Name: Amplificação de perto completos provírus HIV-1 para a próxima geração de sequenciamento (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Aprenda a amplificar provírus HIV-1 de quase comprimento completo a partir de células infectadas individuais usando PCR aninhado e sequenciamento de próxima geração. Este método permite identificar provírus geneticamente intactos e potencialmente replicantes.

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Este trabalho foi financiado o Delaney AIDS Research Enterprise (DARE) para encontrar uma cura (1U19AI096109 e 1UM1AI126611-01); um amfAR Research Consortium na erradicação do HIV (ARCHE) Collaborative Research Grant de The Foundation for AIDS Research (amfAR 108074-50-RGRL); Centro Australiano para HIV e hepatite Virology Research (ACH2); UCSF-GIVI Center for AIDS Research (P30 AI027763); e o australiano nacionais de saúde e Conselho de pesquisa médica (AAP1061681). Gostaríamos de agradecer o Dr. Joey Lai, genómica Facility Manager no Instituto de pesquisa médica para a sua formação na biblioteca preparação e utilização de suas instalações de Westmead e o centro de Ramaciotti para a genómica (Universidade de New South Wales, Sydney, Austrália) para a realização de sequenciamento. Reconhecemos com gratidão os participantes que doou as amostras para este estudo.

<ol><li>Bruner, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+proviruses+rapidly+accumulate+during+acute+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Defective proviruses rapidly accumulate during acute HIV-1 infection.</a> Nature Medicine. 22 (9), 1043-1049 (2016).</li>
<li>Hiener, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Genetically+Intact+HIV-1+Proviruses+in+Specific+CD4%28%2B%29+T+Cells+from+Effectively+Treated+Participants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of Genetically Intact HIV-1 Proviruses in Specific CD4(+) T Cells from Effectively Treated Participants.</a> Cell Reports. 21 (3), 813-822 (2017).</li>
<li>Abram, M. E., Ferris, A. L., Shao, W., Alvord, W. G., Hughes, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature%2C+position%2C+and+frequency+of+mutations+made+in+a+single+cycle+of+HIV-1+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Nature, position, and frequency of mutations made in a single cycle of HIV-1 replication.</a> Journal of Virology. 84 (19), 9864-9878 (2010).</li>
<li>Ho, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-competent+noninduced+proviruses+in+the+latent+reservoir+increase+barrier+to+HIV-1+cure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Replication-competent noninduced proviruses in the latent reservoir increase barrier to HIV-1 cure.</a> Cell. 155 (3), 540-551 (2013).</li>
<li>Harris, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+deamination+mediates+innate+immunity+to+retroviral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA deamination mediates innate immunity to retroviral infection.</a> Cell. 113 (6), 803-809 (2003).</li>
<li>Lecossier, D., Bouchonnet, F., Clavel, F., Hance, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypermutation+of+HIV-1+DNA+in+the+absence+of+the+Vif+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hypermutation of HIV-1 DNA in the absence of the Vif protein.</a> Science. 300 (5622), 1112(2003).</li>
<li>Chun, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rebound+of+plasma+viremia+following+cessation+of+antiretroviral+therapy+despite+profoundly+low+levels+of+HIV+reservoir%3A+implications+for+eradication%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Rebound of plasma viremia following cessation of antiretroviral therapy despite profoundly low levels of HIV reservoir: implications for eradication.</a> AIDS. 24 (18), 2803-2808 (2010).</li>
<li>Chomont, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+reservoir+size+and+persistence+are+driven+by+T+cell+survival+and+homeostatic+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">HIV reservoir size and persistence are driven by T cell survival and homeostatic proliferation.</a> Nature Medicine. 15 (8), 893-900 (2009).</li>
<li>Soriano-Sarabia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+replication-competent+HIV-1+in+populations+of+resting+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Quantitation of replication-competent HIV-1 in populations of resting CD4+ T cells.</a> Journal of Virology. 88 (24), 14070-14077 (2014).</li>
<li>Josefsson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+reservoir+in+eight+patients+on+long-term+suppressive+antiretroviral+therapy+is+stable+with+few+genetic+changes+over+time%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 reservoir in eight patients on long-term suppressive antiretroviral therapy is stable with few genetic changes over time.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 110 (51), E4987-E4996 (2013).</li>
<li>Evering, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+HIV-1+evolution+in+the+gut-associated+lymphoid+tissue+from+patients+on+combination+antiviral+therapy+initiated+during+primary+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Absence of HIV-1 evolution in the gut-associated lymphoid tissue from patients on combination antiviral therapy initiated during primary infection.</a> Public Library of Science Pathogens. 8 (2), e1002506(2012).</li>
<li>von Stockenstrom, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+Genetic+Characterization+Reveals+That+Cell+Proliferation+Maintains+a+Persistent+HIV+Type+1+DNA+Pool+During+Effective+HIV+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Longitudinal Genetic Characterization Reveals That Cell Proliferation Maintains a Persistent HIV Type 1 DNA Pool During Effective HIV Therapy.</a> Journal of Infectious Diseases. 212 (4), 596-607 (2015).</li>
