Name: Malha de seringa injetável eletrônica para eletrofisiologia roedor crônica estável (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Aprenda a fabricar e implantar malha de seringa injetável eletrônica para eletrofisiologia crônica estável em roedores. Este método permite gravações de neurônios individuais por longos períodos sem resposta imune crônica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

C.M.L. reconhece apoio deste trabalho, o escritório da força aérea de investigação científica (FA9550-14-1-0136), um prêmio de ciências físicas da Universidade de Harvard e acelerador engenharia e um institutos de saúde diretor nacional do Pioneer Award ( 1DP1EB025835-01). T.G.S. reconhece apoio pelo departamento de defesa (DoD) através do programa National Defense Science & Engineering Graduate Fellowship (NDSEG). G.H. reconhece apoio de comunhão da American Heart Association (16POST27250219) e o caminho para independência Award (pai K99/R00) do Instituto Nacional do envelhecimento dos institutos nacionais de saúde. Este trabalho foi realizado em parte no centro da Universidade de Harvard para sistemas de nanoescala (CNS), um membro do nacional nanotecnologia coordenada infra-estrutura de rede (NNCI), que é apoiado pela Fundação Nacional de ciência sob NSF ECCS Award no. 1541959.

<ol><li>Lopes da Silva, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EEG+and+MEG%3A+relevance+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">EEG and MEG: relevance to neuroscience.</a> Neuron. 80 (5), 1112-1128 (2013).</li>
<li>Logothetis, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+we+can+do+and+what+we+cannot+do+with+fMRI%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">What we can do and what we cannot do with fMRI.</a> Nature. 453 (7197), 869-878 (2008).</li>
<li>Seymour, J. P., Wu, F., Wise, K. D., Yoon, E. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/micronano201666">State-of-the-art MEMS and microsystem tools for brain research.</a> Microsystems & Nanoengineering. 3, 16066(2017).</li>
<li>Buzsaki, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBuzsaki%2C+G+%22Rhythms+of+the+Brain%22">Rhythms of the Brain</a>. , Oxford University Press. (2006).</li>
<li>Khodagholy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NeuroGrid%3A+recording+action+potentials+from+the+surface+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">NeuroGrid: recording action potentials from the surface of the brain.</a> Nature Neuroscience. , (2014).</li>
<li>Hamel, E. J., Grewe, B. F., Parker, J. G., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+level+brain+imaging+in+behaving+mammals%3A+an+engineering+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cellular level brain imaging in behaving mammals: an engineering approach.</a> Neuron. 86 (1), 140-159 (2015).</li>
<li>Jun, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+integrated+silicon+probes+for+high-density+recording+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity.</a> Nature. 551 (7679), 232-236 (2017).</li>
<li>Berenyi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale%2C+high-density+%28up+to+512+channels%29+recording+of+local+circuits+in+behaving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Large-scale, high-density (up to 512 channels) recording of local circuits in behaving animals.</a> Journal of Neurophysiology. 111 (5), 1132-1149 (2014).</li>
<li>Scholvin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Close-Packed+Silicon+Microelectrodes+for+Scalable+Spatially+Oversampled+Neural+Recording%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Close-Packed Silicon Microelectrodes for Scalable Spatially Oversampled Neural Recording.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 63 (1), 120-130 (2016).</li>
<li>Schiller, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Central+Visual+System%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Research%22%5BJournal%5D)">The Central Visual System.</a> Vision Research. 26 (9), 1351-1386 (1986).</li>
<li>Benabid, A. L., Chabardes, S., Mitrofanis, J., Pollak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+brain+stimulation+of+the+subthalamic+nucleus+for+the+treatment+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Deep brain stimulation of the subthalamic nucleus for the treatment of Parkinson's disease.</a> The Lancet Neurology. 8 (1), 67-81 (2009).</li>
<li>Hochberg, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reach+and+grasp+by+people+with+tetraplegia+using+a+neurally+controlled+robotic+arm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reach and grasp by people with tetraplegia using a neurally controlled robotic arm.</a> Nature. 485 (7398), 372-375 (2012).</li>
<li>Lebedev, M. A., Nicolelis, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-Machine+Interfaces%3A+From+Basic+Science+to+Neuroprostheses+and+Neurorehabilitation%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Brain-Machine Interfaces: From Basic Science to Neuroprostheses and Neurorehabilitation.</a> Physiological Reviews. 97 (2), 767-837 (2017).</li>
<li>Polikov, V. S., Tresco, P. A., Reichert, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+brain+tissue+to+chronically+implanted+neural+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes.</a> Journal of Neuroscience Methods. 148 (1), 1-18 (2005).</li>
<li>Perge, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-day+signal+instabilities+affect+decoding+performance+in+an+intracortical+neural+interface+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Engineering%22%5BJournal%5D)">Intra-day signal instabilities affect decoding performance in an intracortical neural interface system.</a> Journal of Neural Engineering. 10 (3), 036004(2013).</li>
<li>Hong, G., Yang, X., Zhou, T., Lieber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesh+electronics%3A+a+new+paradigm+for+tissue-like+brain+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Mesh electronics: a new paradigm for tissue-like brain probes.</a> Current Opinion in Neurobiology. 50, 33-41 (2017).</li>
<li>Dai, X., Hong, G., Gao, T., Lieber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesh+Nanoelectronics%3A+Seamless+Integration+of+Electronics+with+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Mesh Nanoelectronics: Seamless Integration of Electronics with Tissues.</a> Accounts of Chemical Research. 51 (2), 309-318 (2018).</li>
<li>Feiner, R., Dvir, T. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/natrevmats201776">Tissue-electronics interfaces: from implantable devices to engineered tissues.</a> Nature Reviews Materials. 3 (1), 17076(2017).</li>
<li>Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M., Siegelbaum, S. A., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKandel%2C+ER+%22Principles+of+Neural+Science%22">Principles of Neural Science</a>. , McFraw-Hill. (2013).</li>
<li>Rousche, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexible+polyimide-based+intracortical+electrode+arrays+with+bioactive+capability%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Flexible polyimide-based intracortical electrode arrays with bioactive capability.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 48 (3), 361-371 (2001).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nnano.2015.115">Syringe-injectable electronics.</a> Nature Nanotechnology. 10 (7), 629-636 (2015).</li>
<li>Kasthuri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saturated+Reconstruction+of+a+Volume+of+Neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Saturated Reconstruction of a Volume of Neocortex.</a> Cell. 162 (3), 648-661 (2015).</li>
<li>Saxena, T., Bellamkonda, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensor+web+for+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">A sensor web for neurons.</a> Nature Materials. 14, 1190-1191 (2015).</li>
<li>Xie, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+macroporous+nanoelectronic+networks+as+minimally+invasive+brain+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional macroporous nanoelectronic networks as minimally invasive brain probes.</a> Nature Materials. 14 (12), 1286-1292 (2015).</li>
<li>Hong, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syringe+Injectable+Electronics%3A+Precise+Targeted+Delivery+with+Quantitative+Input%2FOutput+Connectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Syringe Injectable Electronics: Precise Targeted Delivery with Quantitative Input/Output Connectivity.</a> Nano Letters. 15 (10), 6979-6984 (2015).</li>
<li>Zhou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syringe-injectable+mesh+electronics+integrate+seamlessly+with+minimal+chronic+immune+response+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Syringe-injectable mesh electronics integrate seamlessly with minimal chronic immune response in the brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (23), 5894-5899 (2017).</li>
<li>Fu, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+long-term+chronic+brain+mapping+at+the+single-neuron+level%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Stable long-term chronic brain mapping at the single-neuron level.</a> Nature Methods. 13 (10), 875-882 (2016).</li>
<li>Fu, T. M., Hong, G., Viveros, R. D., Zhou, T., Lieber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+scalable+multichannel+mesh+electronics+for+stable+chronic+brain+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Highly scalable multichannel mesh electronics for stable chronic brain electrophysiology.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (47), E10046-E10055 (2017).</li>
<li>Schuhmann, T. G. Jr, Yao, J., Hong, G., Fu, T. M., Lieber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syringe-Injectable+Electronics+with+a+Plug-and-Play+Input%2FOutput+Interface%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Syringe-Injectable Electronics with a Plug-and-Play Input/Output Interface.</a> Nano Letters. 17 (9), 5836-5842 (2017).</li>
<li>Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3233859/">Survivable stereotaxic surgery in rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).</li>
<li>Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+surgery+for+excitotoxic+lesion+of+specific+brain+areas+in+the+adult+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic surgery for excitotoxic lesion of specific brain areas in the adult rat.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e4079(2012).</li>
<li>Gage, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+implantation+of+chronic+neural+electrodes+for+recording+single+unit+activity+and+electrocorticographic+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Surgical implantation of chronic neural electrodes for recording single unit activity and electrocorticographic signals.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Rodent Handling and Restraint Techniques. , Journal of Visualized Experiments. Cambridge, MA. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/10221/rodent-handling-and-restraint-techniques">https://www.jove.com/science-education/10221/rodent-handling-and-restraint-techniques</a> (2018).</li>
