Malha de seringa injetável eletrônica para eletrofisiologia roedor crônica estável

Esse método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurociência, como como os processos de envelhecimento se manifestam no cérebro, como o cérebro se desenvolve e como as doenças cerebrais se originam e progridem. A principal vantagem dessa técnica é que a eletrônica de malha não provoca uma resposta imune crônica na gliose, uma vez implantada no cérebro, e permite uma integração perfeita com o tecido neural circundante. Demonstrando o procedimento estarão Tao Zhou, um estudante de pós-graduação do Grupo Lieber, e Jung Min Lee, um pós-doutorado no Grupo Lieber.

Para iniciar o procedimento, carregue um wafer de silício limpo em um evaporador térmico e evapore 100 nanômetros de níquel. Em seguida, gire o fotorresistente negativo SU-8 2000.5 no wafer a 400 rotações por minuto para uma espessura aproximada de SU-8 de 400 a 500 nanômetros. Carregue o wafer em um alinhador de máscara para expor o SU-8 com máscara de fotolitografia correspondente à camada inferior de malha SU-8.

Expor na dose de linha I de 100 milijoules por centímetro quadrado. Eles, mergulhe o wafer em uma bandeja de revelador SU-8. Agite suavemente a solução por dois minutos, até que o padrão de malha no SU-8 esteja totalmente desenvolvido.

Em seguida, enxágue o wafer em uma bandeja de álcool isopropílico por um minuto e seque. Asse o wafer em uma chapa quente a 180 graus Celsius por uma hora. Em seguida, gire a camada LOR 3A no wafer a 4.000 rotações por minuto para uma espessura aproximada de 300 nanômetros.

Spin coat S1805 fotorresistente positivo a 4.000 rotações por minuto para uma espessura aproximada de 500 nanômetros. Em seguida, carregue o wafer em um alinhador de máscara para expor o S1805 com máscara de fotolitografia dois correspondentes às interconexões de metal e almofadas de entrada e saída. Exposto na dose da linha H a 40 milijoules por centímetro quadrado, em seguida, mergulhe o wafer em uma bandeja de revelador fotorresistente CD-26.

Agite suavemente a solução por um minuto até que o padrão de interconexões de metal esteja totalmente desenvolvido. Enxágue o wafer em uma bandeja de água deionizada por um minuto e seque. Em seguida, evaporar termicamente três nanômetros de cromo seguidos por 80 nanômetros de ouro.

Mergulhe o wafer em um béquer plano de removedor PG por aproximadamente três horas, até que o metal tenha sido totalmente rebaixado, deixando o metal apenas na interconexão desejada e nas regiões de almofada de entrada e saída da eletrônica de malha. Repita o revestimento de rotação, litografia, evaporação e decolagem para deixar três nanômetros de cromo e 50 nanômetros de platina nas regiões dos eletrodos. Posteriormente, repita o revestimento de rotação e a fotolitografia do SU-8 para definir a camada superior da malha do SU-8.

Trate o wafer com plasma de oxigênio a 50 watts por um minuto. Depois, mergulhe o wafer em níquel em solução por aproximadamente três horas, até que a eletrônica da malha tenha sido completamente liberada do wafer de silício. Use uma pipeta pasteur para transferir as sondas eletrônicas de malha liberadas da corrosão de níquel para um béquer de 100 mililitros de água deionizada.

Em seguida, transfira os componentes eletrônicos da malha para um béquer fresco de água deionizada pelo menos três vezes para garantir o enxágue. Para carregar a eletrônica da malha em uma agulha, insira uma agulha capilar de vidro no béquer de 100 mililitros de PBS contendo a eletrônica da malha. Posicione a extremidade da agulha perto das almofadas de entrada e saída de uma sonda eletrônica de malha e retraia manualmente a seringa para puxar uma sonda eletrônica de malha para dentro da agulha.

Empurre e puxe o êmbolo da seringa enquanto ele ainda está imerso em solução salina para ajustar a posição dos componentes eletrônicos da malha dentro da agulha. Para injetar componentes eletrônicos de malha no cérebro de um camundongo, use uma broca dentária e uma estrutura estereotáxica para abrir uma craniotomia nas coordenadas desejadas no crânio. Abra uma segunda craniotomia longe do local da injeção para a inserção de um parafuso ou fio gráfico de aço inoxidável.