<li>Palmer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple%2C+linked+human+immunodeficiency+virus+type+1+drug+resistance+mutations+in+treatment-experienced+patients+are+missed+by+standard+genotype+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Multiple, linked human immunodeficiency virus type 1 drug resistance mutations in treatment-experienced patients are missed by standard genotype analysis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43 (1), 406-413 (2005).</li>
<li>Qiagen. CLC Genomics Version 10. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.qiagenbioinformatics.com/products/clc-genomics-workbench ">https://www.qiagenbioinformatics.com/products/clc-genomics-workbench </a> (2018).</li>
<li>Andrews, S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2010).</li>
<li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimmomatic%3A+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://journal.embnet.org/index.php/embnetjournal/article/view/200">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), (2011).</li>
<li>Magoc, T., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLASH%3A+fast+length+adjustment+of+short+reads+to+improve+genome+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">FLASH: fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies.</a> Bioinformatics. 27 (21), 2957-2963 (2011).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Bankevich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPAdes%3A+a+new+genome+assembly+algorithm+and+its+applications+to+single-cell+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing.</a> Journal of Computational Biology. 19 (5), 455-477 (2012).</li>
<li>Kumar, S., Stecher, G., Tamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEGA7%3A+Molecular+Evolutionary+Genetics+Analysis+Version+7.0+for+Bigger+Datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 for Bigger Datasets.</a> Molecular Biology and Evolution. 33 (7), 1870-1874 (2016).</li>
<li>Katoh, K., Standley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAFFT+multiple+sequence+alignment+software+version+7%3A+improvements+in+performance+and+usability%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">MAFFT multiple sequence alignment software version 7: improvements in performance and usability.</a> Molecular Biology and Evolution. 30 (4), 772-780 (2013).</li>
<li>Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Gene Cutter tool. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/GENE_CUTTER/cutter.html ">https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/GENE_CUTTER/cutter.html </a> (2018).</li>
<li>Foster, J. L., Garcia, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Nef+in+HIV-1+replication+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Role of Nef in HIV-1 replication and pathogenesis.</a> Advances in Pharmacology. 55, 389-409 (2007).</li>
<li>Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Consensus Maker tool. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/CONSENSUS/consensus.html">https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/CONSENSUS/consensus.html</a> (2018).</li>
<li>Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Hypermut tool. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HYPERMUT/hypermut.html">https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HYPERMUT/hypermut.html</a> (2018).</li>
<li>Yu, G., Smith, D. K., Zhu, H., Guan, Y., Lam, T. T. Y. <a target="_blank" href="https://besjournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/2041-210X.12628">ggtree: an r package for visualization and annotation of phylogenetic trees with their covariates and other associated data.</a> Methods in Ecology and Evolution. , (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O ensaio de FLIPS é um método eficiente e de alta produtividade para amplificar e single de sequenciamento, perto de longa-metragem provírus HIV-1. Múltiplos fatores e passos críticos no protocolo que influenciam o número e a qualidade das sequências obtidas foram identificados. Em primeiro lugar, o número de células e a frequência de infecção do HIV-1 da população celular influenciaram o número de provírus amplificado. Por exemplo, em uma publicação anterior, aproximadamente metade como muitas sequências foram obtidas com o mesmo número de ingênuo CD4+ T células comparadas a memória efetoras CD4+ T células. Isto é porque ingênuo células geralmente têm uma menor frequência de infecção do que de células efetoras memória2. Em segundo lugar, a lise celular é preferível métodos baseados em colunas de extração para obtenção de DNA genômico como não há nenhum risco de perder o DNA no processo de extração. Por último, tal como acontece com qualquer ensaio baseados em PCR, evitando a contaminação é crítico. Separadas de áreas limpas devem ser designadas para a preparação de misturas de mestre, manipulação de DNA genômico, adicionando controles positivos, purificação de DNA e quantificação e preparação de biblioteca. Isto é particularmente importante para os ensaios de cópia única como a apresentada aqui.
Implementação do ensaio FLIPS primeiro deve incluir executando um controle positivo como plasmídeos pNL4-3, ao invés de amostras de participantes. Isso permitirá que qualquer prévia de solução de problemas para o uso de células positivas do HIV-1, como as sequências obtidas podem ser comparadas com sequências de referência disponível para estes plasmídeos. Ao usar células de HIV-1 positivas, é importante considerar o subtipo do HIV-1 (primeiras demão projetados para FLIPS são específicas para o subtipo B) e a frequência de infecção da população celular, se pouco ou nenhum provírus é amplificado. Sequências da primeira demão podem ser modificado/redesenhado para combinar com outros subtipos. Além disso, um bem que contém um controle positivo deve ser incluído em cada PCR realizado.