<li>Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer+for+immunohistochemistry+on+cryosectioned+rat+brain+tissue%3A+example+staining+for+microglia+and+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. 10 (99), e52293(2015).</li>
<li>Sodagar, A. M., Perlin, G. E., Yao, Y., Najafi, K., Wise, K. D. <a target="_blank" href="https://ieeexplore.ieee.org/document/5226763/">An Implantable 64-Channel Wireless Microsystem for Single-Unit Neural Recording.</a> IEEE Journal of Solid-State Circuits. 44 (9), 2591-2604 (2009).</li>
<li>Wentz, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+wirelessly+powered+and+controlled+device+for+optical+neural+control+of+freely-behaving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Engineering%22%5BJournal%5D)">A wirelessly powered and controlled device for optical neural control of freely-behaving animals.</a> Journal of Neural Engineering. 8 (4), 046021(2011).</li>
<li>Harrison, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wireless+neural+recording+with+single+low-power+integrated+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Neural+Systems+and+Rehabilitation+Engineering%22%5BJournal%5D)">Wireless neural recording with single low-power integrated circuit.</a> IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 17 (4), 322-329 (2009).</li>
<li>Landa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+injectable+alginate+implant+on+cardiac+remodeling+and+function+after+recent+and+old+infarcts+in+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Effect of injectable alginate implant on cardiac remodeling and function after recent and old infarcts in rat.</a> Circulation. 117 (11), 1388-1396 (2008).</li>
<li>Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+wound+healing+by+injectable+microporous+gel+scaffolds+assembled+from+annealed+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks.</a> Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).</li>
<li>Zhang, A., Lieber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano-Bioelectronics%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Nano-Bioelectronics.</a> Chemical Reviews. 116 (1), 215-257 (2016).</li>
<li>Zhou, W., Dai, X., Lieber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+nanowire+bioelectronics%5BTitle%5D)+AND+%22Reports+on+Progress+in+Physics%22%5BJournal%5D)">Advances in nanowire bioelectronics.</a> Reports on Progress in Physics. 80 (1), 016701(2017).</li>
<li>Dai, X., Zhou, W., Gao, T., Liu, J., Lieber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+mapping+and+regulation+of+action+potential+propagation+in+nanoelectronics-innervated+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional mapping and regulation of action potential propagation in nanoelectronics-innervated tissues.</a> Nature Nanotechnology. 11 (9), 776-782 (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Todas as etapas de fabricação e o uso de malha eletrônica são importantes, mas alguns são especialmente críticos. Antes de lançar a malha eletrônica da sua bolacha, é essencial para oxidar a superfície para fazer as malhas prontamente suspensas em solução aquosa (etapa 1.6.1). Se esta etapa será pulada, as malhas geralmente flutuam na superfície da água, tornando-os difíceis de carregar para as agulhas, e se podem ser carregados, furam para os lados da agulha de vidro, que requerem grandes volumes (> 100 µ l) para a injeção. Falha para oxidar a superfície antes de lançamento, portanto, normalmente significa que as malhas não podem ser usadas e a fabricação devem ser re-interpretadas desde o início. Outro passo crítico é dobrar a malha eletrônica "haste" para ~ 90° durante a i/o interface (passo 4.3). Se o ângulo for menor do que 90°, então todos os 32 blocos de I/O não vão caber no conector ZIF; Alguns terão que ser cortar a extremidade para permitir a inserção, reduzindo o número de eletrodos conectados. O processo também deve ser feito com cuidado para evitar que o tronco quebrado.
O projeto da malha eletrônica pode ser personalizado para várias aplicações modificando as máscaras e usando o mesmo procedimento de fabricação descrito na Figura 2. Por exemplo, enquanto as sondas de malha eletrônica usadas para gravar os dados na Figura 9 foram projetadas para ter 32 gravação eletrodos abrangem o rato hipocampo e córtex somatossensorial primário, a colocação do eletrodo dentro da malha super flexível pode ser selecionado para praticamente qualquer cérebro região (ões)-alvo, ou maiores eletrodos para estimulação podem ser incorporado27. O mesmo procedimento de estrutura e de fabricação de malha básica são retidos, mas a colocação do eletrodo e o design são ajustadas para atender às necessidades do estudo. Investigadores deve usar de cautela, no entanto e sempre teste desenhos modificados podem ser injetados facilmente através das agulhas pretendidas. Pequenas alterações à flexão mecânica da malha eletrônica podem ter efeitos substanciais sobre Injectabilidade. Um exemplo é que um ângulo de 45° entre fitas de SU-8 transversais e longitudinais produz uma sonda eletrônica de malha que pode ser injectada facilely mas um ângulo de 90° resulta em um que amassa e entope agulhas21.
Medir a impedância dos eletrodos gravação é útil para solução de problemas. Um eletrodo de Pt-20 µm de diâmetro circular deve ter uma magnitude de impedância perto 1 MΩ quando medido com uma frequência de 1 kHz no vivo ou em 1X PBS29. Uma impedância significativamente maior do que isto implica que o eletrodo não é exposto, como pode acontecer se está contaminado com resíduos de fotorresiste, ou não eletricamente conectado. Este último pode ocorrer se, por exemplo, poeira sobre a máscara de fotografia durante o PL que resulta em uma desconexão no Au interconexões, ou se uma das almofadas do I/O de malha não é contactada pelos pinos do conector ZIF durante o interface I/O. Uma magnitude de impedância cerca de metade do valor esperado sugere que o canal pode ser curto para o adjacente, criando um circuito de duas impedâncias de eletrodo paralelamente uns aos outros. Os valores de impedância medidos agir como um guia durante a resolução de problemas; combinado com microscopia óptica das sondas malha eletrônica, a origem do problema pode geralmente ser identificada e corrigida em conformidade na fabricação próxima executar ou tentativa de interface I/O.
A utilização da seringa injetável malha eletrônica para estudos agudas é limitada em que a atividade de cravação unitárias geralmente não é observada até 1 semana pós injeção27, embora trabalhos recentes (não publicado) mostram que esta questão é facilmente superada. Determinantes do tempo necessário para ver o pico de atividade são a malha de design, o volume de líquido injetado no cérebro juntamente com malha eletrônica e o diâmetro da agulha usada para a injeção, como estas afetam o grau de danos no tecido durante o injeção e a taxa de cura. Volumes de injeção grande podem ser necessários se a malha eletrônica não é tratada com plasma de oxigênio antes do lançamento em Ni etchant; ou seja, se a malha não é hidrofílica, pode aderir na agulha de vidro. Ocasionalmente, as malhas têm defeitos que levam à flexão mecânica que os tornam difícil injetar. Durante o carregamento da malha eletrônica, é importante verificar que malhas são deslocam facilmente e suavemente a agulha (como mostrado no vídeo complementar 1). Se não, uma sonda eletrônica de malha diferente deve ser usada. Melhores resultados de interface neural sem emenda serão alcançados com os volumes de injeção ideal de 10-50 µ l por 4 mm de comprimento da malha injetado. Resultados mais recentes com sondas de eletrônica de malha mais finas injetada e/ou menor diâmetro capilar as agulhas (tão pequenas quanto 150 µm diâmetro interno, diâmetro externo de 250 µm) mostram aquela única unidade cravação pode ser observada desde logo após a injeção (medições agudas) através de tempos mais longos. Arquivos de projeto de máscara para essas estruturas mais finas de malha estão disponíveis por solicitação ou do site do recurso, meshelectronics.org. Estimamos que o rendimento global dos nossos na vivo malha injeção procedimentos usando 400 µm agulhas de (diâmetro externo de 650 µm) de diâmetro interno para cerca de 70%, embora o rendimento é mais perto de 80-90% para o nosso trabalho mais recente com 150 µm de diâmetro interno (250 µm diâmetro exterior ) agulhas. As razões mais comuns de falhas são (1) que a malha não injectar suavemente, resultando em edema cerebral de volumes de injeção inesperadamente grande no cérebro, ruptura de malha (2) durante a manipulação manual exigida na e/s interface de procedimento e (3) sangramento de danificar um vaso sanguíneo durante a injeção. Danificar um vaso sanguíneo durante a injeção é raro (a causa de menos de 10% de falhas) e poderia ser reduzido ainda mais usando a cirurgia guiada por imagem. Constatamos também que o dano dos vasos sanguíneos é uma limitação comum de todos os procedimentos que envolvem a penetração do tecido cerebral, incluindo injeção de partículas virais para transfeccao, implantação de sondas de cérebro rígida e injeção da malha eletrônica.
Malha eletrônica sondas são capazes de estàvel gravar e rastrear os mesmos neurônios individuais pelo menos meses para escalas de tempo ano e não evocam quase nenhuma resposta imune crônica, conforme demonstrado na Figura 9 e Figura 10, respectivamente. Isto representa uma vantagem significativa em comparação com eletrodos de profundidade de Convenção, que geralmente sofrem diminuindo pico amplitudes, sinais instáveis e inflamação crônica ao longo do longo prazo gravação experimentos14, 15. Além disso, a malha eletrônica têm a vantagem que eles podem ser deixados no tecido durante o corte histológico, coloração, e imagem latente, em contraste com sondas convencionais, que são demasiado rígida e, portanto, deve ser removida antes da histologia análises. Daí, malha eletrônica permite a capacidade única de usar a análise imuno-histoquímica para estudar precisamente o ambiente celular em torno de cada local de gravação.
O protocolo apresentado aqui, abre-se emocionante novas oportunidades em neurociência. O método de entrega minimamente invasiva e perfeita integração da malha eletrônica com tecido cerebral minimiza interrupções nos circuitos neurais e evita a resposta imune crônica, que poderia beneficiar a maioria dos tipos de experimentos de gravação neural crônica. A capacidade da malha eletrônica para gravar e rastrear os neurônios único mesmos para longos períodos de tempo especial será de interesse para os investigadores procuram correlacionar atividade cravação de milissegundo-escala com processos mês ano e longo como o envelhecimento, a patogênese da doença do cérebro, ou cérebro desenvolvimento16,18. Além disso, existem oportunidades substanciais para estender e personalizar este protocolo, como a adição de eletrônica ativa ao PCB cabeça-palco para implementar a funcionalidade como digital, multiplexação de8,35, sem fio comunicação,35,36,37e35, co, injetando células-tronco ou polímeros com a malha eletrônica para auxiliar no tecido regeneração18,38, de processamento de sinal 39e incorporando nanofio campo – transistores de efeito (NW-FETs) em malha eletrônica para altamente localizadas e cérebro multifuncional sondas24,29,40,41 ,,42.

