirúrgico de</td></tr> 25mm <tr><td>micro tesoura</td><td>F&middot; S&middot; L</td><td>No. 14058-09</td><td></td></tr><tr><td>micro serrefine</td><td>F&middot; S&middot; L</td><td>No.18055-05</td><td></td></tr><tr><td>Aplicador de micro grampos</td><td>F&middot; S&middot; L</td><td>No. 18057-14</td><td></td></tr><tr><td>Micro fórceps retos</td><td>F&middot; S&middot; L</td><td>No. 00632-11</td><td></td></tr><tr><td>Micro fórceps curvo</td><td>F&middot; S&middot; L</td><td>No. 00649-11</td><td></td></tr><tr><td>porta-agulha micro</td><td>F&middot; S&middot; L</td><td>No. 12061-01</td><td></td></tr><tr>instrumentos <td></td><td></td><td></td><td>cirúrgicos gerais</td></tr><tr><td>padrão sissors</td><td>F&middot; S&middot; L</td><td></td><td></td></tr><tr><td>grampo de mosquito</td><td>F&middot; S&middot; L</td><td></td><td></td></tr><tr><td>fórceps serrilhado</td><td>F&middot; S&middot; L</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pinça dentada</td><td>F&middot; S&middot; L</td><td></td><td></td></tr><tr><td>porta-agulhas</td><td>F&middot; S&middot; L</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sutura</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-0 eticon</td><td></td><td></td><td></td>de prolene</tr><tr><td>4-0 ethicon*II</td><td>ethicon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-0 ethicon</td><td></td><td></td><td></td>de seda</tr><tr><td>11-0 ethicon</td><td></td><td></td><td></td> de poliamida</tr></tbody></table>

uma nova técnica cirúrgica como fundamento na vivo parcial engenharia fígado de rato

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Órgão engenharia é uma estratégia nova para gerar substitutos de fígado órgão que potencialmente podem ser usados em transplante. Recentemente, na vivo fígado de engenharia, incluindo no vivo órgão decellularization seguido de repovoamento, emergiu como uma abordagem promissora sobre ex vivo fígado engenharia. No entanto, a sobrevivência pós-operatória não foi alcançada. O objetivo deste estudo é desenvolver uma nova técnica cirúrgica na vivo perfusão seletiva lóbulo hepático em ratos como um pré-requisito para engenharia na vivo hepática. Geramos um bypass do circuito somente através do lóbulo lateral esquerdo. Então, o lobo lateral esquerdo é perfundido com solução salina heparinizada. O experimento é executado com 4 grupos (n = 3 ratos por grupo) com base em tempos diferentes de perfusão de 20 min, 2h, 3h e 4h. sobrevivência, bem como a alteração macroscopicamente visível de cor e histologicamente determinada ausência de células do sangue na Tríade portal e os sinusoides, é tomado como um indicador para um estabelecimento de modelo de sucesso. Após a perfusão seletiva do lobo esquerdo lateral, observamos que o lobo lateral esquerdo, com efeito, tornou-se de vermelho amarelo fraco. Em uma avaliação histológica, sem glóbulos são visíveis no ramo da veia porta, a veia central e os sinusoides. O lobo lateral esquerdo fica vermelho após a reabertura dos vasos bloqueados. 12/12 ratos sobreviveram o procedimento por mais de uma semana. Nós somos os primeiros a relatar um modelo cirúrgico na vivo único lóbulo hepático da perfusão com um período de tempo de sobrevivência de mais de uma semana. Em contraste com o relatório publicado anteriormente, a vantagem mais importante da técnica apresentada aqui é que a perfusão de 70% do fígado é mantido durante todo o processo. O estabelecimento desta técnica fornece uma base em vivo parcial engenharia hepática em ratos, incluindo decellularization e recellularization.

Doze macho (idade 12 - 13 semanas) ratos Lewis foram utilizados para avaliar o efeito da perfusão seletiva lóbulo hepático. O experimento foi realizado em quatro grupos (n = 3 ratos por grupo). Usando diferentes perfusão os períodos de 20 minutos, 2 horas, 3 horas e 4 horas, seguindo os passos descritos acima, nós com sucesso na vivo perfusão único lobo.
Na Vivo Perfusão do lob...

Estabelecemos uma nova técnica cirúrgica para um modelo de perfusão na vivo único lóbulo hepático em ratos como um pré-requisito para estudar mais na vivo parcial fígado engenharia no futuro.

