Name: Benchtop imobilizada cromatografia de afinidade Metal, reconstituição e ensaio de um Polyhistidine Tagged Metalloenzyme para o laboratório de graduação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Aprenda a purificar e reconstituir metaloenzimas de ferro não-heme marcadas com polihistidina usando cromatografia de afinidade por metal imobilizado. Este protocolo acessível permite que estudantes de graduação explorem estrutura e função enzimática em laboratório didático.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Esta publicação é baseada em trabalho, apoiado pela Fundação Nacional de ciência sob Grant no.  CHE 1708237.

1. preparação para a purificação
<ol><li>Preparação do extrato bruto sem célula<ol>
<li>Obter um centrifugado ~ 9-10 g de Escherichia coli (BL21) que overexpressed Metaloproteína polyhistidine marcado25 em um tubo cónico de 50 mL.</li>
		<li>Adicione 5 mL por grama de tampão de Lise temp/bind de quarto (50 mM fosfato, 300 mM NaCl, imidazol 10 mM, pH 8) para a ~ 9-10 g de centrifugado para um volume total ~ 45-50 mL. Periodicamente o vórtice para incentivar a dissolução. Se o pellet foi congelado, descongele em banho de água morna.</li>
		<li>Utilizando banho de gelo, esfriar a suspensão de células para ~ 3 ° C, em preparação para a lise celular. Nota: Neste ponto, lise celular por sonication, trituração de grânulo ou outro método é possível. Trituração do grânulo é demonstrada aqui porque é rápido, relativamente barato e não exige proteção de orelha.</li>
		<li>Monte um grânulo de 50ml moagem câmara de acordo com as instruções do fabricante.</li>
		<li>Encha a câmara de moinho do grânulo meio cheio de refrigerados 0,1 grânulos de vidro de mm que foram armazenados a-20 ° C.</li>
		<li>Preencher o restante da câmara com a suspensão de eritrócitos refrigerados e usar o tampão de Lise/bind de 4 ° C para encher a câmara completamente.</li>
		<li>Use uma espátula pequena para girar o eixo do moinho do grânulo e a suspensão de células se misturam com os grânulos.</li>
		<li>Remover quaisquer bolhas grandes com uma pipeta e em seguida Atarraxe a tampa.</li>
		<li>Seque a câmara de fugas.</li>
		<li>Adicionar cerca de 1 xícara de gelo para a jaqueta clara, plástica, inverter a câmara preenchida 50 mL para a jaqueta cheia de gelo e parafuso fechado.</li>
		<li>Fixe a câmara de gelo-encamisado no motor.</li>
		<li>Transformar o moinho do grânulo motor por 15 segundos a 15.800 rpm e, em seguida, deixe para descansar por 45 segundos. Repita 8 vezes.</li>
		<li>Quando os 8 ciclos completos, decante a suspensão de lise de toda a célula para uma de 50 mL ou maior tubo de centrifugação de alta velocidade (25.000 x g ou superior). Coloca um par de tubos equilibrados na centrífuga e girar a 25.000 x g por 40-45 minutos a 4° C para granular célula grânulos de detritos e vidro. Nota: Se 50 mL ou tubos de maiores Pontuação: para centrifugação de alta velocidade não estiverem disponíveis, retire os grânulos de vidro por centrifugação a 1000 a 2000 x g por 2-3 min em um tubo cônico de 50 mL para produzir um volume menor de suspensão de células (~ 25 mL) que pode ser decantado para um menor volum tubo e avaliado por centrifugação de alta velocidade.</li>
		<li>Quando centrifugação é completa, decante os extratos claros, amarelos, sem célula, brutos em um tubo cónico de 50ml limpo. Tome cuidado para não transferir quaisquer detritos de células.</li>
		<li>Colete uma pequena amostra dos extratos brutos sem célula para posterior análise da purificação por SDS-PAGE26.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação da coluna IMAC<ol>
<li>Obter uma coluna de 1,5 x 20 cm, equipada com um suporte inferior da cama para reter as partículas de resina, uma tomada de fechamento de Luer e uma tampa superior que também contém um encaixe de Luer lock. Encaixe na tomada do conector Luer-lock com uma torneira de passagem para controlar o fluxo.</li>
		<li>Trabalhando para a bancada, firmemente monte a coluna em uma posição de anel.</li>
		<li>Obter uma pasta de 50% de resina de (Ni-NTA) ácida nitriloacetic níquel-limite em 20% de etanol foi armazenado a 4 ° C.</li>
		<li>Agite suavemente o frasco para uniformemente Ressuspender a resina.</li>
		<li>Trabalhando em temperatura ambiente- e sobre a bancada, uso estabeleceu-se uma pipeta graduada para retirar 2 mL do chorume, que renderá 1 mL de resina capaz de ligação 50-60 mg de polyhistidine tagged proteína e transferir o chorume para a coluna.</li>
		<li>Abra a torneira e deixe a solução de armazenamento em excesso para drenagem por gravidade da resina.</li>
		<li>Fechar a torneira com segurança</li>
		<li>Usando uma pipeta Pasteur, cuidadosamente adicionar tampão de Lise/bind refrigerados (50 mM fosfato, 300 mM NaCl, imidazol 10 mM, pH 8) e a coluna de resina – pelo menos 30 mL. Tome cuidado para não perturbar a superfície da resina. Execute o buffer as paredes da coluna para evitar salpicos.</li>
		<li>Equilibrar a resina, permitindo que o buffer de Lise/bind drenar lentamente da coluna por gravidade para um copo de coleção.</li>
		<li>Quando o tampão de Lise/bind principalmente drenou, fechar a torneira para interromper o fluxo de buffer quando ~ 5 mL de tampão de Lise permanece acima da resina e deixar a coluna, montada na vertical, até que esteja pronto para continuar, ou por até 1 semana.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. purificação do alvo Polyhistidine-marcados por IMAC
<ol><li>Prepare o tampão de lavagem (50 mM de fosfato, 300 mM de NaCl, pH 8 do imidazole de 20 mM) e o tampão de eluição (50mm fosfato, 300 mM de NaCl, imidazol 250 mM, pH 10% glicerol 8). Relaxar a 4° C.</li>
	<li>Prepare a coluna do Ni-NTA para a adição dos extratos brutos sem célula, abrindo a torneira e permitindo que o restante de tampão de Lise/ligação para drenagem por gravidade através da resina Ni-NTA. Quando drenou toda a reserva, e a superfície da resina é exposta, feche a torneira.</li>
	<li>O bruto grátis celular usando uma pipeta Pasteur, cuidadosamente pipeta extrai para a resina, tomando cuidado para não perturbar a superfície. Execute os extratos brutos as paredes da coluna para evitar salpicos. O volume de extratos brutos aplicado é dependente do nível de expressão da proteína polyhistidine-tag; assegurar que o volume total de extratos crus contém 50-60 mg ou menos de proteína alvo por mL de resina Ni-NTA (consulte a etapa 1.2.4).</li>
	<li>Quando todos os extratos brutos foram transferidos para a coluna, abra a torneira para que a coluna pode drenar por gravidade. Este fluxo através de é composto por proteínas que se não ligam para a resina – coletar 100 μL para posterior análise da purificação por SDS-PAGE. 26
</li>
	<li>A viscosidade dos extratos brutos sem célula pode diminuir o fluxo de gravidade da coluna consideravelmente. Para aumentar a taxa de fluxo, aplica um simples "mão-bomba":<ol>
<li>Pegue uma seringa de 10ml Luer-lock e conectá-lo à tampa da coluna usando um comprimento curto de tubo plástico e encaixes Luer-lock entre a tampa de coluna e a seringa. Retire o êmbolo da seringa e em seguida, encaixar firmemente a tampa da coluna na parte superior da coluna.</li>
		<li>Comprima suavemente o êmbolo da seringa enquanto manualmente, avaliar a taxa de fluxo através da recolha de eluente em um cilindro graduado; taxas de 1 a 2 mL por minuto são compatíveis com a resina e esta configuração. Delicadamente aumente a compressão do êmbolo da seringa como retarda a taxa de fluxo.</li>
		<li>Para evitar a introdução de ar na resina, retire a tampa da coluna anexado bomba manual quando o menisco do líquido aplicado atinge 5 a 10 mm acima da cama de resina e permitir que o volume restante para drenagem por gravidade.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quando os extratos brutos livre de célula tem terminado a drenagem e a superfície da resina é exposta novamente, use uma pipeta Pasteur cuidadosamente Adicionar 30 mL de tampão de lavagem refrigerado à coluna – tomando cuidado para não perturbar a superfície da resina. Execute o buffer as paredes da coluna para evitar salpicos.</li>
	<li>Abra a torneira e permitir que o tampão de lavagem drenar através da coluna. Este processo é remover proteínas fracamente acopladas da resina. Descarte o eluente.</li>
	<li>Enquanto o tampão de lavagem está drenando, preparar dezesseis, rotulado, microcentrifuga tubos para a coleta de frações de 1 mL.</li>
	<li>Quando o tampão de lavagem tem drenado e a superfície da resina é exposta novamente, feche a torneira. Use uma pipeta Pasteur cuidadosamente Adicionar 30 mL de tampão de eluição refrigerados à coluna – tomando cuidado para não perturbar a superfície da resina. Execute o buffer as paredes da coluna para evitar salpicos.</li>
	<li>Abra a torneira lentamente e permitir que o buffer de eluição para eluir a proteína polyhistidine marcado da coluna. Colete 1 mL de eluente em cada um dos tubos microcentrifuga marcado, 1 a 16.</li>
	<li>Teste as frações de proteínas usando o reagente e/ou instrumento fabricantes27,28um ensaio colorimétrico proteína tais como o ensaio de Bradford ou espectroscopia UV-visível de acordo com os métodos específicos. Como mostrado aqui, o ensaio colorimetric usando azul de Coomassie é reduzido a um volume de 100 μL para sacrificar apenas um pequeno volume de cada fração.</li>