O desenvolvimento de ferramentas capazes de mapear o cérebro com resolução de single-neurônio é de importância central de neurociência e Neurologia. Tecnologias não-invasivas para estudos neurais como Eletroencefalografia (EEG), ressonância magnética funcional (fMRI) e magnetoencefalografia (MEG) provaram ser valiosas para correlacionar atividade cerebral com comportamento em seres humanos1, 2, mas eles não têm a resolução spatiotemporal necessária para estudar a estrutura e a dinâmica de redes neurais no seu micrômetro fundamental e milissegundo escalas, respectivamente3,4. Sondas de certa eletrocorticografia (ECoG) e métodos de imagem ópticos usando corantes sensíveis à voltagem conseguiram gravar unitárias cravação atividade na vivo5,6, mas são geralmente eficazes apenas perto do superfície do cérebro, limitando a aplicabilidade a estudos de regiões cerebrais superficial. Em contraste, implantáveis elétricas sondas podem medir single-neurônio eletrofisiologia em movimentando-se livremente animais de praticamente qualquer região do cérebro sem a necessidade de rotulagem fluorescente, tornando-os indispensáveis para a neurociência de sistemas-nível, especialmente como microfabrication técnicas da indústria de semicondutores têm empurrado a quantidade de canais para as centenas e milhares de3,7,8,9. Em virtude desses recursos, implantáveis elétricas sondas já fez muitas contribuições importantes de neurociência e Neurologia, incluindo estudos fundamentais de processamento no sistema visual10, o tratamento de neurológica de informações doenças como a doença de Parkinson,11e a demonstração de interfaces cérebro-máquina (especificas) para próteses avançadas12,13.
Não obstante, instabilidade a longo prazo, que se manifesta como diminuir o pico amplitudes e sinais instáveis em escalas de tempo de semanas a meses14,15 limitou-se a aplicabilidade das sondas implantáveis para o estudo de relativamente curto prazo fenômenos, deixando perguntas tais como desenvolvimento e envelhecimento cerebral em grande parte sem resposta. As limitações na instabilidade a longo prazo são um resultado de uma incompatibilidade entre sondas convencionais e tecido cerebral em tamanho, mecânica e topologia14,15,16,17,18. Em termos de tamanho, enquanto as sinapses neuronais e somata é aproximadamente dezenas de nanômetros a dezenas de micrômetros de diâmetro19, respectivamente, sondas tradicionais muitas vezes são significativamente maiores, no caso de matrizes de microeletrodos de silício > 4 vezes o tamanho de um único neurônio corpo celular7,8. O tamanho relativamente grande de tais sondas pode perturbar a estrutura natural e conectividade de denso tecido neural, assim contribuindo para a resposta imune crônica e perturbando os circuitos neurais sendo estudado. Em termos de propriedades mecânicas, sondas tradicionais são drasticamente mais rígidas do que o tecido neural extremamente macio, na qual eles são implantados; sondas até "flexíveis", feitas a partir de 10-20 µm espessos mantos de poliimida são pelo menos 100.000 vezes mais duras que os de20,de tecido de cérebro21. Esta incompatibilidade na rigidez de flexão faz com que o movimento relativo de cisalhamento entre a sonda e cérebro tecido, levando à unitárias não confiável de rastreamento durante gravações estendidas e induzindo gliose crônica no local do implante. Finalmente, a estrutura topológica de sondas convencionais cérebro necessariamente exclui um volume sólido do tecido. Tal incompatibilidade na topologia interrompe a conectividade dos circuitos neurais, opõe-se a natural distribuição tridimensional (3D) interpenetrated de neurônios, células gliais e os vasos sanguíneos no cérebro tecido22e dificulta o transporte 3D de sinalização moléculas23. Juntas, estas deficiências de sondas convencionais de têm-los feito aquém a compatibilidade a longo prazo, procurada para aplicações clínicas e estudos de neurociência longitudinal a nível de single-neurônio.
Para superar estas deficiências, procuramos borrar a linha entre os sistemas neurais e electrónicos através do desenvolvimento de um novo paradigma de "tecido-como" neurais sondas denominado malha eletrônica16,21,24. Malha eletrônica soluciona os problemas de correspondência acima em tamanho, mecânica e topologia incorporando características (1) estruturais da mesma nanômetros para escala de tamanho micrométrico do tecido neural, (2) mecânicas Propriedades semelhantes do tecido cerebral e (3) um 3D se topologia que é > 90% espaço aberto e, portanto, acomoda interpenetração por neurônios e a difusão de moléculas através do ambiente extracelular. Malha eletrônica sondas podem ser entregues precisamente para regiões específicas do cérebro, através de uma seringa e uma agulha, causando danos mínimos agudo enquanto implantação mesmo em profunda do cérebro regiões21,25. Axônios e soma neuronal têm sido mostrados para interpenetrar a estrutura de sonda de eletrônica de malha 3D aberto dentro pós-injeção de semanas, criando assim uma interface perfeita, livre de gliose entre gravação eletrônica e em torno de tecido de cérebro21 , 26 , 27. estas características únicas permitiram malha eletrônica sondas para estàvel acompanhar atividade cravação de neurônios individuais mesmos ao longo de pelo menos um ano calendário27. Além disso, a fabricação da malha eletrônica baseada em fotolitografia (PL) fornece alta escalabilidade do número de eletrodos que podem ser incorporados, com demonstrada canal conta até 128 eletrodos por sonda usando litografia de máscara de contacto simples 28 e um design de (e/s) de entrada/saída de plug-and-play que permite a rápida conexão elétrica para periféricos eletrônicos sem equipamento especializado29.
Uma ampla gama de estudos pode beneficiar de incorporar protocolos de medição eletrônica de malha. A maioria dos experimentos de gravação intracortical poderiam se beneficiar do procedimento de implantação minimamente invasiva malha electronics através da injeção de seringa, drasticamente reduzida resposta imune pós-implante, e a capacidade de deixar malha eletrônica na tecido durante a subsequente histologia e imunocoloração para análise precisa do ambiente biológico ao redor de cada local de gravação. Experimentos de gravação crônica em particular irão derivar o valor da capacidade única de malha eletrônica para controlar um grande número de neurônios individuais por meses a anos. Esse recurso cria oportunidades para estudos com resolução de single-neurônio que eram anteriormente impraticáveis, tais como estudos de envelhecimento longitudinal de circuitos neurais, investigações do cérebro em desenvolvimento e informações sobre a patogênese da espongiformes transmissíveis16.
Este protocolo, descreveremos todos os passos a chave em um experimento de gravação neural típica do mouse usando a seringa injetável malha eletrônica (ver Figura 1). Etapas descritas incluem a fabricação de malha eletrônica em um possível processo padrão baseado no PL em muitas universidades, carregando malha eletrônica em padrão agulhas capilares, injeção estereotáxica de malha eletrônica na vivo, conexão da malha I/O para interfaces de instrumentação padrão, as sessões de gravação contida ou livremente móveis e corte histológico de tecido cerebral contendo malha eletrônica. Alguns pesquisadores usando malha eletrônica apenas para estudos de histologia não podem exigir conexão elétrica e a gravação, caso em que eles podem pular essas etapas. Depois de familiarizar-se com este protocolo, os investigadores devem ter todo o conhecimento necessário para usar malha eletrônica em suas próprias experiências.

