Caenorhabditis Peneira: Um instrumento de baixa tecnologia e metodologia para classificação de pequenos organismos multicelulares
4 de julho de 2018
O protocolo atual inclui uma metodologia para a classificação e a limpeza das populações de idade-combinadas de elegans de Caenorhabditis. Ele usa um simples, barato e eficiente ferramenta sob medida para obter uma grande população experimental de nematoides para pesquisa.
Este método pode ajudar a responder a questões-chave em biologia molecular, envolvendo ensaios que requerem estágios específicos de desenvolvimento de C. elegans. Como ensaios de níveis de expressão gênica e proteica. A vantagem desta técnica é que ela permite a seleção precisa e eficiente de um grande número de C.elegans por tamanho corporal, o que facilita o uso de ensaios que normalmente seriam proibitivos em termos de tempo e custo.
Geralmente, os indivíduos novos nesse método terão dificuldades porque não podem executar a etapa de rotatividade de arqueamento ou não mantêm o fluxo da solução no centro da malha. A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas de lavagem e inversão são difíceis de aprender. Alguns podem ter problemas para interpretar e visualizar movimentos específicos no texto.
Para começar, adquira dois tubos cônicos de 50 mL com tampas e, em seguida, use uma broca escalonada para remover o centro do lábio interno das tampas. Se necessário, use uma lima, lixa ou ferramenta rotativa para limpar e lixar as bordas e a parte superior das tampas. Em seguida, corte um disco de malha de tecido de monofilamento de nylon, ligeiramente menor que o diâmetro da tampa.
Texturize as superfícies superiores das tampas e limpe-as com etanol. Depois de deixar as tampas secarem, aplique cola de cianoacrilato nas superfícies superiores de ambas as tampas. Em seguida, coloque o disco de malha de monofilamento em uma tampa colada.
Inverta a segunda tampa na parte superior da malha e pressione as tampas firmemente juntas. Depois que a primeira camada de cola secar, aplique um anel generoso de cola de cianoacrilato ao redor do espaço externo entre as tampas. Em seguida, rotule o filtro com seu respectivo tamanho de poro de malha.
Primeiro, coloque a peneira sobre um tubo cônico de 50 mL rotulado. Em seguida, pipete a solução salina pelo centro da peneira até que uma gota se forme, coalesça e escorra do centro do filtro. Usando o tampão M9, lave uma população de C.elegans de uma placa helicoidal e, em seguida, use uma pipeta pasteur de vidro para transferir o tampão contendo os vermes na parte superior da malha de monofilamento.
Operando no centro da malha, enxágue o filtro com tampão M9, repita esta etapa de enxágue conforme necessário para passar todas as bactérias e vermes menores pela malha. Em seguida, conecte um novo tubo cônico de 50 mL no topo da peneira, os vermes coletados anteriormente maiores que os poros da malha estarão voltados para o interior do novo tubo. Remova o tubo de resíduos e vire rapidamente a peneira.
Em seguida, enxágue a malha com tampão M9 no novo tubo de coleta. Deixe os vermes coletados assentarem por aproximadamente um minuto e, em seguida, aspire cuidadosamente a solução tampão para longe do pellet de vermes. Usando uma pipeta de pasteur de vidro, crie gotículas de minhocas em uma placa NGM e deixe-as secar.
Por fim, lave a peneira com água de osmose reversa e etanol. Depois que a peneira secar, guarde-a em um recipiente limpo para uso futuro. Descarte a peneira quando ela desenvolver uma aparência flácida.
Neste protocolo, uma peneira foi construída para classificar e limpar populações de C. elegans pareadas por idade. Os animais do grupo de tratamento com peneira exibiram padrão de movimento normal e espontâneo durante toda a idade adulta. Além disso, os grupos pick e peneira não apresentaram diferenças significativas na taxa de pump faríngeo.
Os animais do grupo peneira também responderam normalmente ao estímulo mecânico anterior ou posterior quando comparados a todos os grupos de tratamento em qualquer um dos dias de teste. Por fim, comparou-se a fecundidade dos grupos de tratamento; O uso da peneira não impactou significativamente o número de progênies quando comparado ao grupo de tratamento pick. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em menos de dez minutos.
Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de operar no centro da área da malha. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como montar e usar corretamente uma peneira Caenorhabditis para classificar os vermes pelo tamanho do corpo.
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Visão Geral
Este protocolo descreve uma metodologia para separar e limpar populações de Caenorhabditis elegans com idade correspondente utilizando uma ferramenta personalizada. Ele permite aos pesquisadores obter uma população experimental em grande escala de forma eficiente e economicamente viável.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Molecular
- Biologia do Desenvolvimento
Contexto
- Estágios de desenvolvimento específicos de C.elegans são cruciais para diversos ensaios.
- Os ensaios podem envolver níveis de expressão gênica e proteica.
- Os métodos tradicionais podem ser demorados e onerosos.