	<li>Mix 3 μL de cada fração com 100 µ l de uma proteína colorimétrica do ensaio reagente e manualmente, observar a formação de qualquer cor para indicar a presença de proteína na fração; detecção com um espectrômetro não é necessária.</li>
	<li>Se a proteína é encontrada na fração 16, continue farmacológicos frações de 1 mL e ensaio para proteína periodicamente, até as frações eluted já não contêm uma quantidade significativa de proteína.</li>
	<li>Combinar proteína contendo frações em um tubo limpo cônico e retirar uma amostra de 100 μL para posterior análise por SDS-PAGE26.</li>
	<li>Prosseguir com a reconstituição do cofactor do íon do metal ou congelar a proteína em alíquotas de 3 mL a-80 ° C. Certifique-se que 10% de glicerol é incluído na eluição buffer é um crioprotetor para estabilizar a proteína pura durante o congelamento.</li>
	<li>Quando a eluição da coluna Ni-NTA é completa, ou seja, toda a proteína é a coluna e recolhidos em frações, passar outro 25 mL de tampão de eluição através da coluna e armazenar a coluna a 4 ° C em ~ 5 mL de tampão de eluição para armazenamento a curto prazo , ou tampão de Lise/bind com 20% de etanol para o armazenamento de longo prazo.</li>
</ol>3. reconstituição da proteina alvo com Fe2 +
<ol><li>Adição de Fe2 + Nota: Necessita de um ferro não-heme (II) vinculação da enzima, tais como a l-dopa dioxigenase neste exemplo, um íon2 + Fe para atividade; no entanto, o ferro (II) oxida prontamente ao ferro (III), que está inativo, e uma fração da proteína purifica sem qualquer ferro em tudo.<ol>
<li>Para iniciar a reconstituição do metal, obter 3 mL da enzima purificada suspendida em tampão de eluição. Se congelado, descongelar rapidamente através de um banho de água morna e uma vez descongelado, coloque a proteína no gelo.</li>
		<li>Usando o volume de proteína no tubo, calcule a quantidade de ascorbato de sódio (198.1 g/mol) necessário para fazer a concentração final de 12,5 mM na amostra. Além disso, calcule a quantidade de ditiotreitol (DTT, 154.25 g/mol) necessário para fazer a concentração final de 12,5 mM na amostra.</li>
		<li>Adicione o ascorbato de sódio sólido e TDT e suavemente, mas completamente, misture até para dissolver completamente. Tome cuidado para não causar precipitação de proteínas com mistura excessivamente agressivo. Adicione uma pequena quantidade de sulfato de ferro (II) hepta (MW 278.01 g/mol) para a amostra de proteína.</li>
		<li>A fim de obter uma quantidade bastante pequena da torneira sal, ferro 1 alguns milímetros grânulos de Filipa4•7H,2O sólido para fora em um pedaço de papel de pesar, dobram o papel sobre o grânulo e esmagá-lo com o lado liso de uma espátula de metal.</li>
		<li>Adicione um grão do pó resultante para o tubo de proteína.</li>
		<li>Vórtice de misturar e uma rosa cor-de-rosa aparecerá no tubo.</li>
		<li>Incube a solução-de-rosa da proteína, tampada, por 10-30 minutos no gelo. A cor rosa vai desaparecer lentamente ao longo do tempo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Filtração de gel<ol>
<li>Use uma coluna de filtração de gel embalada com 10 mL de gel de poliacrilamida esférico com um limite de exclusão de peso molecular de aproximadamente 6.000 e uma variedade de tamanho de partícula hidratado de 90 – 180 µm em uma coluna de 1.5 x 12 cm, que também é equipada com um reservatório de 10 mL. Certifique-se a coluna está equipada com o mais baixo e oferece suporte a cama superior sob a forma de 30 discos de polietileno poroso hum para reter a resina na coluna e impedir a cama de resina seco executado. Monte a coluna de filtração de gel para uma posição de anel.</li>
		<li>Se utilizar uma coluna de filtração de gel de pré-embalados, retire a tampa e despeje o buffer excesso acima do apoio da cama superior.</li>
		<li>Para equilibrar a coluna, comece por encher o reservatório com buffer compatível com subsequente do ensaio e armazenamento, por exemplo, 50 mM NaH2PO4, 200 mM NaCl, 10% de glicerol em pH 8.0.</li>
		<li>Se utilizar uma coluna de filtração de gel de pré-embalados, arrancar a ponta inferior da coluna de filtração de gel para iniciar o fluxo de buffer e expor o encaixe de deslizamento de Luer. Caber uma torneira de passagem para o fim de deslizamento de Luer da coluna, mas deixá-la aberta e permitir que a coluna a escorrer pela gravidade.</li>
		<li>Quando o buffer tem drenado da coluna e o apoio de cama superior é exposto, fechar a torneira e adicionar o ~ 3 mL de metalloenzyme o Fe (II) reconstituído à coluna pipetando a solução sobre o suporte da cama superior exposta.</li>
		<li>Abra a torneira e permitir que a amostra inteira 3,0 mL inserir a coluna por gravidade. Descarte esses primeiros 3 mL de eluente. Qualquer cor de rosa que se forma quando manusear a solução ficará preso no topo da coluna.</li>
		<li>Quando a coluna parou de pingar e o apoio de cama superior é exposto, adicione 4 mL de tampão de gel filtração (por exemplo, 50mm NaH2PO4, 200 mM NaCl, 10% de glicerol em pH 8.0) para a coluna. Abra a torneira e coletar o eluente em tubos microcentrifuga sobre oito fracções de 0,5 mL.</li>
		<li>Teste as frações de proteína usando um ensaio colorimétrico da proteína ou UV-Vis27,28 , conforme descrito anteriormente.</li>
		<li>Combine proteína contendo frações.</li>
		<li>Retire uma amostra para análise de SDS-PAGE26.</li>
		<li>Prosseguir com o ensaio ou armazenamento da amostra.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Hochuli, E., Bannwarth, W., Döbeli, H., Gentz, R., Stüber, D. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nbt1188-1321">Genetic Approach to Facilitate Purification of Recombinant Proteins with a Novel Metal Chelate Adsorbent.</a> Nature Biotechnology. 6 (11), 1321(1988).</li>
<li>Smith, M. C., Furman, T. C., Ingolia, T. D., Pidgeon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chelating+peptide-immobilized+metal+ion+affinity+chromatography.+A+new+concept+in+affinity+chromatography+for+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chelating peptide-immobilized metal ion affinity chromatography. A new concept in affinity chromatography for recombinant proteins.</a> Journal of Biological Chemistry. 263 (15), 7211-7215 (1988).</li>
<li>Block, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0076687909630275">Chapter 27 Immobilized-Metal Affinity Chromatography (IMAC): A Review.</a> Methods in Enzymology. , 439-473 (2009).</li>
<li>Derewenda, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+recombinant+methods+and+molecular+engineering+in+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The use of recombinant methods and molecular engineering in protein crystallization.</a> Methods. 34 (3), 354-363 (2004).</li>
<li>Gräslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein production and purification.</a> Nature Methods. 5 (2), 135-146 (2008).</li>
<li>Switzer, R. L., Garrity, L. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSwitzer%2C+RL+%22Experimental+Biochemistry%22">Experimental Biochemistry</a>. , Macmillan. (1999).</li>
<li>Boyer, R. <a target="_blank" href="https://www.pearson.com/us/higher-education/program/Boyer-Modern-Experimental-Biochemistry-3rd-Edition/PGM122783.html">Modern Experimental Biochemistry, 3rd Edition</a>. , (2001).</li>
<li>le Maire, M., Chabaud, R., Hervé, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3ale+Maire%2C+M+%22Laboratory+Guide+to+Biochemistry%2C+Enzymology%2C+and+Protein+Physical+Chemistry%3A+A+Study+of+Aspartate+Transcarbamylase%22">Laboratory Guide to Biochemistry, Enzymology, and Protein Physical Chemistry: A Study of Aspartate Transcarbamylase</a>. , Springer Science & Business Media. (2012).</li>
<li>Bettelheim, F. A., Landesburg, J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBettelheim%2C+FA+%22Laboratory+Experiments+for+General%2C+Organic%2C+and+Biochemistry%22">Laboratory Experiments for General, Organic, and Biochemistry</a>. , Thomson Brooks/Cole. (2013).</li>
<li>Anderson, A. J. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ed065p901">Affinity chromatography of lactate dehydrogenase: An experiment for the undergraduate biochemistry laboratory.</a> Journal of Chemical Education. 65 (10), 901(1988).</li>
<li>Boyer, R. F. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ed068p430">Purification of milk whey α-lactalbumin by immobilized metal-ion affinity chromatography.</a> Journal of Chemical Education. 68 (5), 430(1991).</li>
<li>Moffet, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+gene+mutation+to+protein+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">From gene mutation to protein characterization.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 37 (2), 110-115 (2009).</li>
<li>Sommer, C. A., Silva, F. H., Novo, M. T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teaching+molecular+biology+to+undergraduate+biology+students%3A+An+illustration+of+protein+expression+and+purification%2A%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">Teaching molecular biology to undergraduate biology students: An illustration of protein expression and purification*.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 32 (1), 7-10 (2004).</li>