<table><tbody><tr><td>Quadro estereotáxico motorizado</td><td>World Precision Instruments</td><td>MTM-3</td><td>Para cirurgia estereotáxica de rato</td></tr><tr><td>Controlador de gravação de 512 canais</td><td>Intan Technologies</td><td>C3004</td><td>Um componente do sistema de gravação neural</td></tr><tr><td>RHD2132 placa amplificadora</td><td>Intan Technologies</td><td>C3314</td><td>Um componente do sistema de gravação neural</td></tr><tr><td>RHD2000 cabo</td> <td>de interface SPI ultrafino de 3 pésIntan Technologies</td><td>C3213</td><td>Um componente do sistema de gravação neural</td></tr><tr><td>Mouse resrestringir</td><td>Braintree Scientific</td><td>TV-150&nbsp; Padrão STD</td><td>Diâmetro interno de 1,25 polegadas; usado para conter o mouse durante sessões de gravação restritas.</td></tr><tr><td>Bolachas</td><td>de Si Nova Electronic Materials</td><td></td><td>3" P < 100> .001-.005 ohm-cm 356-406 &mu; m Bolachas de Si SSP de Grau Primário Thick com 2 Semi-Std. Sapatilhas & 6.000 A&deg; &plusmn; 5% de Óxido Térmico Úmido em ambos os lados.</td></tr><tr><td>Fotomáscaras (cromo sobre vidro sodo-cálcico)</td><td>Reproduções avançadas A</td><td></td><td>Advance Reproductions e outros fornecedores fabricam fotomáscaras a partir de arquivos de design fornecidos. Nossos arquivos de design de máscara fotográfica estão disponíveis mediante solicitação ou no site de recursos, meshelectronics.org. Como alternativa, algumas salas limpas universitárias têm escritores de máscaras para fazer fotomáscaras no local.</td></tr><tr><td>Software AutoCAD</td><td>Autodesk Inc.</td><td></td><td>Software de design para desenhar fotomáscaras. Uma alternativa gratuita é o LayoutEditor. Nossos arquivos de design de máscara fotográfica estão disponíveis mediante solicitação ou no site de recursos, meshelectronics.org.</td></tr><tr><td>Evaporador térmico</td><td>Sharon Vacuum</td><td></td><td>Usado para evaporar Ni, Cr e Au em eletrônicos de malha durante a fabricação. Muitas salas limpas universitárias têm essa ferramenta ou uma ferramenta semelhante.</td></tr><tr><td>SU-8 2000.5 fotorresistente negativo</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td>Fotorresistente negativo usado para definir as camadas passivantes inferior e superior da eletrônica de malha.</td></tr><tr><td>Alinhador de máscara MA6</td><td>Karl Suss Microtec AG</td><td></td><td>Usado para alinhar cada fotomáscara ao padrão no wafer e expor o wafer à luz UV. A maioria das salas limpas universitárias tem esta ferramenta ou uma ferramenta semelhante.</td></tr><tr><td>Desenvolvedor do SU-8</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td>Usado para desenvolver fotorresistente negativo SU-8 após exposição à luz UV.</td></tr><tr><td>LOR3A resistente à decolagem</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td>Usado com fotorresistente Shipley 1805 para promover o rebaixamento durante processos de elevação de metal</td></tr><tr><td>Shipley 1805 fotorresistente positivo</td><td>Microposit, The Dow Chemical Company</td><td></td><td>Fotorresistente positivo usado para definir interconexões de metal e eletrodos Pt em eletrônica de malha</td></tr><tr><td>Desenvolvedor de fotorresiste positivo MF-CD-26</td><td>Microposit, The Dow Chemical Company</td><td></td><td>Para desenvolver fotorresistente positivo S1805 após exposição em um alinhador de máscara. Muitas salas limpas universitárias estocam esse produto químico.</td></tr><tr><td>Revestidor de rotação</td><td>Reynolds Tech</td><td></td><td>Para revestimento de wafers com resistências positivas e negativas. A maioria das salas limpas da universidade tem revestidores giratórios.</td></tr><tr><td>Sistema de tratamento de superfície a plasma PJ</td><td>AST Products, Inc.</td><td></td><td>Usado para oxidar a superfície da eletrônica de malha antes de liberá-la em solução aquosa. A maioria das salas limpas universitárias tem esta ferramenta ou uma ferramenta semelhante.</td></tr><tr>Vácuo <td></td> de <td>Denton</td> do <td>evaporador do feixe de elétrons</td><td>Para evaporar o Cr e o Pt durante a fabricação da eletrônica da malha. Muitas salas limpas universitárias têm essa ferramenta ou uma ferramenta semelhante.</td></tr><tr><td>Removedor PG</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td>Usado para dissolver LOR3A e Shipley S1805 resiste durante a decolagem do metal</td></tr><tr>Solução de<td>cloreto férrico</td><td>MG Chemicals</td><td>415-1L</td><td>Um componente da solução de corrosão Ni</td></tr><tr><td>36% solução de ácido clorídrico</td><td>Kanto Corp.</td><td></td><td>Um componente da solução de corrosão Ni</td></tr><tr><td>Agulhas capilares de vidro</td><td>Drummond Scientific Co.</td><td></td><td>Diâmetro interno 0,40 mm, diâmetro externo 0,65 mm. Outros diâmetros estão disponíveis.</td></tr><tr><td>Porta-micropipetas U-type</td><td>Molecular Devices, LLC</td><td>1-HL-U</td><td>Usado para segurar as agulhas capilares de vidro durante a injeção estereotáxica</td></tr><tr><td>Seringa de 1 mL</td><td>NORM-JECT&reg;, Henke Sass Wolf</td><td></td><td>Usado para carregamento manual de eletrônicos de malha em agulhas capilares Tubo de</td></tr><tr><td>cateter intradêmico de polietileno Becton</td><td>Dickinson and Company</td><td></td><td>Diâmetro interno 1,19 mm, diâmetro externo 1,70 mm</td></tr><tr><td>Seringa de 5 mL</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td></td><td>Usada na bomba de seringa para injeção de malha eletrônica in vivo</td></tr><tr><td>Câmera ocular</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>DCC1240C</td><td>Usado para visualizar a eletrônica de malha dentro de agulhas capilares durante a injeção</td></tr><tr><td>Software de aquisição de imagem ThorCam uc480 para câmeras USB</td><td>Thorlabs Inc.</td><td></td><td>Usado para visualizar a eletrônica de malha dentro de agulhas capilares durante a injeção</td></tr><tr><td>Bomba de seringa</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PHD 2000</td><td>Usado para fluir volumes precisos de solução através de agulhas capilares durante a injeção de eletrônica de malha</td></tr><tr><td>EXL-M40 broca odontológica</td><td>Osada</td><td>3144-830</td><td>Para perfurar a craniotomia</td></tr><tr><td>Broca de 0,9 mm Fine</td><td>Science Tools</td><td>19007-09</td><td>Para perfurar a craniotomia</td></tr><tr><td>Esterilizador de esferas quentes 14 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-50</td><td>Usado para esterilizar instrumentos cirúrgicos</td></tr><tr><td>Instrumento de crioseccionamento CM1950</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Usado para cortar tecido congelado em seções. Muitas universidades têm esta ou uma ferramenta semelhante disponível em uma instalação compartilhada.</td></tr><tr><td>0,3% Triton x-100</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Usado para histologia</td></tr><tr><td>5% soro de cabra</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Usado para histologia</td></tr><tr><td>3% soro de cabra</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Usado para histologia</td></tr><tr><td>Coelho anti-NeuN</td><td>Abcam</td><td>ab177487</td><td>Usado para histologia</td></tr><tr><td>Mouse anti-Neurofilament</td><td>Abcam</td><td>ab8135</td><td>Usado para histologia</td></tr><tr><td>Rato anti-GFAP</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>PA516291</td><td>usado para histologia</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>P36930</td><td>Usado para histologia</td></tr><tr><td>Poli-D-lisina</td><td>Sigma-Aldrich Corp.</td><td>P6407-5MG</td><td>Peso molecular = 70-150 kDA</td></tr><tr><td>Braçadeira de extremidade de ângulo reto</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>RA180/M</td><td>Usado para prender o porta-pipeta à estrutura estereotáxica</td></tr><tr><td>Placa de circuito impresso (PCB)</td><td>Circuitos Avançados</td><td></td><td>Usado para fazer a interface entre a eletrônica de malha e a eletrônica de medição periférica, como o sistema de gravação Intan. A Advanced Circuits e outros fornecedores fabricam e montam PCBs com base nos arquivos de projeto fornecidos. Nossos arquivos de design de PCB estão disponíveis mediante solicitação ou no site de recursos meshelectronics.org</td></tr><tr><td>conector de amplificador padrão de 32 canais</td><td>Omnetics Connector Corp.</td><td>A79024-001</td><td>Componente montado no</td></tr><tr><td>cabo flexível plano de 32 canais (FFC) do PCB</td> <td>Molex, LLC</td><td>152660339</td><td>Usado como um substrato de fixação ao fazer interface com almofadas de E / S eletrônicas de malha com o conector ZIF montado em PCB</td></tr><tr><td>Conector de força de inserção zero de 32 canais (ZIF)</td><td>Hirose Electric Co., LTD</td><td>FH12A-32S-0.5SH (55)</td> <td>Componente montado no PCB</td></tr></tbody></table>