Uma nova técnica cirúrgica como fundamento na Vivo parcial engenharia fígado de rato

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

Nos últimos anos, a engenharia hepática tornou-se um tema quente em todo o mundo devido ao seu potencial de gerar enxertos hepáticos transplantados. Por mais viável que seja a função a longo prazo e o transplante de órgãos projetados ainda são uma visão do futuro. Recentemente, a profusão do lobo hepático in vivo tornou-se uma estratégia promissora para iniciar a engenharia hepática.Uma grande vantagem dessa técnica é que o andaime hepático parcial repovoado em vivo submeteu a profusão sanguínea escatológica. Isso fornece ao andaime a temperatura adequada, oxigênio suficiente, nutrientes e fatores de crescimento em contraste com a profusão ex-vivo com meio de cultura artificial. Outra vantagem é que o fígado remanescente mantém a função hepática e, portanto, permite principalmente a sobrevivência a longo prazo.No entanto, o modelo de profusão de lobo único in vivo é tecnicamente desafiador e a sobrevivência pós-operatória ainda não foi alcançada. Aqui vamos apresentar outro modelo cirúrgico com sobrevivência a longo prazo como base para uma engenharia de lobos hepáticos único in vivo. Antes de demonstrarmos o modelo cirúrgico, gostaríamos de dar uma breve introdução à anatomia hepática de rato.Para estabelecer nosso modelo de profusão de lóbulo do fígado, selecionamos o lobo lateral esquerdo. Este é o único lobo hepático com um suprimento vascular distinto e drenagem permitindo criar um bypass. Esta é uma reconstrução 3D do sistema venoso portal em rato.Nosso foco aqui está na veia do portal esquerdo que mais tarde servirá como a entrada fluida. Esta é uma reconstrução 3D do sistema venoso hepático em rato. Aqui nosso foco está na veia hepática lateral esquerda que mais tarde servirá como uma saída fluida.Esta ilustração da anatomia vascular hepática destaca os pontos de acesso vascular utilizados para o modelo de perfusão parcial. Esta animação ilustra o esquema de geração do modelo de perfusão do lobo hepático lateral esquerdo in vivo. Para estabelecer o modelo cirúrgico vamos gerar um desvio de circuito dentro do lobo lateral esquerdo.Para isso, precisamos bloquear os seguintes vasos da veia do portal esquerdo, a artéria hepática esquerda, o ducto biliar esquerdo, a veia protal mediana esquerda, artéria hepática e ducto biliar, e a veia hepática lateral esquerda. Então precisamos cannular a veia do portal esquerdo com um cateter de 24 gage. Em seguida, a veia hepática lateral esquerda é cânulada usando um cateter de 22 gage.Em seguida, o cateter na veia do portal esquerdo está conectado a uma bomba de perfusão. A gaze seca é colocada na saída do cateter na veia hepática lateral esquerda para absorver fluido de resíduo. Desta forma, um bypass é criado.Em seguida, o lobo lateral esquerdo perfundiu com soro fisiológico heparinizado a uma vazão de 0,5 mililitros por minuto. A perfusão fisiológica ao lobo lateral esquerdo é restaurada após a reabertura dos vasos bloqueados. Agora o modelo de perfusão cirúrgica está estabelecido.Todos os procedimentos demonstrados neste vídeo foram avaliados e aprovados pelas autoridades locais. O campo de operação do abdômen é desinfetado com três cartuchos de tintura de iodo seguidos por duas rodadas de 70% de álcool. A gaze estéril é colocada no abdômen deixando apenas o campo de operação exposto.Uma incisão transversal é feita na parede abdominal do rato. Uma sutura de prolene 4-0 é usada para corrigir o processo xifoide e puxá-lo em direção à cabeça. Ambos os lados das paredes abdominais superiores são retraídos usando dois ganchos subcostais para alcançar a exposição total do órgão.Então podemos ver os lóbulos do fígado. Aqui está o lobo lateral esquerdo que é usado para perfusão seletiva. Cobrimos o duodeno e o intestino delgado na cavidade abdominal com gaze umedeçada para secura ovacionada.Nós expõemos o hilum do fígado levantando os lóbulos medianos com gaze umedecido. O rato é colocado sob um microscópio estéril. Dissecamos a veia do portal esquerdo.Em seguida, ligamos a veia protal esquerda com uma sutura de seda 6-0. A artéria hepática esquerda, o ducto biliar esquerdo, bem como a veia do portal mediano esquerdo, a artéria hepática mediana esquerda e o ducto biliar mediano esquerdo são bloqueados usando micro-grampos. Bloqueamos a veia hepática lateral esquerda com micro-grampos na base do lobo lateral esquerdo.Para criar a entrada do fluido, a haste da veia portal é perfurada com um cateter de 24 gage. Mas o cateter não está inserido. Em seguida, removemos a agulha do