Enriquecimento de Fosfopeptida acoplado com espectrometria de massa livre de rótulo quantitativa para investigar o Phosphoproteome no câncer de próstata

Este método pode ajudar a responder a questões-chave em qualquer campo de pesquisa onde o sinal de fosforilação seja de interesse, como o campo do câncer, para avaliar mudanças nas redes de sinalização após resistência terapêutica. A principal vantagem dessa técnica é que milhares de fosfopeptídeos podem ser identificados de maneira relativamente simples e barata para avaliar globalmente o fosfoproteoma. Para colher o tecido tumoral, pesar o tumor e, em um tubo de ensaio de cultura, adicionar dois mililitros de tampão de lise gelada para cada 100 miligramas de tecido.

Em seguida, use um homogeneizador portátil ou de bancada para homogeneizar o lisado. Para reduzir e alcoolizar a amostra, aqueça o tubo a 95 graus Celsius por cinco minutos e, em seguida, resfrie a amostra no gelo por 15 minutos. Ainda no gelo, sonicar o lisado três vezes e, em seguida, aquecer a amostra a 95 graus Celsius durante cinco minutos.

Colocar o tubo de sonicação num rotor de balde oscilante e centrifugar o lisado a 3 500 g e 15 graus Celsius durante 15 minutos, depois recolher o sobrenadante e rejeitar o sedimento. Para digerir o lisado, use 100 milimolares tris para diluir a amostra 12 vezes para reduzir a quantidade de guanidínio. Para cinco miligramas de proteína, adicione 10 microgramas de lisil endopeptidase ou lis-C e incube a amostra em temperatura ambiente por cinco a seis horas.

Prepare um miligrama por mililitro de tripsina tratada com TPCK em um HCL milimolar com cloreto de cálcio 20 milimolar e tripsina adicionados a uma proporção de uma para 100 tripsina para proteína. Incubar a amostra a 37 graus Celsius por três horas. Em seguida, adicione uma alíquota adicional de tripsina ao tubo e incube a amostra a 37 graus Celsius durante a noite.

Adicione a amostra a um filtro de corte de 15 mililitros e 10 quilodaltons. Centrifugue a amostra em um balde oscilante ou rotor de ângulo fixo a 3.500 g e 15 graus Celsius até que o volume do retentado seja inferior a 250 microlitros. Em seguida, colete o fluxo e descarte o retentado.

Para acidificar a amostra, adicione aproximadamente 20 microlitros de ácido trifluoroacético a 5% ou TFA por mililitro de lisado. Misture bem o tubo e use uma tira de pH para medir o pH. Se necessário, adicione 5% de TFA extra para ajustar o pH para 2,5.

Em seguida, conecte a extremidade mais curta de uma coluna C18 a um coletor de vácuo. Após o ajuste do vácuo entre 17 e 34 quilopascais, use três mililitros de acetonitrila 100% e uma pipeta de vidro para molhar a coluna. Equilibre a coluna usando uma pipeta de vidro e aplicando duas alíquotas de três mililitros de 0,1% TFA.

Em seguida, coloque a amostra acidificada na coluna. Use três volumes de três mililitros de 0,1 TFA para lavar a coluna. Em seguida, aplique dois mililitros de 40% ACN 0,1% TFA para eluir a amostra e colete duas frações de dois mililitros em tubos de cultura de vidro.

Com o parafilme, cubra os tubos de eluente e use uma agulha de calibre 20 para fazer três a cinco furos na tampa antes de liofilizar as amostras durante a noite. Ressuspenda o pó liofilizado com 0,5 mililitros de imunoprecipitação gelada ou tampão de ligação IP em cada fração. Transferir o volume de ressuspensão de 0,5 mililitros da segunda fração para o tubo com a primeira fração e guardar a ponta da pipeta.

Use mais 0.5 mililitros de tampão IP para enxaguar cada tubo de liofilização antes de transferir o conteúdo para o criotubo e, em seguida, repita o enxágue usando dois mililitros de tampão IP. Depois de usar um P200 com uma ponta cortada para transferir o estoque de 0,5 miligramas por mililitro de pasta de esferas de anticorpos para o tubo de microfífugas, adicione 450 microlitros de tampão de ligação IP gelado para lavar 50 microlitros de pasta de esferas de anticorpos 4G10 e 25 microlitros de pasta de esferas de anticorpos 27 B10.4 em um tubo de microfuga. Centrifugar o tubo a 100 g e quatro graus Celsius durante um minuto.

Depois de aspirar o sobrenadante, adicione um volume igual à pasta original do tampão de ligação IP para ressuspender os grânulos. Adicione grânulos pY pré-lavados à solução de amostra ressuspensa nos criotubos com tampa de rosca e, em seguida, incube-os a quatro graus Celsius em um rotador de ponta a ponta durante a noite. Depois de girar as contas, guarde o sobrenadante que será usado para enriquecer os peptídeos pST.

Em seguida, use 300 microlitros de tampão de ligação IP para ressuspender os grânulos e transferi-los para um tubo de microcentrífuga de dois mililitros. Gire as amostras a 100 g e quatro graus Celsius por um minuto. Em seguida, com 500 microlitros de tampão de ligação IP, lave as contas três vezes.