malha de seringa injetável eletrônica para eletrofisiologia roedor crônica estável

Syringe-injectable Mesh Electronics for Stable Chronic Rodent Electrophysiology

Sondas de eletrofisiologia do cérebro implantáveis são ferramentas valiosas em neurociência, devido à sua capacidade para gravar atividade neural com alta resolução spatiotemporal de regiões do cérebro superficial e profunda. Seu uso tem sido dificultado, no entanto, incompatibilidades mecânicas e estruturais entre as sondas e cérebro tecido que normalmente leva à micromovimentos e gliose com resultante do sinal instabilidade em experimentos de gravação crônica. Em contraste, após a implantação da eletrônica de malha super flexível através da injeção de seringa, a malha sondas forma uma interface perfeita, livre de gliose com o tecido circundante do cérebro que permite o controle estável de neurônios individuais em pelo menos um ano escala de tempo. Este detalhes de protocolo as etapas em um experimento de gravação neural típica do mouse usando a seringa injetável malha eletrônica, incluindo a fabricação de malha eletrônica em um padrão baseado em fotolitos processo possível em muitas universidades, carregando malha eletrônica em padrão agulhas capilares, injeção estereotáxica em vivo, conexão da malha entrada/saída para interfaces de instrumentação padrão, contido ou sessões de gravação, movimentando-se livremente e histológica de seccionamento do cérebro que contenham tecido malha eletrônica. Representante gravações neurais e histologia dados são apresentados. Os investigadores familiarizados com este protocolo terá o conhecimento necessário para incorporar a malha eletrônica em suas próprias experiências e aproveitar as oportunidades únicas oferecidas pela interface neural estável a longo prazo, tais como estudos de envelhecimento processos, desenvolvimento do cérebro e a patogênese da doença cerebral.