FLIPS tem de superar as limitações dos ensaios anteriores de sequenciamento, incluindo SPS. Através de amplificação e sequenciamento perto completos provírus HIV-1, FLIPS podem determinar a potencial replicação-competência de provírus HIV-1. Isto não era possível usar SPS, que sequenciado somente regiões subgenômica e, portanto, selecionados para sequências com sítios de ligação intacta da primeira demão. Além disso, FLIPS supera as limitações associadas utilizando múltiplos amplificação e sequenciamento primers, como foi empregado por sequenciamento completos anteriores ensaios1,4. Através de duas rodadas de PCR, visando as regiões de HIV-1 LTR combinadas com NGS, FLIPS diminui o número e a complexidade das primeiras demão necessária. ALETAS é, portanto, menos suscetível às consequências da primeira demão incompatibilidades, ou seja, a identificação errônea de provírus defeituosos e uma incapacidade para amplificar um provírus dentro de uma população. O protocolo de FLIPS também é mais eficiente e permite um maior rendimento de sequenciamento do que métodos anteriores.
Evidentemente, FLIPS fornece vantagens sobre os métodos existentes que determinam a composição genética de provírus HIV-1. No entanto, é importante reconhecer as limitações de FLIPS. Em primeiro lugar, o ensaio de FLIPS não foi desenvolvido como uma ferramenta para medir o tamanho do reservatório latente HIV-1, como análises para determinar se a FLIPS amplifica todos os presentes em uma população celular de pró-vírus HIV-1 não foram concluídas. ALETAS em vez disso é útil para fazer comparações relativas da composição do reservatório entre populações de célula diferente2. Em segundo lugar, a replicação-competência da intactas provírus HIV-1 não pode ser determinada com certeza na vivo de análise, como aquelas realizadas por Ho et al . 4. em terceiro lugar, FLIPS não foi concebido para determinar o local de integração de provírus HIV-1.
Pequenas variações no protocolo FLIPS podem aumentar a sua aplicação. Por exemplo, mudanças na primeira demão sequências podem permitir diferentes e vários subtipos de HIV-1 para ser amplificado e sequenciados. Sequenciamento dos virions do plasma HIV-1 é possível através da adição de síntese do cDNA antes da PCR aninhado. Futura utilização de métodos de sequenciamento de molécula vai eliminar a necessidade de montagem de novo .
Sequenciamento genético de provírus integrados do HIV-1 tem aumentado nossa compreensão do reservatório latente do HIV-1. ALETAS é uma importante ferramenta para estudos futuros, elucidar a composição e a distribuição do reservatório latente. No entanto, a aplicação de FLIPS pode estender além do reservatório. Estudos futuros podem utilizar FLIPS para determinar objectivos específicos para tecnologia CRISPR-Cas, ou auxiliar na identificação de codificação e regiões não-codificantes que tornar o vírus mais responsivos a latência invertendo os agentes. Recombinação viral pode ser melhor entendida por olhar para os locais de junção de grandes exclusões internas.

Caracterização genética do HIV-1 reservatório latente, que persiste em indivíduos em longo prazo terapia antiretroviral (arte), tem sido vital para a compreensão de que a maioria de provírus integrados está com defeito e replicação-incompetente1 , 2. durante o processo de transcrição reversa, erros são introduzidos na sequência proviral integrado. Alguns mecanismos que geram sequências proviral defeituosas incluem o propenso de enzima transcriptase reversa HIV-13, modelo4, e/ou induzida por APOBEC Hipermutação5,6de comutação. Dois estudos recentes descobriram que aproximadamente 5% dos HIV-1 provírus isoladas de indivíduos na arte a longo prazo são geneticamente intacta e potencialmente replicação competente e pode contribuir para a recuperação rápida em níveis do plasma HIV-1 após a cessação da arte 1 , 2 , 7. estudos anteriores identificaram que provírus replicação do HIV-1 persistem no ingênuo e descansando memória CD4+ T célula subconjuntos (incluindo o central, transição e células de memória T efetoras), indicando a importância da visando estas células no futuro estratégias de erradicação a2,8,9.
Primeiros insights sobre a distribuição, a dinâmica e a manutenção do reservatório de latente do HIV-1 foram alcançados por meio da utilização de métodos de sequenciamento single-proviral (SPS) que caracterizam geneticamente genômica sub regiões do genoma do HIV-1,10 ,11,12,13. SPS é uma ferramenta versátil, capaz de sequenciar um único pró-vírus de HIV-1 de dentro de uma única célula infectada. No entanto, o SPS é incapaz de determinar a competência de replicação de provírus, desde que apenas sequências subgenômica provírus regiões e misses que contêm grandes exclusões dentro de sítios de ligação da primeira demão. Um estudo anterior demonstrou que a SPS superestima o tamanho do reservatório de replicação por 13 - a 17 vezes por meio de sequenciamento seletivamente intacta regiões genômicas sub2.
Para resolver as limitações do SPS, Ho et al . 4 e Bruner et al . 1 desenvolvidos ensaios de sequência perto completos provírus HIV-1. Isto permitiu que a frequência de geneticamente intactas e potencialmente competentes para replicação, provírus HIV-1 em indivíduos na arte a longo prazo a fixar. Estes ensaios amplificado e sequenciados (através de Sanger sequenciamento) regiões subgenômica que então foram montadas para obter um pró-vírus de HIV-1 sequência do (intacta ou com defeito). Três limitações desta abordagem são: 1) a utilização de múltiplos primers sequenciamento aumenta o risco de inadvertidamente introduzir defeitos na sequência proviral, 2) cartilha incompatibilidades podem impedir a amplificação de provírus particulares e 3) muitas vezes o toda a sequência de proviral não pode ser resolvida devido à tecnicidade desses métodos.