<li>Wu, Y., Zhou, Y., Song, J., Hu, X., Ding, Y., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+green+and+red+fluorescent+proteins+to+teach+protein+expression%2C+purification%2C+and+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">Using green and red fluorescent proteins to teach protein expression, purification, and crystallization.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 36 (1), 43-54 (2008).</li>
<li>Ward, W. W., Swiatek, G. C., Gonzalez, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+in+biotechnology+education%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein in biotechnology education.</a> Methods in enzymology. 305, 672-680 (2000).</li>
<li>Kay, B. K., Winter, J., McCafferty, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKay%2C+BK+%22Phage+Display+of+Peptides+and+Proteins%3A+A+Laboratory+Manual%22">Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual</a>. , Elsevier. (1996).</li>
<li>Arkus, K. A. J., Jez, J. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21591176">An integrated protein chemistry laboratory.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 36 (2), 125-128 (2008).</li>
<li>Crowley, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+purification%2C+and+characterization+of+a+recombinant+flavin+reductase+from+the+luminescent+marine+bacterium+Photobacterium+leiognathi%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">Expression, purification, and characterization of a recombinant flavin reductase from the luminescent marine bacterium Photobacterium leiognathi.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 38 (3), 151-160 (2010).</li>
<li>Colabroy, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+writing-intensive%2C+methods-based+laboratory+course+for+undergraduates%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%3A+A+Bimonthly+Publication+of+the+International+Union+of+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A writing-intensive, methods-based laboratory course for undergraduates.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education: A Bimonthly Publication of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology. 39 (3), 196-203 (2011).</li>
<li>Kreiling, J. L., Brader, K., Kolar, C., Borgstahl, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+real-time+and+hands-on+research+course+in+protein+purification+and+characterization%3A+Purification+and+crystal+growth+of+human+inosine+triphosphate+pyrophosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">A real-time and hands-on research course in protein purification and characterization: Purification and crystal growth of human inosine triphosphate pyrophosphatase.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 39 (1), 28-37 (2011).</li>
<li>Gray, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Known+structure%2C+unknown+function%3A+An+inquiry-based+undergraduate+biochemistry+laboratory+course%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">Known structure, unknown function: An inquiry-based undergraduate biochemistry laboratory course.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 43 (4), 245-262 (2015).</li>
<li>Kocabas, E., Hernick, M. <a target="_blank" href="https://www.omicsonline.org/metalloenzymes-use-of-recombinant-protein-expression-and-affinity-tags-to-aid-identification-of-native-metal-ion-cofactors-2161-1009.1000132.php?aid=11177">Metalloenzymes: Use of Recombinant Protein Expression and Affinity Tags to Aid Identification of Native Metal Ion Cofactors.</a> Biochemistry & Analytical Biochemistry. 2 (2), 1-3 (2013).</li>
<li>Ellis, W. R. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/3527600906.mcb.200400107/abstract">Metalloenzymes.</a> Reviews in Cell Biology and Molecular Medicine. , (2006).</li>
<li>Williams, R. J. P., Begley, T. P. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/9780470048672.wecb327/abstract">Metallo-Enzymes and Metallo-Proteins, Chemistry of.</a> Wiley Encyclopedia of Chemical Biology. , (2007).</li>
<li>Mierendorf, R. C., Morris, B. B., Hammer, B., Novy, R. E. <a target="_blank" href="https://Link.springer.com/protocol/10.1385/0-89603-485-2:257">Expression and Purification of Recombinant Proteins Using the pET System.</a> Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. , 257-292 (1998).</li>
<li>He, F. <a target="_blank" href="https://bio-protocol.org/bio101/e80">Laemmli-SDS-PAGE.</a> BIO-PROTOCOL. 1 (11), (2011).</li>
<li>He, F. <a target="_blank" href="https://bio-protocol.org/bio101/e45">Bradford Protein Assay.</a> BIO-PROTOCOL. 1 (6), (2011).</li>
<li>Johnson, M. <a target="_blank" href="https://www.labome.com/method/Protein-Quantitation.html">Protein Quantitation.</a> Materials and Methods. , (2017).</li>
<li>Colabroy, K. L., Hackett, W. T., Markham, A. J., Rosenberg, J., Cohen, D. E., Jacobson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+L-DOPA+2%2C3-dioxygenase%2C+a+single-domain+type+I+extradiol+dioxygenase+from+lincomycin+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of L-DOPA 2,3-dioxygenase, a single-domain type I extradiol dioxygenase from lincomycin biosynthesis.</a> Arch Biochem Biophys. 479 (2), 131-138 (2008).</li>
<li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fitting+enzyme+kinetic+data+with+KinTek+Global+Kinetic+Explorer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Fitting enzyme kinetic data with KinTek Global Kinetic Explorer.</a> Methods in Enzymology. , 601-626 (2009).</li>
<li>Kemmer, G., Keller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+least-squares+data+fitting+in+Excel+spreadsheets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Nonlinear least-squares data fitting in Excel spreadsheets.</a> Nature Protocols. 5 (2), 267-281 (2010).</li>
<li>Wang, Y. Z., Lipscomb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning%2C+overexpression%2C+and+mutagenesis+of+the+gene+for+homoprotocatechuate+2%2C3-dioxygenase+from+Brevibacterium+fuscum%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Cloning, overexpression, and mutagenesis of the gene for homoprotocatechuate 2,3-dioxygenase from Brevibacterium fuscum.</a> Protein Expr Purif. 10 (1), 1-9 (1997).</li>
<li>Amaya, A. A., Brzezinski, K. T., Farrington, N., Moran, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+human+homogentisate+1%2C2-dioxygenase%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of human homogentisate 1,2-dioxygenase.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 421 (1), 135-142 (2004).</li>
<li>Johnson-Winters, K., Purpero, V. M., Kavana, M., Nelson, T., Moran, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-Hydroxyphenyl%29pyruvate+Dioxygenase+from+Streptomyces+avermitilis%3A+The+Basis+for+Ordered+Substrate+Addition%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">4-Hydroxyphenyl)pyruvate Dioxygenase from Streptomyces avermitilis: The Basis for Ordered Substrate Addition.</a> Biochemistry. 42 (7), 2072-2080 (2003).</li>
<li>Bugg, T. D. H. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/016748389390013H">Overproduction, purification and properties of 2,3-dihydroxyphenylpropionate 1,2-dioxygenase from Escherichiacoli. Biochimica et Biophysica Acta (BBA).</a> Protein Structure and Molecular Enzymology. 1202 (2), 258-264 (1993).</li>
<li>Mendel, S., Arndt, A., Bugg, T. D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acid-Base+Catalysis+in+the+Extradiol+Catechol+Dioxygenase+Reaction+Mechanism+Site-Directed+Mutagenesis+of+His-115+and+His-179+in+Escherichia+coli+2%2C3-Dihydroxyphenylpropionate+1%2C2-Dioxygenase+%28MhpB%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Acid-Base Catalysis in the Extradiol Catechol Dioxygenase Reaction Mechanism Site-Directed Mutagenesis of His-115 and His-179 in Escherichia coli 2,3-Dihydroxyphenylpropionate 1,2-Dioxygenase (MhpB).</a> Biochemistry. 43 (42), 13390-13396 (2004).</li>
<li>Viggiani, A., Siani, L., Notomista, E., Birolo, L., Pucci, P., Di Donato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+the+Conserved+Residues+His-246%2C+His-199%2C+and+Tyr-255+in+the+Catalysis+of+Catechol+2%2C3-Dioxygenase+from+Pseudomonas+stutzeri+OX1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Role of the Conserved Residues His-246, His-199, and Tyr-255 in the Catalysis of Catechol 2,3-Dioxygenase from Pseudomonas stutzeri OX1.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (47), 48630-48639 (2004).</li>
<li>Uragami, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structures+of+substrate+free+and+complex+forms+of+reactivated+BphC%2C+an+extradiol+type+ring-cleavage+dioxygenase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inorganic+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Crystal structures of substrate free and complex forms of reactivated BphC, an extradiol type ring-cleavage dioxygenase.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 83 (4), 269-279 (2001).</li>
<li>Veldhuizen, E. J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steady-state+kinetics+and+inhibition+of+anaerobically+purified+human+homogentisate+1%2C2-dioxygenase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Steady-state kinetics and inhibition of anaerobically purified human homogentisate 1,2-dioxygenase.</a> Biochemical Journal. 386 (Pt 2), 305-314 (2005).</li>
</ol>