Resultados irão variar com base nas espécies animais em estudo, a região do cérebro específica, o tempo decorrido desde a injeção, a quantidade de agudos danos infligidos durante a injeção e o sucesso da e/s interface de procedimento, entre outros fatores. Atividade de cravação unitárias pode não aparecer até 1 dia (no caso de agulhas de diâmetro interno 150 µm) em 1 semana após as injeção e spike amplitudes podem variar até 4 – 6 semanas. A Figura 9 mostra dados eletrofisiológicos representativos de uma sonda eletrônica de 32 canais malha injetado no hipocampo e córtex somatossensorial primário de um rato masculino adulto de C57BL/6J. Aproximadamente de potenciais de campo local de amplitude de 300-µV (LFPs) foram registrados em todos os 32 canais e atividade de cravação unitárias foi gravada em 26 canais. O LFPs e picos isolados permaneceram semelhantes entre 2 e 4 meses, sugerindo uma interface altamente estável entre gravação eletrônica e neurônios ao longo deste período de tempo prolongado. A Figura 10 mostra resultados representativos de corte histológico e imunocoloração de tecido cerebral contendo malha eletrônica 1 ano após a injeção. Coloração para NeuN, um marcador para somata neural e Neurofilamento, um marcador para axônios neurais, não revela pouca ou nenhuma perda de densidade do tecido no local da injeção, implicando a perfeita interface entre o tecido de malha eletrônica e cérebro. Coloração para GFAP (um marcador para astrócitos) mais revela níveis de perto-fundo de astrócitos em torno de malha eletrônica, indicando que sua presença provoca resposta imune pouco crônica.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig1.jpg"> Figura 1: etapas em uma seringa injetável malha eletrônica experiência. Este protocolo descreve todas as etapas-chave em um experimento de gravação neural roedor típico usando malha eletrônica. Experiências geralmente implica, em ordem de execução, (1) fabricação de malha eletrônica, (2) um carregamento de malha eletrônica em agulhas capilares, (3) estereotáxica injeção de malha eletrônica para o cérebro, I/O (4) elétrica interfaceamento para malha eletrônica, gravações contidas ou livremente móveis (5) e (6) malha/tecido, corte e coloração para a histologia. Em alguns estudos, apenas dados de histologia podem ser desejados, caso em que os passos (4) e (5) pode ser ignorada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig2.jpg"> Figura 2: diagrama esquemático mostrando o processo de fabricação de malha plug-and-play eletrônica na região de dispositivo super flexível (linha superior), haste interconexões (linha média) e região I/O (linha inferior). (A) SU-8 fotorresiste negativo (vermelho) é modelado com máscara de PL-1 para definir o fundo passivating camada de cada sonda electrónica do engranzamento plug-and-play. (B) a padronização com máscara-2 PL, evaporação térmica e decolagem metal definir Au interconexões e almofadas de I/O (ouro). (C) padronização com máscara-3 PL, evaporação por feixe de elétrons e decolagem metal definir eletrodos de Pt (azul). (D) SU-8 fotorresiste negativo (vermelho) é modelado com máscara de PL-4 para definir a camada passivating superior. Aberturas no SU-8 são deixadas em cada eletrodo Pt e almofada I/O. (E) A conclusão de malha sonda eletrônica com caixas tracejadas indicando os locais ampliados no topo, meio e linhas de fundo. Arquivos de projeto Fotomáscara estão disponíveis mediante pedido dos autores ou do local do recurso, meshelectronics.org. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig3.jpg"> Figura 3: fotografias e imagens de microscópio ótico de plug-and-play de malha eletrônica. (A) lado a lado imagens de microscópio óptico de uma sonda eletrônica de seringa injetável malha com plug-and-play e/s. A sonda foi fotografada após a conclusão da fabricação etapas na Figura 2 , mas antes do lançamento do substrato Ni-revestida. Caixas tracejadas correspondem da esquerda para a direita para as seções da região de dispositivo super flexível, haste e região I/O ampliada em C, D e E, respectivamente. Barra de escala = 1 mm. (B) fotografia de uma bolacha de 3 polegadas Si contendo 20 completou malha eletrônica sondas. Barra de escala = 20 mm. (C) imagem de microscópio óptico de 20 µm de diâmetro Pt gravação os eléctrodos na região de dispositivo super flexível. Barra de escala = 100 µm. (D) imagem de microscópio óptico de alta densidade Au interconexões na região do tronco. Cada interligação Au é eletricamente isolada e se conecta a um único eletrodo Pt para um único bloco de I/O. Barra de escala = 100 µm. (E) óptica imagem de microscópio almofadas de I/O. Cada bloco consiste em uma região de malha dobrável e uma região contínua de filme fino localizado na haste. Non-realizando SU-8 fitas conectar as porções de malha das almofadas juntos para ajudar a manter o alinhamento. Barra de escala = 200 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig3large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig4.jpg"> Figura 4: montagem do aparato para a realização de agulhas capilares durante a injeção. (A) fotografia dos componentes do aparelho. Os componentes incluem (1) uma agulha de vidro capilar, (2) um titular da pipeta, (3) um elemento de fixação do parafuso circular para o titular de uma pipeta e (4) uma arruela de cone para o titular de uma pipeta. Itens (2) a (4) são incluídas com a compra de um titular da pipeta. A seta marca a saída do titular da pipeta que deve ser colada fechada com epóxi. (B) fotografia do titular pipeta após a montagem e a inserção de uma agulha de vidro capilar. O epóxi adicionado é visível na saída superior do titular da pipeta (marcado pela seta) e tubo capilar conecta o titular de uma pipeta de uma seringa (não mostrada). (C) fotografia do titular a pipeta e a agulha capilar após a fixação ao quadro estereotáxica com uma pinça de ângulo reto final. Barras de escala são 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig4large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig5.jpg"> Figura 5: carregar da malha eletrônica em agulhas de vidro. (A) ilustração esquemática do processo de carregamento para a eletrônica do engranzamento plug-and-play. Uma agulha de vidro está posicionada perto do fim de I/O de uma sonda eletrônica de malha, enquanto ele está suspenso em solução. O êmbolo da seringa é então manualmente retraído para desenhar a malha eletrônica sonda. Posicionamento ideal é com a região de super flexível dispositivo apenas dentro da extremidade da agulha. Fotografias (B) correspondente a (A) de uma sonda eletrônica de malha sendo carregada em uma agulha de vidro. Escala de barras = 2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig5large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig6.jpg"> Figura 6: esquemático da estação de cirurgia estereotáxica. Uma armação estereotáxica motorizada (A) com titular da pipeta anexado é usada para posicionar a agulha para a região do cérebro desejado. A posição da agulha e carregado de malha eletrônica são monitorados com uma lente objetiva e anexado a câmera (B) e exibido em um computador (C). Uma bomba de seringa (D) flui precisos volumes de solução salina através da agulha, permitindo a injeção precisa, controlada de malha eletrônica na região do cérebro desejado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig7.jpg"> Figura 7: I/O Plug-and-play, interfaceando procedimento. (A) An FFC substrato de fixação é fixado com cimento dental adjacente a craniotomia. (B) Plug-and-play malha eletrônica stereotaxically é injetadas na região do cérebro desejado usando o método de FoV. (C), a agulha, com as almofadas de I/O da malha eletrônica sonda ainda está lá dentro, é reposicionado sobre o FFC substrato de fixação. (D) fluxo é retomado através da agulha para ejetar as almofadas de I/O para o FFC substrato de fixação. (E) as almofadas de I/O são dobrados a 90 ° em relação à haste, se desenrolava com a maestro virados para cima e secos no lugar. Substrato (F) o FFC é cortado com uma tesoura para uma linha recta ca. 0,5 mm da borda das almofadas do I/O. Substrato em excesso é cortado para permitir a inserção em um conector ZIF de 32 canais. Almofadas (G) a e/s são inseridas em um conector ZIF de 32 canais montado em um PCB personalizado. O conector ZIF é trancado fechada para fazer contato com as almofadas de I/O. (H), a trava é cimentada fechado, o PCB é invertido para o crânio e o PCB é fixado com cimento dental. (eu) o PCB forma um headstage compacto com um conector padrão de amplificador para interfaceamento fácil durante as sessões de gravação. Barras de escala = 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig7large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig8.jpg"> Figura 8: gravações comedidas e livremente movente. (A) fotografia de um rato C57BL/6J masculino em uma retenção durante uma sessão de gravação. Um pré-amplificador de 32 canais PCB foi inserido no conector amplificador padrão. (B) fotografia do mouse mesmo com pré-amplificador de 32 canais PCB durante um experimento de gravação livremente em movimento. Barras de escala = 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig8large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig9.jpg"> Figura 9: resultados representativos de gravação neural. (A) representante LFP mapas de calor de 32 canais de malha sondas eletrônica injetadas o rato hipocampo e córtex somatossensorial. Dados foram gravados enquanto o mouse livremente explorado sua gaiola em 2 meses (topo) e pós-injeção de 4 meses (parte inferior). Amplitude LFP é codificados por cores de acordo com a barra de cores à direita. Vestígios de filtrado de passa-alta (preto) mostrando atividade cravação são sobrepostos no espectrograma para cada um dos 32 canais. (B) picos isolados após a classificação dos dados plotados no (A). Atividade de cravação unitárias foi detectada no 26 da 32 canais de ambos os 2 meses pós-injeção (topo) e injeção de pós 4 meses (parte inferior). Os números acima de cada cluster de picos correspondem aos números de canal no (A). Esta figura foi modificada de Fu, et al 28. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig9large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig10.jpg"> Figura 10: resultados representativos histologia. (A) esquema ilustrando a orientação da malha eletrônica dentro horizontal (painel central) e sagital fatias de cérebro (painel inferior). (B) imagem de microscópio de fluorescência de uma fatia de espessura cortical cerebral de 10 µm um ano após a injeção de uma sonda eletrônica de malha de 16 canais. A fatia tem sido immunostained por NeuN (verde). (C) a mesma fatia do cérebro immunostained para Neurofilamento (vermelho). (D) o mesmo cérebro fatia immunostained para GFAP (ciano). (E), A imagem composta (B) a (D) mostrando o malha eletrônica/tecido interface com rotulado NeuN (verde), Neurofilamento (vermelho), GFAP (ciano) e malha eletrônica (azul). Barras de escala = 100 µm. Esta figura foi modificada em Fu et al . 27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig10large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Complementar Video 1: repetiu o carregamento e injeção de malha eletrônica na solução. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/video1.mp4">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Sondas de malha eletrônica perfeitamente integram e fornecem o nível estável, a longo prazo, single-neurônio gravação dentro do cérebro. Este protocolo usa malha eletrônica para na vivo experiências, envolvendo a fabricação de malha eletrônica, carregando em agulhas, injeção estereotáxica, interface de entrada/saída, experiências de gravação e histologia de tecido contendo malha sondas.