Para superar as limitações existentes completos ensaios de sequenciamento proviral de HIV-1, desenvolvemos o Full -Lcomprimento eusubjugado Pmentos Sequencing (aletas) do ensaio. ALETAS é um sequenciamento de próxima geração (NGS)-ensaio baseado que amplifica e sequências perto de provírus completos de HIV-1 (intactas ou com defeito) de forma eficiente e de alta produtividade. FLIPS oferece vantagens em ensaios anteriores, como limitar o número de primers utilizados; Portanto, ela diminui a chance de primer incompatibilidades, que podem limitar a população de provírus capturaram ou involuntariamente apresentar defeitos em uma sequência viral. FLIPS é também menos tecnicamente desafiador do que ensaios anteriores e envolve 6 etapas principais: células de 1) lise de infectados de HIV-1, 2) amplificação de provírus de HIV-1 único através de PCR aninhado realizada em limitar a diluição utilizando primers específicos para o altamente conservadas HIV-1 5' e 3' U5 LTR região (figura 1A), 3) purificação e quantificação dos produtos amplificados, 4) preparação da biblioteca de provírus amplificados para NGS, 5) NGS e 6) montagem de novo de provírus sequenciadas para obter contigs de cada pró-vírus individuais.
Sequências geradas por FLIPS podem se submeter a um processo rigoroso de eliminação para identificar aqueles que são geneticamente intacta e potencialmente competentes de replicação (Figura 1)2. Provírus geneticamente intactas faltam todos os defeitos conhecidos que resultar na geração de pró-vírus uma replicação-incompetente. Estes defeitos incluem: sequências de inversão, grandes exclusões internas, códons de parada Hipermutação/deletérios, frameshifts ou mutações na 5' embalagens maiores ou sinal splice local doador (MSD).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig1.jpg"> Figura 1: passos críticos no ensaio de sequenciamento proviral individuais completos (aletas). (A) genoma de DNA do HIV-1 com sítios de ligação cartilha em 5' e 3' regiões LTR U5 usados por FLIPS para amplificar perto completos (com defeito e intactos) provírus HIV-1 através de PCR aninhado. (B) o Layout de uma placa PCR de 96 poços contendo 80 poços de amostra (20 poços para cada diluição), 4 poços de controlo negativo e 1 controle positivo bem. (C) processo de eliminação, usado para identificar geneticamente intactas e potencialmente competentes para replicação, provírus HIV-1. Esta figura foi modificada de Hiener et al . 2 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>UltraPure 1 M Tris-HCI, pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15568025</td><td>Diluir a 5 mM para PCR aninhado</td></tr><tr><td>Nonidet P 40 Solução substituta</td><td>Sigma</td><td>98379</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Solução de proteinase K (20 mg/mL)</td><td>Termociclador</td><td></td> Promega AM2548 <td></td></tr><tr><td>de 96 poços</td><td>Qualquer termociclador de 96 poços pode ser usado</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Platina Taq DNA Polimerase Alta Fidelidade</td><td>Invitrogen</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>10x Tampão de Alta Fidelidade [600 mM Tris-SO4 (pH 8,9), 180 mM (NH4)2SO4]</td><td>Invitrogen</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>50 mM MgSO4</td><td>Invitrogen</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>PCR Nucleotide Mix, 10 mM</td><td>Promega</td><td>C1141</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure H2O</td><td>Invitrogen</td><td>10977023</td><td></td></tr><tr><td>PCR1 e PCR2 Primers</td><td></td><td></td><td>Dessalinizados. Diluir para (100 &micro; M) com H2O</td></tr><tr><td>Placa PCR 96 Poços, Meia Saia, Canto de Entalhe Único,</td><td>Selos Adesivos Axygen</td><td>PCR '</td><td></td></tr><tr><td>B' Transparentes</td><td>BioRad</td><td>MSB1001</td><td>Necessário para selar placas PCR de 96 poços</td></tr><tr><td>HIV-1 NL4-3 Clone Molecular Infeccioso (pNL4-3)</td><td>O seguinte reagente foi obtido através do Programa de Reagentes da AIDS do NIH, Divisão de AIDS, NIAID, NIH: HIV-1 NL4-3 Clone Molecular Infeccioso (pNL4-3) do Dr. Malcolm Martin (Cat# 114).</td><td></td><td>Diluído para 105 cópias/mL e usado como spinner de placa de PCR de controle positivo</td></tr><tr><td>ou centrífuga</td><td></td><td></td><td></td>de bancada</tr><tr><td>E-GEL 48 1% Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>G800801</td><td>Géis pré-moldados de agarose a 1% (dois géis usados por placa de 96 poços). Qualquer gel de agarose a 1% pode ser substituído. Contém brometo de etídio.