Benchtop imobilizada cromatografia de afinidade Metal, reconstituição e ensaio de um Polyhistidine Tagged Metalloenzyme para o laboratório de graduação

Esse método permite que os alunos de graduação purifiquem rapidamente as metaloenzimas de ligação ao ferro e, em seguida, usem essa proteína para responder a perguntas-chave sobre estrutura e função, tudo dentro dos limites do laboratório de ensino. A principal vantagem desta técnica é que ela é aplicável a enzimas de ligação de ferro não heme. É acessível a alunos de graduação e é prontamente implementado no laboratório de ensino.

Para iniciar este procedimento, obtenha uma coluna de 1,5 por 20 centímetros equipada com uma saída luer lock, uma tampa superior que também contém um encaixe luer lock e um suporte de leito inferior para reter partículas de resina. Encaixe o encaixe de trava luer inferior com uma torneira para controlar o fluxo. Em seguida, obtenha um frasco contendo uma pasta de 50% de resina de ácido nitriloacético ligado a níquel em 20% de etanol que foi previamente armazenado a quatro graus Celsius.

Gire suavemente a garrafa para ressuspender uniformemente a resina. Trabalhando em temperatura ambiente, use uma pipeta graduada para retirar dois milímetros da pasta e transferi-la para a coluna. Depois que o excesso de solução de armazenamento for drenado da resina, use uma pipeta Pasteur para adicionar cuidadosamente pelo menos 30 mililitros de tampão de ligação de lise resfriado, certificando-se de não perturbar a superfície da resina.

Passe o buffer pelas paredes da coluna para evitar respingos. Equilibre a resina permitindo que o tampão escorra lentamente da coluna por gravidade para um copo de coleta. Para começar, preparar a coluna de níquel-NTA para a adição dos extractos brutos sem células, abrindo a torneira e deixando o tampão de ligação de lise remanescente ser drenado por gravidade através da resina de níquel-NTA.

Quando o tampão estiver completamente drenado e a superfície da resina exposta, feche a torneira. Em seguida, use uma pipeta Pasteur para pipetar cuidadosamente os extratos brutos livres de células na resina, tomando cuidado para não perturbar a superfície. Passe os extratos brutos pela parede da coluna para evitar respingos.

Depois de todos os extractos brutos terem sido transferidos para a coluna, abrir a torneira para que a coluna possa drenar por gravidade. Colete 100 microlitros do fluxo para análise posterior. Use um pequeno pedaço de tubo de plástico para conectar uma seringa luer lock de 10 mililitros à tampa da coluna.

Retire o êmbolo da seringa e, em seguida, encha firmemente a tampa da coluna no topo da coluna. Comprima suavemente o êmbolo enquanto coleta o eluente em um cilindro graduado para avaliar manualmente a vazão. Taxas entre um e dois mililitros por minuto são compatíveis com a resina e a configuração experimental.

Aumente suavemente a compressão do êmbolo da seringa à medida que a taxa de fluxo diminui. Quando o menisco do líquido aplicado atingir de cinco a 10 mililitros acima do leito de resina, remova a tampa da coluna e a bomba manual anexada para evitar a introdução de ar na resina. Deixe o volume restante escorrer por gravidade.

Depois que os extratos brutos terminarem de drenar e a superfície da resina for exposta novamente, use uma pipeta Pasteur para adicionar cuidadosamente cerca de 30 mililitros de tampão de lavagem resfriado à coluna, tomando cuidado para não perturbar a superfície da resina. Abra a torneira e deixe o tampão de lavagem escorrer pela coluna. Enquanto a coluna está drenando, rotule 16 tubos de microcentrífuga para coleta de frações.

Quando o tampão estiver completamente drenado e a superfície da resina for exposta novamente, feche a torneira. Usando uma pipeta Pasteur, adicione cuidadosamente cerca de 30 mililitros de tampão de eluição resfriado à coluna, tomando cuidado para não perturbar a superfície da resina. Em seguida, abra a torneira lentamente para permitir que o tampão de eluição elua a proteína marcada com poli-histidina da coluna.

Recolha um mililitro de eluente em cada um dos tubos de microcentrífuga marcados. Após o teste de proteína, combine as frações contendo proteínas em um tubo cônico limpo. Prossiga com uma reconstituição do cofator de íons metálicos ou congele a proteína em alíquotas de três mililitros a 80 graus Celsius negativos.

Para iniciar a reconstituição do metal, coloque uma alíquota de três mililitros da enzima purificada, suspensa em tampão de eluição, no gelo. Usando o volume de proteína no tubo, calcule a quantidade de ascorbato de sódio e ditiotreitol necessária de modo que a concentração final de cada um seja de 12,5 milimolares na amostra. Adicione o ascorbato de sódio sólido e o ditiotreitol e misture delicadamente, mas bem, para dissolver completamente.

Bata alguns grânulos de um mililitro de sulfato de ferro sólido heptahidratado em um pedaço de papel de pesagem. Dobre o papel sobre o grânulo e esmague-o com o lado plano de uma espátula de metal. Adicione um grão do pó resultante ao tubo que contém a solução proteica.

Vórtice para misturar, resultando em uma cor rosa-rosada. Tampe o tubo e incube a solução rosa no gelo por 10 a 30 minutos. A cor rosa desbotará com o tempo.

Para filtração de gel, use uma coluna de filtração de gel embalada com 10 mililitros de gel esférico de poliacrilamida em uma coluna de 1,5 por 12 centímetros, que também é equipada com um reservatório de 10 mililitros. Em seguida, equilibre a coluna conforme descrito no protocolo de texto. Quando o tampão tiver drenado da coluna e o suporte da cama superior estiver exposto, feche a torneira.

Pipetar a solução de três mililitros de ferro e duas metaloenzimas reconstituídas para o suporte exposto do leito superior. Abra a torneira e deixe toda a amostra de três mililitros entrar na coluna por gravidade. Descarte os primeiros três mililitros de eluente.

Qualquer cor rosa que se forme durante o manuseio da solução ficará presa no topo da coluna. Quando a coluna parar de pingar e o suporte do leito superior estiver exposto, adicione quatro mililitros do tampão de filtração de gel e colete quatro mililitros de eluente em 8,5 mililitros de frações. Depois de combinar frações contendo proteínas, prossiga com o ensaio ou armazenamento da amostra conforme descrito no protocolo de texto.

Neste estudo, os alunos purificaram e posteriormente reconstituíram uma dioxigenase de ligação de ferro não heme marcada com poli-histidina. A análise SDS-PAGE mostra que a proteína marcada é efetivamente purificada. Os dados de atividade coletados pelos alunos sobre a ação enzimática da L-dopa dioxigenase purificada após a reconstituição com ferro dois e subsequente filtração em gel são mostrados aqui.

O atraso de cinco segundos antes do início da coleta de dados é típico dos alunos que executam essa técnica pela primeira vez. O ensaio de estado estacionário indica que os parâmetros cinéticos, determinados pelo ajuste das curvas de progresso, são consistentes com os resultados publicados. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que mais ferro não é melhor, pois muito ferro causará precipitação de proteínas.

As concentrações de ferro em excesso de três a cinco molares da proteína são suficientes. Seguindo este procedimento, os alunos podem realizar experimentos adicionais para medir a estrutura da solução, observar a química dependente de enzimas ou substratos, tudo para responder a perguntas adicionais sobre o mecanismo de reação.