Malha de seringa injetável eletrônica para eletrofisiologia roedor crônica estável

Implantable brain electrophysiology probes are valuable tools in neuroscience due to their ability to record neural activity with high spatiotemporal ...

Esse método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurociência, como como os processos de envelhecimento se manifestam no cérebro, como o cérebro se desenvolve e como as doenças cerebrais se originam e progridem. A principal vantagem dessa técnica é que a eletrônica de malha não provoca uma resposta imune crônica na gliose, uma vez implantada no cérebro, e permite uma integração perfeita com o tecido neural circundante. Demonstrando o procedimento estarão Tao Zhou, um estudante de pós-graduação do Grupo Lieber, e Jung Min Lee, um pós-doutorado no Grupo Lieber.Para iniciar o procedimento, carregue um wafer de silício limpo em um evaporador térmico e evapore 100 nanômetros de níquel. Em seguida, gire o fotorresistente negativo SU-8 2000.5 no wafer a 400 rotações por minuto para uma espessura aproximada de SU-8 de 400 a 500 nanômetros. Carregue o wafer em um alinhador de máscara para expor o SU-8 com máscara de fotolitografia correspondente à camada inferior de malha SU-8.Expor na dose de linha I de 100 milijoules por centímetro quadrado. Eles, mergulhe o wafer em uma bandeja de revelador SU-8. Agite suavemente a solução por dois minutos, até que o padrão de malha no SU-8 esteja totalmente desenvolvido.Em seguida, enxágue o wafer em uma bandeja de álcool isopropílico por um minuto e seque. Asse o wafer em uma chapa quente a 180 graus Celsius por uma hora. Em seguida, gire a camada LOR 3A no wafer a 4.000 rotações por minuto para uma espessura aproximada de 300 nanômetros.Spin coat S1805 fotorresistente positivo a 4.000 rotações por minuto para uma espessura aproximada de 500 nanômetros. Em seguida, carregue o wafer em um alinhador de máscara para expor o S1805 com máscara de fotolitografia dois correspondentes às interconexões de metal e almofadas de entrada e saída. Exposto na dose da linha H a 40 milijoules por centímetro quadrado, em seguida, mergulhe o wafer em uma bandeja de revelador fotorresistente CD-26.Agite suavemente a solução por um minuto até que o padrão de interconexões de metal esteja totalmente desenvolvido. Enxágue o wafer em uma bandeja de água deionizada por um minuto e seque. Em seguida, evaporar termicamente três nanômetros de cromo seguidos por 80 nanômetros de ouro.Mergulhe o wafer em um béquer plano de removedor PG por aproximadamente três horas, até que o metal tenha sido totalmente rebaixado, deixando o metal apenas na interconexão desejada e nas regiões de almofada de entrada e saída da eletrônica de malha. Repita o revestimento de rotação, litografia, evaporação e decolagem para deixar três nanômetros de cromo e 50 nanômetros de platina nas regiões dos eletrodos. Posteriormente, repita o revestimento de rotação e a fotolitografia do SU-8 para definir a camada superior da malha do SU-8.Trate o wafer com plasma de oxigênio a 50 watts por um minuto. Depois, mergulhe o wafer em níquel em solução por aproximadamente três horas, até que a eletrônica da malha tenha sido completamente liberada do wafer de silício. Use uma pipeta pasteur para transferir as sondas eletrônicas de malha liberadas da corrosão de níquel para um béquer de 100 mililitros de água deionizada.Em seguida, transfira os componentes eletrônicos da malha para um béquer fresco de água deionizada pelo menos três vezes para garantir o enxágue. Para carregar a eletrônica da malha em uma agulha, insira uma agulha capilar de vidro no béquer de 100 mililitros de PBS contendo a eletrônica da malha. Posicione a extremidade da agulha perto das almofadas de entrada e saída de uma sonda eletrônica de malha e retraia manualmente a seringa para puxar uma sonda eletrônica de malha para dentro da agulha.Empurre e puxe o êmbolo da seringa enquanto ele ainda está imerso em solução salina para ajustar a posição dos componentes eletrônicos da malha dentro da agulha. Para injetar componentes eletrônicos de malha no cérebro de um camundongo, use uma broca dentária e uma estrutura estereotáxica para abrir uma craniotomia nas coordenadas desejadas no crânio. Abra uma segunda craniotomia longe do local da injeção para a inserção de um parafuso ou fio gráfico de aço inoxidável.Em seguida, fixe um substrato de fixação ao crânio com cimento dentário. Um corte de aproximadamente um milímetro de largura no substrato melhora a confiabilidade da etapa de dobra mais tarde no procedimento. Em seguida, monte o porta-pipetas com a agulha contendo os componentes eletrônicos da malha na estrutura estereotáxica usando uma extremidade em ângulo reto clamp.Conecte a saída lateral do porta-pipetas a uma seringa de cinco mililitros presa em uma bomba de seringa com um tubo capilar de 0.5 a um metro de comprimento. Em seguida, use a estrutura estereotáxica para posicionar a ponta da agulha no local inicial desejado dentro do cérebro. Posicione a câmera para exibir a parte superior da sonda eletrônica de malha dentro da agulha de vidro.Inicie o fluxo ajustando a bomba da seringa para uma velocidade baixa e pressionando start. Aumente lentamente a taxa de fluxo se a sonda eletrônica de malha não se mover dentro da agulha. À medida que a sonda eletrônica de malha começa a se mover dentro da agulha, use a estrutura estereotáxica para retrair a agulha na mesma taxa com que a sonda eletrônica de malha está sendo injetada usando a posição original marcada da eletrônica de malha como guia.Continue fluindo solução salina e retraindo a agulha até que a agulha saia do crânio. Em seguida, interrompa o fluxo da bomba de seringa. Neste procedimento, use a estrutura estereotáxica para guiar cuidadosamente a agulha para o substrato de fixação de cabo plano e flexível através da lacuna, fluindo a solução com a bomba de seringa para gerar uma folga nas interconexões eletrônicas da malha.Uma vez que a agulha esteja acima do substrato de fixação e através da lacuna, retome o fluxo rapidamente para injetar a entrada eletrônica da malha, almofadas de saída no substrato de fixação. Usando uma pinça e uma pipeta de água deionizada, dobre as almofadas de entrada e saída em um ângulo de 90 graus o mais próximo possível da primeira almofada de entrada e saída. Uma vez que a entrada, as almofadas de saída são alinhadas e dobradas e no ângulo de 90 graus em relação à haste da malha, seque-as no lugar com ar comprimido fluindo suavemente.Corte o clampsubstrato em uma borda estreita aproximadamente 0.5 a um milímetro da borda das almofadas de entrada, saída. Além disso, corte partes estranhas do clampsubstrato de fixação que impedirão a inserção no conector zif de 32 canais montado na placa de circuito impresso. Em seguida, insira as almofadas de entrada e saída no conector zif na placa de circuito impresso e feche a trava.Use a eletrônica de medição para medir a impedância entre os canais e o parafuso de aterramento para confirmar a interface bem-sucedida. Se os valores de impedância forem muito altos, destrave o conector zif, ajuste a inserção e teste novamente até que a conexão bem-sucedida seja confirmada. Posteriormente, cubra o conector zif e as interconexões eletrônicas de malha exposta com cimento dental para proteção.Vire o PCB na abertura do substrato e fixe o PCB com cimento no crânio do mouse. Para gravações em movimento livre, solte o mouse do limitador após inserir o préampplaca de circuito impresso e aterrar o parafuso de referência. Registre o período de tempo desejado usando o sistema de aquisição de dados enquanto o mouse se comporta livremente.Aqui são mostrados os mapas de calor de campo locais representativos das sondas eletrônicas de malha de 32 canais injetadas no hipocampo do camundongo e no córtex somatossensorial. Os dados foram registrados enquanto o camundongo explorava livremente sua gaiola dois meses e quatro meses após a injeção. A amplitude do potencial do campo local é codificada por cores de acordo com a barra de cores à direita.Traços de filtro passa-alta, pretos, mostrando atividade de pico são sobrepostos no espectrograma para cada um dos 32 canais. Aqui estão os picos isolados após a classificação dos dados plotados. A atividade de pico de unidade única foi detectada em 26 dos 32 canais, dois meses após a injeção e quatro meses após a injeção.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de testar a interface de E/S para confirmar a conexão elétrica bem-sucedida com a sonda eletrônica de malha. A impedância de medida ajuda a solucionar a origem de quaisquer problemas e é fundamental para identificar problemas de interface ou fabricação. Após este procedimento, a histologia pode ser realizada para estudar o ambiente celular ao redor de cada eletrodo registrado.Ao contrário das sondas cerebrais rígidas convencionais, a eletrônica da malha pode ser deixada no tecido durante a histologia, tornando possível correlacionar com precisão os dados de eletrofisiologia com a análise imuno-histoquímica.