</td></tr><tr><td>DirectLoad Wide Range DNA Marker</td><td>Sigma</td><td>D7058</td><td>Qualquer escada com um alcance de até 10 kb pode ser substituída</td></tr><tr><td>pelo dispositivo Mother E-Base</td><td>Invitrogen</td><td>EBM03</td><td>Necessário para a execução de géis de agarose pré-moldados de 48 poços a 1%</td></tr><tr><td>Gel Doc EZ Gel Documentation System</td><td>BioRad</td><td>1708270</td><td>Qualquer sistema de visualização para géis de agave contendo brometo de etídio pode ser usado</td></tr><tr><td>PlateMax Peelable Heat Sealing</td><td>Axygen</td><td>HS-200</td><td>Filme de selagem a quente para armazenamento de longo prazo</td></tr><tr><td>96 Poços 0,8 mL Placa de Armazenamento</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AB0765</td><td>0,8 mL 96 bem necessária para purificação de PCR baseada em esferas magnéticas</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP (kit de purificação de PCR)</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>Kit de purificação de PCR baseado em esferas magnéticas. Outros kits de purificação de PCR podem ser substituídos aqui (e.g. Kit de Purificação de PCR QIAquick (Qiagen Cat#28106)</td></tr><tr><td>Álcool etílico, puro. 200 provas, para biologia molecular</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Stand-96</td><td>Invitrogen</td><td>AM10027</td><td></td></tr><tr><td>Agitador</td><td></td><td></td> de microplacas <td>Tampão opcional</td></tr><tr><td>EB</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td>Tampão de eluição</td></tr><tr><td>Kit de Ensaio de dsDNA Quant-iT PicoGreen</td><td>Invitrogen</td><td>P11496</td><td>Uma coloração à base de fluorescência para medir a concentração de dsDNA</td></tr><tr><td>Leitor</td><td></td><td></td><td></td>de microplacas</tr><tr><td>Kit de preparação da biblioteca de DNA Nextera XT</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1096</td><td></td></tr><tr><td>Kit de índice Nextera XT</td> Placas de PCR de 96 poços <td>Illumina</td><td>FC-131-2001</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Biorad</td><td>HSP9601</td><td>Necessário para o kit de preparação da biblioteca de DNA Nextera XT</td></tr><tr><td>Kit de Quantificação da Biblioteca - Illumina/Universal</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4824</td><td>Outros kits de quantificação da biblioteca podem ser substituídos (e.g. JetSeq DNA Library Quantification Lo-Rox Kit (Bioline Cat#BIO-68029)</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technology</td><td></td><td>Sistema de eletroforese automatizado . Use em conjunto com um kit de DNA de alta sensibilidade</td></tr><tr><td>Kit de DNA de alta sensibilidade</td><td>Tecnologia Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Illumina MiSeq Platform</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

amplificação de perto completos provírus hiv-1 para a próxima geração de sequenciamento

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

O ensaio completo Individual Proviral sequenciamento (aletas) é um método eficiente e de alta produtividade, projetado para amplificar e sequência única, perto de provírus de HIV-1 (intactas e defeituosos), longa-metragem. FLIPS permite a determinação da composição genética do HIV-1 integrado dentro de uma população celular. Através da identificação de defeitos em sequências proviral de VIH-1 que surgem durante a transcrição reversa, tais como grandes exclusões internas, códons de parada deletérios/hipermutação, mutações frameshift e mutações/exclusões em cis agindo elementos necessários para a maturação do virion, FLIPS podem identificar provírus integrados incapazes de replicação. O ensaio de FLIPS pode ser utilizado para identificar o provírus HIV-1 que faltam esses defeitos e são, portanto, potencialmente competentes de replicação. O protocolo de FLIPS envolve: lise das células infectadas de HIV-1, aninhados PCR de perto completos provírus HIV-1 (usando as primeiras demão direcionadas para o HIV-1 5' e 3' LTR), purificação de DNA e quantificação, preparação de biblioteca para geração de sequenciamento (NGS), NGS, de novo montagem de contigs proviral e um simples processo de eliminação para a identificação de provírus replicação competente. FLIPS fornece vantagens sobre os tradicionais métodos destinados a sequência integrada provírus HIV-1, tais como sequenciamento single-proviral. FLIPS amplifica e sequências perto de provírus completos, habilitando a competência de replicação ser determinada e também usa menos iniciadores de amplificação, impedindo que as consequências da primeira demão incompatibilidades. ALETAS é uma ferramenta útil para a compreensão da paisagem genética de provírus integrados do HIV-1, especialmente dentro do reservatório latente, no entanto, sua utilização pode estender para qualquer aplicação em que a composição genética do HIV-1 integrado é necessária.

O ensaio de FLIPS amplifica e sequências simples, perto de longa-metragem provírus HIV-1. O protocolo envolve 6 etapas para obter perto sequências proviral completos. Estas etapas incluem: lise de infectados células, PCR aninhado de provírus de HIV-1 (intactos e defeituosos) completos, purificação de DNA e quantificação, sequenciamento de preparação de biblioteca, NGS, e de novo conjunto de sequenciado provírus. O final de cada etapa pode ser considerado um ponto de verificação em que a qualidade do produto (por exemplo, amplificado DNA, DNA purificado, biblioteca de sequenciamento ou sequência) pode ser avaliada antes da próxima etapa. Uma visão geral da avaliação realizada no final de cada etapa e os resultados esperados é descrito abaixo.