- Demonstrações visuais são essenciais para compreender a metodologia.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um método eficiente para selecionar C.elegans com base no tamanho corporal.
- Facilitar ensaios que exigem estágios de desenvolvimento específicos.
- Melhorar o acesso para pesquisadores novos nesta técnica.
Métodos Utilizados
- Ferramenta personalizada para classificação de nematoides.
- Etapa de inversão arqueada para lavagem eficaz.
- Manutenção do fluxo da solução no centro da malha.
- Demonstrações visuais para auxiliar a aprendizagem.
Resultados Principais
- Seleção precisa de grande número de C.elegans realizada.
- O método reduz o tempo e o custo dos ensaios de biologia molecular.
- Melhor compreensão de movimentos específicos por meio de auxílios visuais.
- Maior acessibilidade para pesquisadores não familiarizados com o método.
Conclusões
- O protocolo oferece um método confiável para separar C.elegans.
- Os recursos visuais são cruciais para a aprendizagem eficaz da técnica.
- Essa metodologia pode beneficiar significativamente a pesquisa em biologia molecular.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
No desenvolvimento e pesquisa em biofármacos, obter populações sincronizadas de organismos modelo como C. elegans é essencial para ensaios reprodutíveis de triagem fenotípica e validação de alvos. A peneira Caenorhabditis permite classificação rápida e econômica por tamanho corporal, reduzindo o tempo e a demanda de recursos nos fluxos de trabalho iniciais de descoberta. Isso aumenta a confiança preditiva na prontidão dos ensaios e na triagem de portfólios, garantindo entradas biológicas uniformes.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas utilizando populações de vermes com idades correspondentes para obter leituras fenotípicas consistentes.
- Valor Operacional: Oferece um método de baixo custo e escalável para gerar coortes sincronizadas sem necessidade de equipamentos especializados.
- Valor Preditivo: Reduz a variabilidade biológica em ensaios, melhorando a confiabilidade dos dados para a redução de riscos em alvos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para triagem de compostos posteriores ao isolar estágios de desenvolvimento específicos.
- Valor Operacional: Padroniza o preparo dos vermes, aumentando a reprodutibilidade entre placas de ensaio e campanhas de triagem.
- Escalabilidade: Atende às necessidades de alto rendimento por meio do processamento rápido de grandes populações de vermes em menos de dez minutos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Mantém a fidelidade fenotípica da descoberta até a validação pré-clínica, preservando marcadores de motilidade, resposta ao estresse e fecundidade.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Permite avaliação confiável dos níveis de expressão gênica e proteica em populações sincronizadas, apoiando o alinhamento de biomarcadores.
- Avanço Ajustado ao Risco: Facilita decisões de prosseguir/não prosseguir ao fornecer entradas consistentes do sistema modelo para perfis de eficácia e toxicidade.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O Peneira Caenorhabditis insere-se no continuum de descoberta desde a Descoberta Inicial até a Identificação de Fármacos Promissores, apoiando especificamente a preparação de ensaios e a reprodutibilidade de triagens para telas fenotípicas baseadas em C. elegans.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao fornecer populações uniformes de vermes para esclarecimento de vias e triagem funcional.
- Triagem: Permite a preparação de ensaios por meio da separação por tamanho, garantindo tamanho e estágio consistentes dos vermes para avaliação confiável de compostos.
- Análises: Gera saídas quantitativas separadas por tamanho que permitem às equipes comparar condições ao longo dos estágios de desenvolvimento com menor ruído.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao manter marcadores-chave de saúde (mobilidade, resposta ao estresse, fecundidade) após a separação, apoiando a validade de biomarcadores.
- Reutilização Corporativa: Funciona como uma ferramenta reutilizável e de baixa manutenção entre equipes e projetos, promovendo padronização no manejo de organismos modelo.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva por meio da redução da ambiguidade mecanicista em ensaios fenotípicos.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade dos fluxos de trabalho de preparação de vermes.
- Valor Estratégico: Tomadas de decisão mais eficazes sobre prosseguir ou interromper projetos, eficiência no uso de capital e redução de riscos biológicos em estágios avançados por meio de desvio precoce de riscos.
- Impacto no Portfólio: Priorização e decisões de avanço ajustadas ao risco com base em dados confiáveis provenientes de sistemas modelos específicos de cada estágio.
Considerações sobre a Implementação
- Exige habilidades básicas de laboratório para montagem de peneiras e manipulação de soluções.
- Requer acesso a tubos cônicos, malha de náilon, cola de cianoacrilato e tampões padrão (M9, salina).
- Exige treinamento entre equipes sobre a operação correta centrada na malha e a técnica de virada para garantir consistência.
- As considerações para adaptação incluem a seleção do tamanho dos poros da malha para as fases-alvo dos vermes e a compatibilidade com diversos sistemas de cultura em NGM ou meio líquido.
- As limitações práticas incluem o possível afundamento da malha ao longo do tempo, exigindo substituição periódica para manter a precisão na separação.