Os autores têm sem divulgações.

Enquanto a adição de tags de polyhistidine para proteínas recombinantes e sua purificação por IMAC tornou-se praticamente onipresente na literatura bioquímica3,4,5, aplicações de IMAC para purificação da enzima na bioquímica, laboratório de ensino permanecem esparsas e métodos publicados não considera sempre as limitações de recursos do ensino de laboratório20. Além disso, o uso do IMAC no laboratório de ensino é mais eficaz quando acoplado a experimentos que avaliam a atividade e pureza, fazendo a purificação do IMAC de uma enzima de uma atividade instrucional ideal. A fim de alargar a aplicação do IMAC para a purificação de enzimas, incluindo metaloenzimas, no laboratório de ensino, são necessários métodos confiáveis e baratos. Neste protocolo, demonstramos benchtop IMAC usando fontes de laboratório prontamente disponíveis e baratos, ao abordar também as limitações na aplicação do IMAC para metalloproteins22, por reconstituir a iron(II) dependente metalloenzyme, l-dopa dioxigenase, postar a purificação. Usando os reagentes e materiais descritos, estimamos que o custo de consumíveis para oito grupos de estudantes é entre 500-600 dólares por semestre para executar este protocolo, incluindo as etapas de análise descritas na Figura 1 e Figura 2.
Devido à facilidade com que Fe2 + pode dissociar aminoácido ligantes24 e a oxidação superficial de Fe2 + por O2 de Fe3 +, reconstituição de não-heme, é aminoácido quelado iron(II) em um metalloenzyme recombinante um componente típico da purificação da enzima. Quando cromatografia clássica é usada, é possível evitar a perda total de ferro em alguns casos,32, mas mais frequentemente, o ferro (II) é adicionado volta na presença de agentes redutores33,34,35, 36 , muitas vezes sob um anaeróbio atomosphere37,38,39e em alguns casos o excesso de ferro não é removido de34,33,36, complicando qualquer ensaio subsequente. Etapas consecutivas de cromatografia clássica e uma atmosfera anaeróbia não são realistas para o laboratório de graduação, solicitando o desenvolvimento do presente protocolo.
Enquanto a preparação manual da coluna Ni-NTA e processamento de amostras em grande parte por gravidade demora adicional tempo e esforço quando comparado com colunas pré-embalados e automatizado de instrumentação de cromatografia, as etapas manuais permitem hands-on pelo aluno que resultam em maior compreensão da ciência por trás do processo de aprendizagem. A adição de um sal de ferro (II) nas condições descritas aqui é particularmente sensível a excesso ditiotreitol. Se um estudante equivocadamente adiciona um excesso de ditiotreitol, um evento de precipitação é provável. Encontrámo-lo útil para exigem que os alunos realizar cálculos de quantidades de reagentes antes de chegar no laboratório, portanto tempo de laboratório pode ser usado mais eficazmente no banco. A purificação de toda bancada IMAC - de lise celular para eluição de proteína - pode ser realizada em um período de 4 horas de laboratório, seguido de reconstituição e ensaio em um período subsequente de laboratório.