Em seguida, fixe um substrato de fixação ao crânio com cimento dentário. Um corte de aproximadamente um milímetro de largura no substrato melhora a confiabilidade da etapa de dobra mais tarde no procedimento. Em seguida, monte o porta-pipetas com a agulha contendo os componentes eletrônicos da malha na estrutura estereotáxica usando uma extremidade em ângulo reto clamp.

Conecte a saída lateral do porta-pipetas a uma seringa de cinco mililitros presa em uma bomba de seringa com um tubo capilar de 0.5 a um metro de comprimento. Em seguida, use a estrutura estereotáxica para posicionar a ponta da agulha no local inicial desejado dentro do cérebro. Posicione a câmera para exibir a parte superior da sonda eletrônica de malha dentro da agulha de vidro.

Inicie o fluxo ajustando a bomba da seringa para uma velocidade baixa e pressionando start. Aumente lentamente a taxa de fluxo se a sonda eletrônica de malha não se mover dentro da agulha. À medida que a sonda eletrônica de malha começa a se mover dentro da agulha, use a estrutura estereotáxica para retrair a agulha na mesma taxa com que a sonda eletrônica de malha está sendo injetada usando a posição original marcada da eletrônica de malha como guia.

Continue fluindo solução salina e retraindo a agulha até que a agulha saia do crânio. Em seguida, interrompa o fluxo da bomba de seringa. Neste procedimento, use a estrutura estereotáxica para guiar cuidadosamente a agulha para o substrato de fixação de cabo plano e flexível através da lacuna, fluindo a solução com a bomba de seringa para gerar uma folga nas interconexões eletrônicas da malha.

Uma vez que a agulha esteja acima do substrato de fixação e através da lacuna, retome o fluxo rapidamente para injetar a entrada eletrônica da malha, almofadas de saída no substrato de fixação. Usando uma pinça e uma pipeta de água deionizada, dobre as almofadas de entrada e saída em um ângulo de 90 graus o mais próximo possível da primeira almofada de entrada e saída. Uma vez que a entrada, as almofadas de saída são alinhadas e dobradas e no ângulo de 90 graus em relação à haste da malha, seque-as no lugar com ar comprimido fluindo suavemente.

Corte o clampsubstrato em uma borda estreita aproximadamente 0.5 a um milímetro da borda das almofadas de entrada, saída. Além disso, corte partes estranhas do clampsubstrato de fixação que impedirão a inserção no conector zif de 32 canais montado na placa de circuito impresso. Em seguida, insira as almofadas de entrada e saída no conector zif na placa de circuito impresso e feche a trava.

Use a eletrônica de medição para medir a impedância entre os canais e o parafuso de aterramento para confirmar a interface bem-sucedida. Se os valores de impedância forem muito altos, destrave o conector zif, ajuste a inserção e teste novamente até que a conexão bem-sucedida seja confirmada. Posteriormente, cubra o conector zif e as interconexões eletrônicas de malha exposta com cimento dental para proteção.

Vire o PCB na abertura do substrato e fixe o PCB com cimento no crânio do mouse. Para gravações em movimento livre, solte o mouse do limitador após inserir o préampplaca de circuito impresso e aterrar o parafuso de referência. Registre o período de tempo desejado usando o sistema de aquisição de dados enquanto o mouse se comporta livremente.

Aqui são mostrados os mapas de calor de campo locais representativos das sondas eletrônicas de malha de 32 canais injetadas no hipocampo do camundongo e no córtex somatossensorial. Os dados foram registrados enquanto o camundongo explorava livremente sua gaiola dois meses e quatro meses após a injeção. A amplitude do potencial do campo local é codificada por cores de acordo com a barra de cores à direita.

Traços de filtro passa-alta, pretos, mostrando atividade de pico são sobrepostos no espectrograma para cada um dos 32 canais. Aqui estão os picos isolados após a classificação dos dados plotados. A atividade de pico de unidade única foi detectada em 26 dos 32 canais, dois meses após a injeção e quatro meses após a injeção.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de testar a interface de E/S para confirmar a conexão elétrica bem-sucedida com a sonda eletrônica de malha. A impedância de medida ajuda a solucionar a origem de quaisquer problemas e é fundamental para identificar problemas de interface ou fabricação. Após este procedimento, a histologia pode ser realizada para estudar o ambiente celular ao redor de cada eletrodo registrado.

Ao contrário das sondas cerebrais rígidas convencionais, a eletrônica da malha pode ser deixada no tecido durante a histologia, tornando possível correlacionar com precisão os dados de eletrofisiologia com a análise imuno-histoquímica.