cateter e conectamos o cateter a uma bomba de perfusão.Para expulsar o ar do tubo e do cateter, perfundamos com soro fisiológico heparinizado por um minuto. Em seguida, ligamos a bomba. Em seguida, o cateter livre de agulha, que agora está conectado à bomba de perfusão, é inserido na veia do portal esquerdo.Desta forma, minimizamos as manipulações da nave canulada. Aqui está uma região exposta da veia hepática lateral esquerda que vamos cannular de forma semelhante. Primeiro criamos um orifício de drenagem na veia hepática lateral esquerda, perfurando-o com um cateter de 22 gage ou 24 gage.Recomendamos que o cateter seja um pouco menor que o vaso. Começamos então a perfundir o lobo lateral esquerdo com soro fisiológico heparinizado a uma vazão de 0,5 mililitros por minuto. O fluido de resíduos que flui é absorvido com gaze.Para minimizar a contaminação intraabdominal com fluido de resíduos, reinserimos o cateter livre de agulhas na veia hepática lateral esquerda. Assim, a veia hepática lateral esquerda cânulada canulada serve como uma saída fluida. Continuamos perfundando o lobo lateral esquerdo com soro fisiológico heparinizado.Fluido sangrento pode ser visto pingando da tomada. A seta indica que o lobo lateral esquerdo ficou amarelo durante a perfusão com soro fisiológico heparinizado. No final da perfusão, os cateteres são retirados dos vasos.A abertura de drenagem na veia hepática lateral esquerda é fechada com uma única sutura de pollumite 11-0. A abertura da entrada na veia do portal esquerdo está fechada com uma sutura de pollumite 11-0 também. A perfusão re começa com o backflow da veia cava supraháptica depois de remover o grampo na veia hepática lateral esquerda.A perfusão fisiológica é restaurada após a remoção do grampo da artéria hepática esquerda e do ducto biliar, bem como das estruturas vasculares medianas esquerdas. A refusão completa é alcançada após a reabertura da veia do portal esquerdo, conforme indicado por uma mudança de cor para vermelho escuro. Perfusão do lobo esquerdo mais tarde.A seta branca nesta imagem indica que o lobo hepático alvo foi de fato seletivamente perfundido. Aqui as setas brancas mostram que os lóbulos restantes, que representam cerca de 70% do fígado retiveram perfusão fisiológica durante todo o procedimento. Re perfusão do lobo lateral esquerdo.Aqui, a seta vermelha indica que o lobo lateral esquerdo é fisiologicamente refundido após a reabertura dos vasos bloqueados. A seta azul mostra que o lobo mediano esquerdo sustentou isquemia. O lobo lateral esquerdo com perfumado seletivamente foi examinado histologicamente usando manchas de H E.A Figura A mostra que no lobo lateral esquerdo perfumado não são detectáveis células sanguíneas no ramo da veia portal e dos sinusoides. Como esperado, as células vermelhas são visíveis no ramo da artéria hepática. Na figura B, o lobo caudado inferior serve como controle.As células sanguíneas são claramente visíveis e os ramos da veia protal e artéria hepática, bem como os sinusoides. A Figura C demonstra que no lobo lateral esquerdo perfusado não há células sanguíneas visíveis na veia central. Em contraste, a figura D demonstra que no controle as células sanguíneas caudate inferior são visíveis na veia central.Alcançamos uma taxa de sobrevivência de 100% em uma semana em 12 procedimentos consecutivos. Comparamos nosso modelo de perfusão de lóbulo hepático in vivo com o modelo de Pan e colegas. As principais diferenças de metodologia e resultados entre Pan e nosso grupo são: eles selecionaram o lobo inferior direito enquanto escolhemos o lobo lateral esquerdo como lobo-alvo do fígado;eles bloquearam vena cava e veia portal principal levando à hipertensão portal.Em contraste, mantivemos a perfusão portal de 70% do fígado;eles sacrificaram os ratos intersingestialmente enquanto nossa taxa de sobrevivência de uma semana é de 100% As vantagens do nosso novo modelo cirúrgico são: que é tecnicamente desafiador, mas viável; e que é bem tolerado como demonstrado pela taxa de sobrevivência de 100%. No entanto, uma limitação é que o lobo médio esquerdo sustentou isquemia devido ao bloqueio da veia portal. As aplicações potenciais de nossa técnica incluem:que pode ser usado para tratamento parcial de órgãos in vivo por perfusão com drogas;descelularização parcial de órgãos in vivo como ressecção química;sistema de cultura celular in vivo em comparação com a engenharia hepática ex-vivo;e engenharia hepática in vivo.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Nós apresentamos uma revisão fácil de estabelecer a técnica de dois manguito clássica para transplante hepático em ratos.