Após PCR aninhado, produtos amplificados são executados em um gel de agarose 1% (Figura 3). A qualidade inicial da PCR pode ser determinada pela inspeção de controles positivos e negativos. Poços de controlo negativo contendo o produto amplificado indicam contaminação e poços de controle positivo ausente do produto amplificado indicam amplificação insuficiente. Em seguida, poços contendo produto amplificado são selecionados para o sequenciamento. Para evitar poços que contêm misturas de vários provírus amplificados, somente poços contendo produto amplificado executar a diluição de ponto de extremidade são considerados para sequenciamento. De acordo com a distribuição de Poisson, a diluição de ponto de extremidade é encontrada quando 30% dos poços são positivos para o produto amplificado. A esta diluição, há um 80% chance esses poços contêm um único pró-vírus amplificado. Além disso, poços contendo múltiplos provírus amplificados de comprimentos diferentes podem ser visualizados nesta fase como várias bandas aparecerão no gel. Esses poços não deverá ser seleccionados para sequenciamento (Figura 3).
Após a purificação dos provírus amplificados selecionado para sequenciamento, quantificação garante que nenhum DNA proviral é perdido durante a fase de purificação. Se a concentração de DNA de um amplificado pró-vírus é &lt; 0.2 ng / µ l, a amostra restante no PCR2 placa pode ser purificada. Um posto de controle semelhante ocorre após a preparação da biblioteca, em que cada biblioteca individual é quantificada. Isso garante provírus individuais foram adequadamente fragmentados, marcados e amplificados antes de sequenciamento. Bibliotecas proviral individuais são agrupadas em montantes equimolar a uma concentração final de biblioteca de 4 nM (ou conforme especificado pelo provedor de sequenciamento). Se a concentração de uma biblioteca proviral individual é muito baixa, pode excluir-se do pool de biblioteca do sequenciamento, ou a biblioteca preparado novamente. É realizada uma verificação final da concentração da biblioteca em pool antes de sequenciamento juntamente com confirmando os comprimentos médios de fragmento.
Etapas de controle de qualidade antes da fase de montagem de novo garante a qualidade dos lê usado para montar o contig proviral final. Estas etapas incluem: remoção de sequências de adaptador, aparando de 5' e 3' nucleotídeos, um limite de qualidade rigorosos e desconsiderando leituras curtas. CLC Genomics Workbench pode fornecer relatórios de controle de qualidade que podem ser usados antes para avaliar a qualidade inicial da guia Configurações de aparamento e leituras e depois para determinar se o corte foi suficiente para remover a regiões de baixa qualidade. Além disso, para montagem de novo , a qualidade do contigs montado pode ser avaliada por profundidade suficiente (&gt; 1000 X) e a uniformidade da cobertura (Figura 4A). As populações mistas também podem ser identificadas nesta fase. Misturas de vários provírus completos (~ 9 kb) são identificadas através da presença de SNPs múltiplos com uma frequência superior a 40%, Considerando que as misturas de curtas (contendo uma grande exclusão interna) e provírus completos podem ser identificadas por desigual Leia cobertura após o mapeamento de uma referência de longa-metragem do mesmo participante (Figura 4B).
Dependendo da aplicação, o alinhamento final pode ser visualizado usando ferramentas como o ggtree disponível como um pacote em "r.: A linguagem e ambiente para computação estatística"27. Em um estudo recente, FLIPS foi utilizado para provírus sequência HIV-1 da memória ingênuo, central, transicional e efetoras CD4+ T células isoladas de indivíduos na arte a longo prazo, com o objetivo de identificar se os subconjuntos de célula específica mostraram maiores proporções de geneticamente intacta e potencialmente competentes a replicação de HIV-12. Aqui, uma representação visual das sequências isoladas de um participante deste estudo (participante 2026) é apresentada (Figura 5). Neste participante, a maioria (97%) das sequências foram defeituosa, com sequências intactas encontradas em efetoras e de memória transitória CD4+ T células. Esta ferramenta de visualização é útil para visualizar o número de sequências com grandes exclusões internas e sua posição no genoma. Pode ser anotado mais para indicar sequências com códons de parada deletérios, mutações frameshift e exclusões/mutações do site MSD e/ou sinal de embalagem.
Uma aplicação do ensaio FLIPS é a identificação de geneticamente intactas e potencialmente replicação competente provírus HIV-1. Em um estudo recente de 531 sequências isoladas de CD4+ T células de 6 participantes na arte a longo prazo, 26 (5%) geneticamente intactas provírus de HIV-1 foram identificados2. Os provírus defeituosas restantes incluíam aqueles com sequências de inversão (6%), grandes exclusões internas (68%), códons de parada deletérios/Hipermutação (9%), mutações frameshift (1%) e defeitos do sinal de embalagens e/ou mutações no site MSD (11%) .