syringe-injectable-mesh-electronics-for-stable-chronic-rodent

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Este protocolo descreve a montagem e o uso de um injetor para administração precisa de medicamentos em regiões cerebrais específicas de um rato anestesiado, seguido pelo monitoramento da atividade neuronal por meio de sinais elétricos registrados.

Microinjeção de Drogas com Registro Eletrofisiológico em Cérebro de Rato

O vídeo demonstra a injeção de sondas eletrônicas de malha no cérebro de um camundongo para gravações estáveis de longo prazo em um nível de neurônio único. Um camundongo anestesiado com o crânio exposto é preso em uma estrutura estereotáxica e a região do dispositivo de malha da sonda é injetada no cérebro por meio de orifícios perfurados. Os blocos de entrada e saída da sonda são conectados a um circuito e as gravações são obtidas usando um sistema de aquisição de dados.

Eletrônica de malha injetável para gravações estáveis de neurônio único no cérebro de um camundongo

Fonte: Lai, J., et al. Registro eletrofisiológico simultâneo e microinjeções de agentes inibitórios no cérebro de roedores. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo demonstra uma técnica baseada em microinjeção para registro e inibição neuronal simultânea no colículo superior de ratos. O procedimento envolve direcionamento estereotáxico, perfuração do crânio e a inserção de um injetor, que fornece um neurotransmissor inibitório enquanto registra a atividade neuronal. A estimulação da luz evoca potenciais...

Inibição da atividade neuronal e sua detecção usando eletrofisiologia em um rato

Aqui, criamos uma pipeta de vidro com funções duplas: inibição de estruturas cerebrais profundas por microinjeções de drogas e monitoramento em tempo real de seus efeitos por meio de registros eletrofisiológicos simultâneos.

Gravação simultânea eletrofisiológica e micro-injeções de agentes inibidores no cérebro do roedor

Aqui demonstramos o uso de uma tecnologia de habilitação sem fio para eletroencefalograma (EEG) em modelos de roedores neonatais de doenças humanas. Com a telemetria, não há conexões onerosas, permitindo assim comportamentos naturais.

Monitorização EEG contínuo a longo prazo no pequeno roedor modelos de doença humana, utilizando o Sistema Epoch transmissor sem fio

Apresentamos métodos para a construção de eletrodos para registrar simultaneamente a atividade neural extracelular e liberar múltiplas substâncias neuroativas nas proximidades dos locais de registro em camundongos acordados. Esta técnica permite a análise detalhada de entradas sinápticas locais putativas para o neurônio de interesse.

Extracelular Gravação de Neuronal Atividade Combinado com Microiontophoretic aplicação de substâncias neuroativos em Ratos Awake

Ratos anestesiados exibem não-fisiológicos pressão arterial sistêmica, que impede a avaliação significativa do tônus autonômico, dada a íntima relação entre a pressão arterial e o sistema nervoso autônomo. Assim, um método novo para a atividade do nervo simpático renal simultaneamente recorde e a pressão arterial com infusão intravenosa em ratos conscientes é descrito.

Nova abordagem para gravação simultânea da atividade do nervo simpático Renal e pressão arterial com infusão intravenosa em consciente, ratos desenfreados.

É descrito abaixo um método para a implantação de matrizes múltiplas do elétrodo do polímero através das regiões anatomicamente distantes do cérebro para a gravação eletrofisiológicos crônica em ratos livremente moventes. A preparação e a implantação cirúrgica são descritas detalhadamente, com ênfase nos princípios de design para orientar a adaptação desses métodos para uso em outras espécies.

Implante crônico de matrizes flexíveis múltiplas do elétrodo do polímero

Apresentamos um sistema de microinvacinação projetado para eletrofisiologia e entrega assistida de sondas experimentais (ou seja, nanossensores, microeletrodos), com infusão opcional de medicamentos. Componentes microfluídicos amplamente disponíveis são acoplados a uma cânula contendo a sonda. Um protocolo passo a passo para a construção de microinjectrodes está incluído, com resultados durante a infusão de muscimol no córtex de macaco.

Sistema de microininjeção para infusão combinada de drogas e eletrofisiologia

Aqui, apresentamos um sistema de implante de sonda leve e econômico para eletrofisiologia crônica em roedores otimizado para facilidade de uso, recuperação de sonda, versatilidade experimental e compatibilidade com o comportamento.

O implante DREAM: um sistema de implante leve, modular e econômico para eletrofisiologia crônica em camundongos com cabeça fixa e comportamento livre

Este protocolo foi desenvolvido para criar um sistema confiável e de fácil acesso para registrar EEG de roedores em movimento livre.

Um protocolo econômico e minimamente invasivo para gravação crônica de eletroencefalografia em vários locais em camundongos que se movem livremente

Aprenda a fabricar e implantar malha de seringa injetável eletrônica para eletrofisiologia crônica estável em roedores. Este método permite gravações de neurônios individuais por longos períodos sem resposta imune crônica.

Malha de seringa injetável eletrônica para eletrofisiologia roedor crônica estável

Explorar mais vídeos