Lave as contas quatro vezes com 450 microlitros de bicarbonato de amônio 25 milimolares pH 7,5. Mergulhe uma ponta de carregamento de gel ligeiramente abaixo da superfície do cordão e aspire completamente o sobrenadante. Adicione quatro vezes o volume do grânulo de 0,1% TFA aos grânulos.

Em seguida, misture-os bem e incube o tubo em um termomixer a 1.000 rpm e 37 graus Celsius por 15 minutos. Transferir a ressuspensão para um filtro de centrifugação de 0,2 micrómetros e centrifugar o filtro a 850 g durante um minuto. Depois de transferir o eluição para um tubo de microcentrífuga de baixa ligação a proteínas, concentre o eluente a vácuo até a secura a 40 graus Celsius com um tempo de aquecimento de 300 minutos durante a noite.

Para preparar os grânulos de óxido de titânio contidos nas pontas, adicione 200 microlitros de 100% ACN. Em seguida, inverta-o e sacuda a extremidade estreita para mover o líquido em direção à tampa. Usando uma lâmina de barbear, corte a ponta e coloque-a sobre o tubo de ligação com baixo teor de proteínas.

Em seguida, remova a tampa e insira uma micropipeta para mergulhar o ACN restante antes de repetir a lavagem. Pré-condicione o dióxido de titânio com 500 microlitros de 100% ACN duas vezes. Em seguida, condicione o dióxido de titânio com 500 microlitros de tampão fosfato de sódio 0,2 molar pH 7 duas vezes.

Por fim, use 300 microlitros de tampão de equilíbrio para lavar as contas três vezes. Adicione 400 microlitros de 50% ACN 0,1% TFA ao tubo de ligação de baixa proteína. Em seguida, adicione 84 microlitros de ácido lático.

Transfira os fosfopeptídeos ressuspensos para o tubo de ligação de baixa proteína e incube-os à temperatura ambiente usando um rotador de ponta a ponta por uma hora. Depois de peletar as contas, use 300 microlitros de tampão de equilíbrio para lavá-las duas vezes e girá-las. Com 300 microlitros de tampão de enxágue, enxágue as contas duas vezes.

Em seguida, transfira-os para um filtro de rotação de 0,2 micrômetro. Após a centrifugação, transfira a unidade de filtro para um tubo limpo de ligação de baixa proteína de 1,5 mililitro e com 200 microlitros de 0,9% de amônio em água, elua o conteúdo duas vezes. Depois de verificar o pH, concentre o eluente a vácuo até a secura durante a noite para evaporar a amônia.

Para dessalinizar os peptídeos para análise de MS, reconstitua os fosfopeptídeos com 15 microlitros de 0,1%TFA. Limpe a amostra usando uma ponta C18 com capacidade de ligação de cinco microgramas e siga o protocolo do fabricante. Finalmente, depois de secar completamente o volume de eluição por concentração de vácuo, ressuspenda os fosfopeptídeos secos em 12,5 microlitros de solução de espectrometria de massa.

Este gel corado de Coomassie de lisado pré-digerido confirma a presença de proteínas, enquanto a coloração do lisado pós-digerido confirma a digestão completa. Para uma digestão completa, nenhuma banda deve aparecer acima de 15 kilodaltons, exceto as bandas de 30 kilodalton e 23,3 kilodalton para lis-C e tripsina, respectivamente. A adição de lys-C também reduz o número de clivagens perdidas.

A imunoprecipitação pY separa efetivamente os peptídeos pY dos pST foram, em média, 85% dos fosfopeptídeos identificados na preparação pY são pY e mais de 99% dos fosfopeptídeos identificados na preparação pST são pST. O dióxido de titânio é usado para enriquecer fosfopeptídeos em ambas as preparações. A porcentagem esperada de peptídeos na preparação pronta para MS que são fosforilados está entre 30 a 50% e a maioria dos fosfopeptídeos detectados tem um grupo fosforil simples ou duplo.

Depois de realizar a espectrometria de massa, os arquivos brutos do MS são carregados em um software de análise MS. Conforme ilustrado aqui, definir um limite de probabilidade de localização superior a 0,75 filtra aproximadamente 5% dos peptídeos pY e 15% e 34% dos peptídeos pS e pT, respectivamente. Após a aplicação desses filtros, o número esperado de identificações de fosfopeptídeos no final da análise de MS é de aproximadamente 300 peptídeos pY para cinco miligramas da proteína inicial e cerca de 7.500 peptídeos pS e 640 peptídeos pT para 2,5 miligramas da quantidade de peptídeo inicial das respectivas preparações de enriquecimento.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em seis dias se as etapas pY e pST forem executadas em paralelo. No entanto, para mais de oito amostras, execute as etapas em sequência para reduzir o erro técnico em mais quatro dias. Ao tentar esses procedimentos, é importante lembrar de se concentrar nos detalhes.

Cada etapa é importante e pode afetar a qualidade dos preparativos finais, incluindo os controles de qualidade necessários. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como extrair e digerir proteínas, seguido de enriquecimento de fosfopeptídeos para análise via espectrometria de massa para investigar mudanças globais no fosfoproteoma.