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig2.jpg"> Figura 2: Visão geral do fluxo de trabalho para montagem de novo de provírus HIV-1. As principais etapas do fluxo de trabalho incluem: sequência 1) ler o controle de qualidade, 2) mesclando pares sobrepostos, 3) montagem de novo e 4) remapeamento e construção de consenso foram cor vermelha, azul, verde e laranja, respectivamente. Esta figura foi modificada de Hiener et al . 2 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig3.jpg"> Figura 3: gel de agarose a exemplo do PCR amplificados provírus HIV-1. Poços, 1, 2, 3, 6, 9 e 10 contêm amplificados provírus HIV-1. Bem 10 contém uma pró-vírus com uma grande exclusão interna, bem 2 contém co amplificação de provírus de HIV-1 dois comprimentos diferentes (mistura) e bem 12 contém controle positivo. Observe a porcentagem de poços que contém o produto amplificado é 60%, o que está acima o percentual necessário para isolar os modelos simples. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig4.jpg"> Figura 4: exemplo de saída do mapeamento leitura. (A) exemplo demonstrando mesmo cobertura devido a amplificação de um único pró-vírus completos do HIV-1. Na sequência de montagem de novo , todas as leituras são mapeadas para o contig montado para produzir uma sequência de consenso. A plataforma de software permite que o lê mapeado a inspeccionar para cobertura suficiente e mesmo. (B) exemplo demonstrando co amplificação de provírus de HIV-1 dois comprimentos diferentes (mistura). Para determinar as misturas, leituras são mapeadas para uma sequência de referência completos (~ 9 kb) a partir do mesmo participante e ler mapeamento inspecionado. A presença de cobertura irregular indica uma mistura. Esta figura é reproduzida com permissão da Qiagen14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig5.jpg"> Figura 5: Visualização de exemplo de HIV-1 proviral sequências isoladas de CD4+ T subconjuntos de um indivíduo na arte de longa duração da pilha. Proviral sequências individuais HIV-1 são representadas por linhas horizontais. Esta figura foi modificada de Hiener et al . 2 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Sequenciamento proviral individual completo (aletas) fornece um método eficiente e de alta produtividade para a amplificação e sequenciamento de single, perto de provírus completos de HIV-1 (intactos e com defeito) e permite a determinação do seu potencial replicação-competência. FLIPS supera as limitações dos ensaios anteriores projetados para sequenciar o reservatório latente do HIV-1.

Amplificação de perto completos provírus HIV-1 para a próxima geração de sequenciamento

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo do HIV, como determinar a composição genética de provírus do HIV e diferentes tipos de células. Especialmente identificando aqueles que estão geneticamente intactos e potencialmente replicação competente. As principais vantagens desta técnica é que ela nos permite amplificar provírus de HIV de comprimento único de células infectadas pelo HIV e, em seguida, sequestradas por sequenciamento de próxima geração.Para começar, prepare todos os buffers conforme descrito no protocolo de texto. Obtenha uma pelota celular e adicione cem microliters de tampão de lise por milhão de células. Misture por pipetting para cima e para baixo.Lise as células incubando em um cicloviário térmico a 55 graus celsius por uma hora e, em seguida, adicione 85 graus celsius por 15 minutos. Para começar a amplificar provírus de DNA único HIV-1, misture os reagentes para o PCR da primeira rodada conforme listado na tabela um do protocolo de texto. Adicione 38 microliters a 85 poços em uma placa PCR de 96 poços e rotule esta placa como PCR 1.Depois disso, mova a placa PCR 1 para uma área clara designada para a adição de DNA genômico. O uso de cloridrato tris dilui o DNA genômico de uma razão de um a três para uma razão de um a 81, certificando-se de preparar 45 microliters de cada diluição. Adicione dois microliters de DNA genômico diluído a cada amostra bem e dois microliters de cloridrato tris a cada poço de controle negativo.Sele a placa inteira, exceto pelo controle positivo. Em seguida, mova-se para uma área designada para a adição do controle positivo. Adicione dois microliters do controle positivo ao poço correspondente e, em seguida, sele completamente a placa.Use um rotador de placa PCR para girar brevemente a placa PRC 1 e retirar qualquer conteúdo residual dos lados dos poços. Execute a placa PCR 1 no ciclo de tempor térmica conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, misture os reagentes para a segunda rodada de PCR conforme listado na tabela um.Adicione 28 microliters deste mix PCR 2 a 85 poços de uma nova placa PCR de 96 poços. Rotule esta placa como PCR 2. Usando um rotador de placa, gire brevemente a placa PCR 1 para retirar qualquer conteúdo residual dos lados dos poços.Adicione 80 microliters de cloridrato tris a cada poço desta placa. Depois disso, use uma pipeta de canal de mutli para transferir dois microliters de cada poço da placa PCR 1 para os poços correspondentes na placa PCR 2. Sele a placa PCR 2 com envoltório adesivo claro.Gire brevemente a placa PCR 2 no rotador de placa. Enquanto isso, sele a placa PCR 1 com uma película de vedação térmica para armazenamento a longo prazo a menos 20 graus celsius. Execute a placa PCR 2 em um cicloviário térmico conforme descrito no protocolo de texto.Em seguida, gire brevemente a placa PCR 2 para retirar qualquer conteúdo residual dos lados dos poços. Usando uma pipeta multicanal, adicione 60 microlitradores de