Transplante hepático ortotópico experimental em ratos

O transplante hepático em ratos é um modelo indispensável experimental para a pesquisa biomédica. Aqui apresentamos nossos procedimentos cirúrgicos para transplante ortotópico do fígado do rato com a reconstrução da artéria hepática utilizando um enxerto parcial de 50%.

Procedimentos cirúrgicos para um modelo de rato de Transplante de Fígado parcial ortotópico com reconstrução arterial hepática

Nós descrevemos o design do dispositivo "quick-linker" para o transplante de fígado de rato ortotópico mais fácil.

Dispositivos de fabricação e instrumentos para facilitar a Rat Liver Transplantation

Um modelo de braçadeira hilar fígado de rato original foi desenvolvido para estudar o impacto das moléculas farmacológicas no melhoramento da lesão por isquemia-reperfusão. Este modelo inclui canulação direta da oferta de portal para o segmento fígado isquêmico através de um ramo da veia portal, permitindo a entrega hepática direta.

Método de entrega directa segmentos intra-hepática Usando um modelo de rato Liver Hilar Grampo

Descrevemos um protocolo para a realização de hepatectomy parcial (PHx) e transplante de células através do baço em NOD. SCID (ASSENTIMENTO. CB17-Prkdcscid/J) ratos. Neste protocolo, uma incisão é feita para expor e fazer a ressecção do lobo esquerdo do fígado seguido por outra incisão para o transplante intrasplenic de células.

Intrasplenic transplante de hepatócitos após Hepatectomy parcial na NOD. Ratos SCID

Aqui, apresenta-se um protocolo envolvendo transplante hepático parcial de re-arterialized de rato. Especificamente, 70% fígado foi ressecado na vivo usando uma técnica atualizada de hepatectomy orientada a embarcação. A artéria hepática foi reconstruída em uma forma de ponta-a-lado. A técnica de punho foi modificada para encurtar o tempo de anastomose da veia cava infrahepatic.

Re-Arterialized transplante de fígado parcial de rato com na vivo orientado a embarcação 70% Hepatectomy

A reconstrução da veia cava suprahepatic (SHVC) continua a ser uma etapa difícil em transplante ortotópico de fígado de rato. Neste artigo, vamos mostrar um protocolo passo a passo para a reconstrução de SHVC em ratos utilizando uma técnica de anastomose magnético romance.

Um modelo do rato de ortotópico transplante hepático, usando uma técnica de anastomose magnético romance para reconstrução de veia Cava Suprahepatic

Aqui, apresentamos um novo método para ressecção parcial do lobo esquerdo hepático em camundongos neonatais (dia 0). Este novo protocolo é apropriado para estudar a resposta de lesão no cenário neonatal e lesão hepática aguda.

Hepatectomy parcial de Lobular: Um modelo cirúrgico para regeneração hepática morfológica

Aqui, descrevemos uma plataforma que permite imagens in vivo não invasivas de esferoides hepáticos enxertados na câmara anterior do olho do camundongo. O fluxo de trabalho abrange desde a geração de esferoides de células hepáticas primárias até o transplante para o olho do camundongo e imagens in vivo em resolução celular por microscopia confocal.

Imagens in vivo de esferoides hepáticos enxertados na câmara anterior do olho do camundongo

O protocolo auxiliar de transplante hepático heterotópico de rato descrito aqui oferece uma ferramenta prática de investigação para explorar os mecanismos de rejeição do aloenxerto hepático. Este modelo ajuda a aliviar os obstáculos cirúrgicos e o estresse animal do transplante hepático ortotópico em ratos.

Modelo de transplante de fígado total auxiliar heterotópico de rato utilizando uma hepaticouretorostomia para estudos de rejeição de aloenxerto

Aprenda uma técnica cirúrgica inovadora para perfusão de lobo hepático in vivo em ratos. Este método estabelece as bases para pesquisas futuras em engenharia hepática parcial e regeneração de órgãos.

Uma nova técnica cirúrgica como fundamento na Vivo parcial engenharia fígado de rato

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