Os primeiros relatos da purificação de uma proteína polyhistidine com a tag de extractos de um organismo hospedeiro usando quelante da marca histidina por um metal imobilizado entraram para a literatura em 19881,2. Desde então, a adição de tags de polyhistidine para proteínas recombinantes e sua purificação por cromatografia de afinidade de metal imobilizado (IMAC) tornaram-se praticamente onipresente na literatura bioquímica3,4, 5. Métodos de purificação de IMAC podem ser implementados sobre a bancada, usando cromatografia automatizada e em formatos de rotação-coluna. Enquanto os métodos de purificação da afinidade, especialmente o IMAC, são amplamente utilizados em laboratório de pesquisa, eles são menos comuns em laboratório de ensino de graduação. Os manuais de laboratório mais amplamente utilizado para o laboratório de bioquímica rotineiramente não ensinam esses métodos, optando por troca iônica mais tradicional ou corantes cromatografia6,7,8 , 9. por exemplo, a purificação da lactato desidrogenase por Anderson10 usa afinidade por corantes, e a purificação do leite bovino α-lactoalbumina7,11 por Boyer usa um níquel-nitriloacetic matriz de ácido, mas nenhuma marca de poli-histidina recombinantes, confiando preferivelmente em afinidade intrínseca da proteína para a resina. Um moderno laboratório de graduação livros e publicações implementar a cromatografia de afinidade de metal imobilizado em alvos de proteína poli-histidina marcado como proteínas verde ou vermelho-fluorescente12,13, 14,15, anticorpos16e enzimas selecionadas17,18,19,20, até mesmo alguns de função desconhecida21. Indiscutivelmente, a purificação de uma enzima é preferível no laboratório de ensino, porque o alvo pode ser analisado para a atividade em sessões subsequentes, enriquecendo a experiência de "verdadeira ciência" por parte do aluno; na verdade, esses tipos de experiências de laboratório foram publicados e resultados benéficos na aprendizagem do aluno relataram17,18,20,21. E ainda, aplicações de IMAC para purificação da enzima na bioquímica de ensino laboratório permanecem escassos, e os métodos publicados nem podem presumir acesso à instrumentação de cromatografia que normalmente não está disponível para usam em laboratório de sala de aula 20. também há limitações na aplicação do IMAC para pesquisas, especialmente aqueles que se ligam a metais divalentes de redox sensíveis que são essenciais para a atividade22. Frequentemente, o íon metálico é perdido ou oxidado durante a purificação, rendendo uma enzima inativa inadequados para o laboratório de graduação.
Um terço completo de enzimas ligam um íon metálico,23, e apesar de uma exigência quase universal para o ferro em todas as formas de vida23, ferro é, sem dúvida entre os íons metálicos mais problemáticos em Enzimologia. Non-heme Fe2 + ligação enzimas são particularmente propensas à perda e/ou oxidação do metal durante IMAC; presumivelmente devido à falta de um ligante orgânico dedicado como hemo e a facilidade com que Fe2 + pode dissociar aminoácido ligantes24. Além disso, a oxidação dependente do oxigênio de Fe2 + Fe3 + é espontânea em solução aquosa, devido a mudança de energia livre negativa e a relativa estabilidade da Fe3 +. Frequentemente, estes desafios são superados pelo uso de anaeróbios atmosfera e/ou não-IMAC métodos cromatográficos22. Neste artigo, vamos demonstrar o uso de bancada IMAC para purificar o Fe2 + dependentes metalloenzyme l-dopa dioxigenase usando fontes de cromatografia simples, barato, seguidas-se a reconstituição do sítio activo Fe2 +, e ensaio enzimático. Esses métodos são padrão em nosso próprio laboratório de bioquímica graduação de grupos de estudantes de 6-12 e podem ser usados para ampliar o repertório das investigações de enzima na graduação.