cloridrato tris a cada poço. Em seguida, execute 15 microliters de cada poço em dois 48 bem pré-moldados 1% de géis de agarose que contêm brometo de etídio.Identifique os poços que contêm o produto amplificado e seus tamanhos aproximados e salve a imagem do gel. Depois disso, determine a diluição na qual não mais de 30% dos poços são positivos para o produto amplificado. Primeiro, use um rotador de placas para girar brevemente a placa PCR 2 e puxe qualquer conteúdo residual dos lados dos poços.Transfira 40 microliters dos poços que contêm produto amplificado para os poços correspondentes de uma nova placa midi de 96 poços. Em seguida, estabeleça um kit de purificação baseado em alimentação magnética, certificando-se de levar as contas magnéticas à temperatura ambiente e preparar uma nova solução de 80% de etanol. Uma vez que as contas atingem o vórtice de temperatura ambiente, elas garantem que elas sejam completamente resuspendidas.Usando uma pipeta multicanal, adicione 40 microliters de contas aos 40 microliters de produto amplificado em cada poço da placa midi. Misture suavemente pipetting para cima e para baixo 10 vezes. Incubar em temperatura ambiente por cinco minutos.Em seguida, transfira a placa para um suporte magnético e deixe descansar por dois minutos. Depois disso, remova e descarte o supernaspeso. Com a placa ainda no banco, lave as contas adicionando duzentos microliters da solução de 80% de etanol para cada poço.Incubar em temperatura ambiente por 30 segundos e, em seguida, remover e descartar o supernatante. Repita este processo de lavagem uma vez desde a adição do etanol até o descarte do supernante. O uso de uma pipeta multicanal remove o excesso de etanol.Deixe as contas secarem por 15 minutos. Depois disso, retire a placa do suporte. Adicione 30 microliters de tampão de elução a cada poço e misture suavemente tubos para cima e para baixo 10 vezes.Incubar em temperatura ambiente por dois minutos. Coloque a placa de volta no suporte magnético e deixe descansar por dois minutos. Usando uma pipeta multicanal, transfira 25 microliters do supernatante para os poços correspondentes de uma nova placa PCR de 96 poços.Em seguida, use um fotômetro de espectro para determinar e registrar a concentração aproximada de cada produto de DNA amplificado. Defina um kit de quantificação de DNA duplo encalhado e dilua o buffer para uma vez em água livre de DNAs estérei. Adicione 99 microliters do buffer a um número apropriado de poços vazios em uma placa de cultura de tecido fundo plano.Em seguida, adicione cem microliters de tampão a três poços em branco. Para que cada produto amplificado seja medido adicione um microliter de DNA purificado em triplicado a cada poço contendo tampão. Diluir lambda duplo DNA encalhado 10 vezes de dois nanogramas por microliter para ponto zero zero nanogramas por microliter para preparar os padrões.Adicione cem microliters de cada padrão de DNA duplo preso a três poços. Diluir o corante florescence de um a duzentos com tampão. Adicione rapidamente cem microliters a cada poço que contenha uma amostra, em branco ou padrão e misture por pipetação para cima e para baixo.Depois disso, cubra a placa com papel alumínio para evitar contato com a luz. Usando um leitor de microplaca, regise a emissão de floresnce. Use as medidas registradas para determinar a concentração de DNA duplo encalhado em cada amostra.Em seguida, diluir cada produto purificado com água a uma concentração de zero ponto dois nanogramas por microliter. Após pcr aninhado, os produtos amplificados são executados em um gel de 1% de agarose. A qualidade inicial do PCR pode ser determinada inspecionando os controles.Como os controles negativos contendo produto amplificado indicam contaminação e os controles positivos sem produto amplificado indicam amplificação insuficiente. Apenas os poços executados na diluição do ponto final que contenham provírus amplificados únicos são considerados para sequenciamento. Embora os poços que contenham vários provírus amplificados de diferentes comprimentos possam ser visualizados nesta fase, eles não devem ser selecionados para sequenciamento.Para a montagem de Novo, a qualidade dos contigs montados pode ser avaliada para profundidade e adequação suficientes da cobertura. Populações mistas também podem ser identificadas nesta fase pela presença de cobertura irregular. A representação visual das sequências isoladas de um participante revela que 97% de suas sequências estão defeituosas.Com sequências intactas encontradas em células T de efeito e memória transitória CD4. Ao tentar este procedimento é importante lembrar que apenas produtos amplificados obtidos na diluição limitante, que é onde não mais de 30 por cento dos poços são positivos, contêm um único provírus. Após este procedimento, os produtos amplificados podem ser sequenciados para determinar a composição genética dos provírus do HIV.Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo do HIV explorarem a distribuição de provírus geneticamente intactos do HIV e diferentes tipos de células em pacientes em terapia para determinar onde provírus geneticamente intactos e potencialmente replicantes competentes se escondem. Não se esqueça que trabalhar com células infectadas pelo HIV pode ser perigoso e precauções como usar equipamentos de proteção individual adequados e trabalhar em um laboratório certificado devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.

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Research

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Genetics

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