<table><tbody><tr><td>consumíveis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BeadBeater 0,1 mm contas de vidro</td><td>Produtos BioSpec 11079101</td><td></td><td>1 libra cada</td></tr><tr><td>Tubos cónicos de 50 ml com tampas de rosca, estéreis</td><td>VWR</td><td>21008-178</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Fisher Bioreagentes</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potássio, monobásico</td><td>Acros (Fisher)</td><td>AC42420-5000</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbato de Sódio</td><td>Acros (Fisher)</td><td>AC35268-1000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DTT (Ditiotreitol)</td><td>Lab Scientific</td><td>D-115</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de Ferro(II) heptahidratado</td><td>Sigmaaldrich</td><td>310077</td><td></td></tr><tr><td>HisPur Resina NiNTA&nbsp;</td>Colunas de Cromatografia <td>Econo-Coluna Fisher (pierce)</td><td>PI88221</td><td></td></tr><tr><td>- 1.5 x 20cm</td><td>Bio-Rad</td><td>737-1522&nbsp;</td><td>1,5 x 20 cm, 35 ml, 2ea,&nbsp;</td></tr><tr><td>Válvula de torneira, unidirecional, fêmea para macho Luer</td><td>Kimble</td><td>420163-0000</td><td>pacote de 50</td></tr><tr><td>seringas BD 10mL luer-loc (não estéril, sem agulha)</td> <td>VWR</td><td>301029</td><td></td></tr><tr><td>Encaixe para tubulação: 1,6 mm Barb para Fêmea Luer</td><td>Biorad</td><td>7318222</td><td></td></tr><tr><td>Encaixe para tubulação: 1,6 mm Barb para Macho Luer&nbsp;</td>Tubo <td>de Silício 7318225</td><td></td> <td>Biorad</td></tr><tr><td>(1,6 mm ID/0,8 mm de parede, para 0,2-5 ml/min na Bomba Peristáltica)</td><td>Bio-Rad</td><td>7318211</td><td>Pacote de 1, 1,6 mm ID/0,8 mm de parede, 10 m, tubo de baixa pressão para manuseio de líquidos</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher (Pierce)</td><td>17904</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Plus (Bradford) Ensaio de Proteína</td><td>Thermo Scientitic</td><td>23236</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de Microcentrífuga, tampa de pressão, 1,5mL</td><td>VWR</td><td>89000-028</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas descartáveis de poliestireno Fisherbrand</td> Bomba de pipeta universal <td>Fisher</td><td>13-676-10F</td><td></td></tr><tr><td>Fiserbrand</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>14-955-110</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de Transferência Fisherbrand</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>13-711-9AM</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Pac 10DG colunas de dessalinização</td><td>Bio-Rad</td><td>732-2010</td><td>caixa de 30</td></tr><tr><td>ExpressPlus PAGE 5x buffer de amostra</td><td>Genscript</td><td>MB01015</td><td>5mL (Diluir 1:5 com amostra)</td></tr><tr><td>ExpressPlus PAGE Gel, 4-20%, 12 poços</td><td>Genscript</td><td>M42012</td><td>20 géis</td></tr><tr><td>Cuvetes Descartáveis Fisherbrand, Methyacrylate</td><td>Fisher</td><td>14-955-128&nbsp;</td><td>Caixa de 500</td></tr><tr><td>Tampas de Cubeta Quadradas Descartáveis</td><td>Fisher</td><td>14-385-999</td><td></td></tr><tr><td>L-DOPA (3,4-dihidroxifenilalanina)</td><td>Acros</td><td>D9628-5G</td><td></td></tr><tr><td>Equipamento Permanente:&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Câmara BeadBeater 50mL&nbsp;</td><td>Produtos BioSpec</td><td>110803-50SS</td><td>1 câmara</td></tr><tr><td>BeadBeater</td><td>Produtos BioSpec</td><td>1107900-101</td><td>Câmara de policarbonato de 350 ml, conjunto do rotor, base do motor, camisa de resfriamento de água gelada e meio quilo de contas de vidro.</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga, PPCO de alta velocidade, 50mL</td><td>Fisher</td><td>3119-0050PK</td><td></td></tr><tr><td>Célula de Eletroforese Vertical Mini-PROTEAN Tetra para Mini Géis Pré-moldados, 4-gel</td><td>Bio-Rad</td><td>1658004</td><td>&nbsp; Sistema de eletroforese vertical de 4 gels, inclui montagem de eletrodos, módulo de corrida complementar, tanque, tampa com cabos de alimentação, mini buffer de célula Dam</td></tr><tr><td>Fonte de Alimentação PowerPac HC</td><td>Bio-Rad</td><td>1645052</td><td>100&ndash; 120/220&ndash; 240 V, fonte de alimentação para aplicações de alta corrente, inclui cabo</td></tr><tr><td>de alimentação UV-1800 com software de sonda UV</td><td>Shimadzu</td><td>UV-1800</td><td></td></tr><tr><td>Kintek Global Kinetic</td><td>Explorer Kintek Corp</td><td>versão 6</td><td>https://www.kintekexplorer.com/downloads/</td></tr></tbody></table>

benchtop imobilizada cromatografia de afinidade metal, reconstituição e ensaio de um polyhistidine tagged metalloenzyme para o laboratório de graduação

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Cromatografia de afinidade metal de bancada imobilizada (IMAC), de proteínas do polyhistidine com a tag é facilmente dominada por estudantes de graduação e tornou-se o método de purificação de proteínas mais amplamente utilizado na literatura moderna. Mas, a aplicação da cromatografia de afinidade às proteínas de ligação metal, especialmente aqueles com metais sensíveis de redox, tais como o ferro, muitas vezes é limitada a laboratórios com acesso a uma caixa de luva - equipamento que não é rotineiramente disponível nos cursos de graduação laboratório. Neste artigo, demonstramos a nossos bancada métodos para isolamento, purificação e metal-íon reconstituição de um poli-histidina marcado IMAC, ligação de ferro não-heme redox-ativo extradiol dioxigenase e o ensaio do dioxigenase com substrato variado concentrações e saturação de oxigênio. Esses métodos são executados por alunos de graduação e implantados no laboratório de ensino e pesquisa da graduação com instrumentação que é acessível e disponível principalmente de graduação das instituições.

Estes resultados representativos foram coletados por estudantes de graduação como executaram este protocolo durante dois períodos de laboratório curso de 341 BCM: bioquímica Experimental na faculdade de Muhlenberg. A Figura 1 demonstra os resultados da purificação de um 20 kDa poli-histidina tagged metalloenzyme, l-dopa dioxigenase, como realizado por dois alunos de graduação, durante um período de laboratório de sala de aula de 4 horas e analisaram por SDS-PAGE pelo mesmo alunos durante um período subsequente de laboratório. A proteína de poli-histidina marcado é efetivamente purificado (Figura 1, faixa 2). Um immunoblot do gel usando anticorpo contra a tag poli-histidina indica que uma pequena quantidade da proteína alvo poli-histidina marcado é perdida no escoamento (dados não mostrados), provavelmente porque o maior que a quantidade de 100 mg de proteína do alvo na lisado excedeu a capacidade de ligação da resina.
A Figura 2 demonstra os dados de atividade de coleta de estudante na reação enzimática do destino marcou metalloenzyme poli-histidina, l-dopa dioxigenase, após a reconstituição com ferro (II) e gel-filtração subsequente conforme descrito pelo protocolo de neste documento. O segundo de cinco mortos-tempo antes que os dados coletados começa é típico dos alunos executar esta técnica pela primeira vez. A atividade robusta do metalloenzyme foi detectada usando um ensaio publicado e rendeu o estado estacionário de parâmetros cinéticos consistentes com resultados publicados29. Estado estacionário de parâmetros cinéticos foram determinados por encaixe das curvas de progresso30 mostrado na Figura 2; no entanto, não-linear mínimos quadrados encaixe das taxas iniciais recolhidos ao longo de uma série de concentrações de substrato é igualmente possível31.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58012/58012fig1.jpg"> Figura 1. Análise de SDS-PAGE26 do poli-histidina etiquetado proteína antes, durante e após a purificação. Faixas 1 - marcadores de Peso Molecular, post 2-purificado da proteína (20 kDa) Ni-NTA, 3-Ni-NTA fluir, 4 - celular grátis extratos brutos antes da purificação, 5 - celular-detritos da pelota post do lysis da. Amostras foram preparadas usando 5 x tampão de amostra/carregamento e separadas em géis de poliacrilamida pre-cast 4-20% usando um sistema de electroforese do gel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58012/58012fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58012/58012fig2.jpg"> Figura 2. Ensaio de estado estacionário de ferro (II) reconstituído metalloenzyme (i.e., a l-dopa dioxigenase, 10) com o substrato (l-dopa-5 µM (vermelho), e 25 µM (verde), e 50 µM (azul)) no buffer (fosfato de 50 mM, 200 mM NaCl, pH 8). Traços retratam a formação de produto em 414nm. Dados de absorbância foram adquiridos continuamente usando cubetas de metacrilato de 1 mL na digitalização de espectrômetro UV-visível29, um split-feixe. Dados brutos estão aptos para um modelo de Michaelis-Menten aproximação de estado estacionário (KM 30.8 µM ± 14,4, kgatoaparente 2.3 s-1 ± 0,05)30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58012/58012fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Aqui nós apresentamos um protocolo para a purificação de cromatografia de afinidade metal benchtop imobilizada e posterior reconstituição de um polyhistidine com a tag, o ferro não-heme vinculação dioxigenase apropriado para o laboratório de ensino de graduação.

Benchtop imobilizada cromatografia de afinidade Metal, reconstituição e ensaio de um Polyhistidine Tagged Metalloenzyme para o laboratório de graduação

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

Esse método permite que os alunos de graduação purifiquem rapidamente as metaloenzimas de ligação ao ferro e, em seguida, usem essa proteína para responder a perguntas-chave sobre estrutura e função, tudo dentro dos limites do laboratório de ensino. A principal vantagem desta técnica é que ela é aplicável a enzimas de ligação de ferro não heme. É acessível a alunos de graduação e é prontamente implementado no laboratório de ensino.Para iniciar este procedimento, obtenha uma coluna de 1,5 por 20 centímetros equipada com uma saída luer lock, uma tampa superior que também contém um encaixe luer lock e um suporte de leito inferior para reter partículas de resina. Encaixe o encaixe de trava luer inferior com uma torneira para controlar o fluxo. Em seguida, obtenha um frasco contendo uma pasta de 50% de resina de ácido nitriloacético ligado a níquel em 20% de etanol que foi previamente armazenado a quatro graus Celsius.Gire suavemente a garrafa para ressuspender uniformemente a resina. Trabalhando em temperatura ambiente, use uma pipeta graduada para retirar dois milímetros da pasta e transferi-la para a coluna. Depois que o excesso de solução de armazenamento for drenado da resina, use uma pipeta Pasteur para adicionar cuidadosamente pelo menos 30 mililitros de tampão de ligação de lise resfriado, certificando-se de não perturbar a superfície da resina.Passe o buffer pelas paredes da coluna para evitar respingos. Equilibre a resina permitindo que o tampão escorra lentamente da coluna por gravidade para um copo de coleta. Para começar, preparar a coluna de níquel-NTA para a adição dos extractos brutos sem células, abrindo a torneira e deixando o tampão de ligação de lise remanescente ser drenado por gravidade através da resina de níquel-NTA.Quando o tampão estiver completamente drenado e a superfície da resina exposta, feche a torneira. Em seguida, use uma pipeta Pasteur para pipetar cuidadosamente os extratos brutos livres de células na resina, tomando cuidado para não perturbar a superfície. Passe os extratos brutos pela parede da coluna para evitar respingos.Depois de todos os extractos brutos terem sido transferidos para a coluna, abrir a torneira para que a coluna possa drenar por gravidade. Colete 100 microlitros do fluxo para análise posterior. Use um pequeno pedaço de tubo de plástico para conectar uma seringa luer lock de 10 mililitros à tampa da coluna.Retire o êmbolo da seringa e, em seguida, encha firmemente a tampa da coluna no topo da coluna. Comprima suavemente o êmbolo enquanto coleta o eluente em um cilindro graduado para avaliar manualmente a vazão. Taxas entre um e dois mililitros por minuto são compatíveis com a resina e a configuração experimental.Aumente suavemente a compressão do êmbolo da seringa à medida que a taxa de fluxo diminui. Quando o menisco do líquido aplicado atingir de cinco a 10 mililitros acima do leito de resina, remova a tampa da coluna e a bomba manual anexada para evitar a introdução de ar na resina. Deixe o volume restante escorrer por gravidade.Depois que os extratos brutos terminarem de drenar e a superfície da resina for exposta novamente, use uma pipeta Pasteur para adicionar cuidadosamente cerca de 30 mililitros de tampão de lavagem resfriado à coluna, tomando cuidado para não perturbar a superfície da resina. Abra a torneira e deixe o tampão de lavagem escorrer pela coluna. Enquanto a coluna está drenando, rotule 16 tubos de microcentrífuga para coleta de frações.Quando o tampão estiver completamente drenado e a superfície da resina for exposta novamente, feche a torneira. Usando uma pipeta Pasteur, adicione cuidadosamente cerca de 30 mililitros de tampão de eluição resfriado à coluna, tomando cuidado para não perturbar a superfície da resina. Em seguida, abra a torneira lentamente para permitir que o tampão de eluição elua a proteína marcada com poli-histidina da coluna.Recolha um mililitro de eluente em cada um dos tubos de microcentrífuga marcados. Após o teste de proteína, combine as frações contendo proteínas em um tubo cônico limpo. Prossiga com uma reconstituição do cofator de íons metálicos ou congele a proteína em alíquotas de três mililitros a 80 graus Celsius negativos.Para iniciar a reconstituição do metal, coloque uma alíquota de três mililitros da enzima purificada, suspensa em tampão de eluição, no gelo. Usando o volume de proteína no tubo, calcule a quantidade de ascorbato de sódio e ditiotreitol necessária de modo que a concentração final de cada um seja de 12,5 milimolares na amostra. Adicione o ascorbato de sódio sólido e o ditiotreitol e misture delicadamente, mas bem, para dissolver completamente.Bata alguns grânulos de um mililitro de sulfato de ferro sólido heptahidratado em um pedaço de papel de pesagem. Dobre o papel sobre o grânulo e esmague-o com o lado plano de uma espátula de metal. Adicione um grão do pó resultante ao tubo que contém a solução proteica.Vórtice para misturar, resultando em uma cor rosa-rosada. Tampe o tubo e incube a solução rosa no gelo por 10 a 30 minutos. A cor rosa desbotará com o tempo.Para filtração de gel, use uma coluna de filtração de gel embalada com 10 mililitros de gel esférico de poliacrilamida em uma coluna de 1,5 por 12 centímetros, que também é equipada com um reservatório de 10 mililitros. Em seguida, equilibre a coluna conforme descrito no protocolo de texto. Quando o tampão tiver drenado da coluna e o suporte da cama superior estiver exposto, feche a torneira.Pipetar a solução de três mililitros de ferro e duas metaloenzimas reconstituídas para o suporte exposto do leito superior. Abra a torneira e deixe toda a amostra de três mililitros entrar na coluna por gravidade. Descarte os primeiros três mililitros de eluente.Qualquer cor rosa que se forme durante o manuseio da solução ficará presa no topo da coluna. Quando a coluna parar de pingar e o suporte do leito superior estiver exposto, adicione quatro mililitros do tampão de filtração de gel e colete quatro mililitros de eluente em 8,5 mililitros de frações. Depois de combinar frações contendo proteínas, prossiga com o ensaio ou armazenamento da amostra conforme descrito no protocolo de texto.Neste estudo, os alunos purificaram e posteriormente reconstituíram uma dioxigenase de ligação de ferro não heme marcada com poli-histidina. A análise SDS-PAGE mostra que a proteína marcada é efetivamente purificada. Os dados de atividade coletados pelos alunos sobre a ação enzimática da L-dopa dioxigenase purificada após a reconstituição com ferro dois e subsequente filtração em gel são mostrados aqui.O atraso de cinco segundos antes do início da coleta de dados é típico dos alunos que executam essa técnica pela primeira vez. O ensaio de estado estacionário indica que os parâmetros cinéticos, determinados pelo ajuste das curvas de progresso, são consistentes com os resultados publicados. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que mais ferro não é melhor, pois muito ferro causará precipitação de proteínas.As concentrações de ferro em excesso de três a cinco molares da proteína são suficientes. Seguindo este procedimento, os alunos podem realizar experimentos adicionais para medir a estrutura da solução, observar a química dependente de enzimas ou substratos, tudo para responder a perguntas adicionais sobre o mecanismo de reação.

benchtop-immobilized-metal-affinity-chromatography-reconstitution

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Neste vídeo, demonstramos a técnica de cromatografia de afinidade de níquel para purificar enzimas pirofosfoquinase marcadas com histidina da bactéria Clostridium difficile.

Purificação de proteínas baseada em cromatografia de afinidade de níquel: uma técnica para purificar proteínas recombinantes marcadas com poli-histidina a partir de lisado de células bacterianas

Este vídeo demonstra um procedimento para a produção de anticorpos recombinantes contra a metalopeptidase. Plasmídeos recombinantes que transportam genes para o anticorpo, proteína fluorescente verde e resistência a antibióticos são transfectados em células epiteliais com lipofectamina. As células transfectadas são selecionadas e cultivadas para gerar anticorpos recombinantes.

Um método para produzir anticorpos recombinantes contra metalopeptidase

Reagentes de detecção robustos são cada vez mais necessários para o desenvolvimento de novas ferramentas de diagnóstico da malária. Uma sonda de irídio (III) foi projetada para emitir sinal luminescente de longa duração na presença de um biomarcador de proteína da malária rico em histidina. A detecção da proteína em solução ou imobilizada em uma partícula magnética oferece flexibilidade na aplicação.

Iridium (III) luminescentes Sonda para detecção da proteína maláricos Biomarker proteína rica em histidina-II

A cromatografia de exclusão de tamanho hifenizada com plasma indutivamente acoplado - espectrometria de massa (ICP-MS) é uma ferramenta poderosa para medir mudanças na abundância de metaloproteínas diretamente de amostras biológicas. Aqui descrevemos um conjunto de padrões de metaloproteínas usados para estimar a massa molecular e a quantidade de metal associada a proteínas desconhecidas.

Normas para Análise Quantitativa Metalloproteomic Usando Tamanho Exclusão ICP-MS

Um procedimento é apresentado para o dobrar do domínio de ligação do ligante periplasmático dCACHE de Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 de corpos de inclusão e a purificação para produzir quantidades de miligrama de proteína.

Método para dobrar eficiente e purificação do Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Aqui, descrevemos um método para a purificação de enzimas pyrophosphokinase histidina-tag e utilizando cromatografia em camada fina dos produtos a ensaiar para a atividade enzimática em vitroe substratos marcadas com radioisótopos. O ensaio da atividade da enzima é amplamente aplicável a quinase, ciclase nucleotídeo ou reação de transferência de fósforo, cujo mecanismo inclui a hidrólise de nucleotídeos trifosfato.

Uma purificação e ensaio de atividade In Vitro para um ppGpp (p) sintetase de Clostridium difficile

A mobilidade do íon-espectrometria maciça e as técnicas de modelagem molecular podem caracterizar o desempenho quelante do metal seletivo de peptídeos metal-obrigatórios projetados e do methanobactin Copper-Binding do peptide. O desenvolvimento de novas classes de peptídeos quelantes metálicos ajudará a levar a terapêutica para doenças associadas ao desbalanceamento de íons metálicos.

Técnicas de espectrometria de massa de mobilidade de íons para determinação da estrutura e mecanismos de reconhecimento de íons metálicos e atividade redox de oligopeptídeos de ligação metálica

Apresentamos um ensaio para a fácil quantificação de metais introduzidos em amostras preparadas usando cromatografia de afinidade metálica imobilizada. O método utiliza hidroxinaphthol azul como o indicador de metal colorimétrico e um espectrômetro UV-Vis como o detector.

Quantificação da lixiviação metálica na cromatografia imobilizada da afinidade metálica

Descrevemos protocolos para a caracterização biofísica da formação de complexos ternários induzidos por proteólise visando quimeras (PROTACS) que envolvem os ligases ubiquitina Von Hippel-Lindau E3 ligase (BVS) e Cereblon (CRBN).  Os métodos biofísicos aqui ilustrados incluem ressonância plasmônica de superfície (SPR), interferometria de biocamada (BLI) e calorimetria de titulação isotérmica (ITC).

Desenvolvimento e aplicação de ensaios biofísicos para avaliação da formação de complexos ternários induzidos por proteólise visando quimeras (PROTACS)

Este artigo fornece um procedimento para a purificação de afinidade de uma proteína recombinante humana, a endonuclease 1 (FEN1), que foi marcada com uma marca de 6X-histidina. O protocolo envolve a utilização de duas colunas distintas de íons metálicos imobilizados para a purificação da proteína marcada.

Purificação de afinidade de uma proteína marcada com 6X-His usando um sistema de cromatografia líquida de proteína rápida 

Aprenda a purificar e reconstituir metaloenzimas de ferro não-heme marcadas com polihistidina usando cromatografia de afinidade por metal imobilizado. Este protocolo acessível permite que estudantes de graduação explorem estrutura e função enzimática em laboratório didático.

Benchtop imobilizada cromatografia de afinidade Metal, reconstituição e ensaio de um Polyhistidine Tagged Metalloenzyme para o laboratório de graduação (Vídeo) | JoVE Journal

Benchtop imobilizada cromatografia de afinidade Metal, reconstituição e ensaio de um Polyhistidine Tagged Metalloenzyme para o laboratório de graduação

Explorar mais vídeos