Estudando ribonucleótido incorporação: Deteção de vertente específica de ribonucleotídeos no genoma da levedura e mutagênese induzida pela ribonucleotídeo de medição
26 de julho de 2018
Ribonucleotídeos estão entre os mais abundantes nucleotídeos não-canônicos incorporados do genoma durante a replicação do DNA nuclear eucariótica. Se não forem devidamente removidos, ribonucleotídeos podem causar mutagênese e dano do ADN. Aqui, apresentamos duas abordagens experimentais que são usadas para avaliar a abundância de incorporação de ribonucleotídeo DNA e seus efeitos mutagénicos.
Este método pode ajudar a responder a perguntas como quantos ribonucleotídeos são incorporados ao DNA de fita nascente, principal e atrasada no genoma. Embora este método possa fornecer informações quantitativas e qualitativas sobre a densidade de ribonucleaotídeos no genoma da levedura, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como genomas de mamíferos. A eletroforese em gel alcalino fornece uma visão semiquantitativa da incorporação de ribonucleotídeos em todo o genoma e o southern blotting específico da fita permite maior sensibilidade e quantificação em um locus genômico específico.
Para iniciar este procedimento, adicione seis microlitros de hidróxido de potássio molar a cada amostra de DNA genômico de levedura recém-preparada e incube a 55 graus Celsius por duas horas. Após duas horas, incubar as amostras no gelo durante cinco minutos. Em seguida, adicione a cada amostra quatro microlitros de tampão de carga de DNA alcalino 6-6.
Moldar um gel alcalino composto de um por cento de agarose, 50 milimolares de hidróxido de sódio e um milimolar EDTA pH oito com um pente que permite que 24 microlitros de amostra de DNA sejam carregados por pista. Gire os tubos de amostras brevemente. Carregue todos os 24 microlitros de cada amostra no gel alcalino de agarose.
Inclua um marcador de tamanho de DNA apropriado. Eletroforese a 30 volts por 30 minutos. Em seguida, abaixe a tensão para 10 volts e eletroforese por 18 a 20 horas.
No dia seguinte, neutralize o gel. Mergulhe o gel no tampão de neutralização um e incube em temperatura ambiente com agitação suave por 45 minutos. Substitua a mistura de tampão de neutralização por tampão novo.
E incube por mais 45 minutos. Para corar o DNA, mergulhe o gel neutralizado em 200 mililitros de água contendo uma diluição de um a 10000 de coloração de ouro sybr em temperatura ambiente com agitação suave por duas horas. Visualize o DNA usando um transiluminador UV.
O DNA do gel alcalino será transferido para uma membrana de náilon carregada positivamente por ação capilar. Primeiro, mergulhe o gel alcalino em temperatura ambiente por 15 minutos em tampão de transferência alcalino. Em seguida, molhe a membrana de náilon brevemente com água e mergulhe-a em tampão de transferência alcalina por cinco minutos.
Configure a plataforma de transferência invertendo três copos de vidro de 100 mililitros em uma assadeira de vidro ligeiramente maior que o tamanho do gel de agarose. Coloque uma placa de vidro em cima dos copos de vidro. Coloque dois pedaços grandes de três papel de cromatografia MMCHR sobre a placa de vidro.
Despeje o tampão de transferência alcalina sobre o papel de cromatografia e encha o prato de vidro até a metade. Alise as bolhas usando uma pipeta de vidro de cinco mililitros. Coloque o gel de agarose por cima.
Mais uma vez, suavizando as bolhas. Cerque todas as bordas do gel com parafilme. Despeje uma pequena quantidade de tampão de transferência alcalina no gel.
Coloque a membrana de náilon pré-embebida em cima do gel e alise as bolhas. Coloque dois pedaços de papel de cromatografia cortados no tamanho do gel de agarose. Coloque-os em cima da membrana e alise as bolhas.
Coloque uma pilha grande de toalhas de papel em cima do sanduíche de transferência e coloque cuidadosamente um prato de vidro em cima das toalhas de papel. Adicione um objeto ponderado ao topo e deixe a transferência prosseguir em temperatura ambiente durante a noite. No dia seguinte, desmonte cuidadosamente a pilha de transferência.
Mergulhe a membrana à temperatura ambiente no tampão de neutralização dois por 15 minutos. Reticule o DNA à membrana de nylon carregada usando um reticulador UV. Use a configuração de ligação cruzada automática.
Antes de iniciar o procedimento de hibridização, prepare a sonda radiomarcada conforme descrito no protocolo de texto. Enrole a membrana umedecida em um tubo de hibridização e adicione 25 mililitros de tampão de hibridização recém-preparado. Incube a 65 graus Celsius com rotação em um forno de hibridização por uma a duas horas.
Despeje cuidadosamente a solução e adicione 25 mililitros de tampão de hibridização mais a sonda. Incubar a 65 graus Celsius por 16 a 18 horas com rotação. Em seguida, despeje a solução em um recipiente de lixo radioativo.
Adicione a solução de lavagem de fosfato STS um ao tubo de hibridização e gire em temperatura ambiente por cinco minutos. Desta forma, execute cinco lavagens de cinco minutos cada com solução de lavagem de fosfato STS um. Após a quinta lavagem com solução de lavagem de fosfato STS, lave a membrana duas vezes com solução de lavagem de fosfato STS dois por 15 minutos de cada vez a 65 graus Celsius com rotação.
Use uma pinça para remover a membrana do tubo de hibridização e coloque a membrana em um protetor de manga de plástico aberto. Cubra e exponha a uma placa de imagem. Se necessário, retire e reteste o borrão com uma sonda diferente.
Para descascar, cubra a membrana com 25 mililitros de uma solução 2XSSPE de formamida a 50% e incube a 65 graus Celsius por duas horas. Despeje a solução em um recipiente de lixo radioativo. Adicione a solução de lavagem de fosfato STS dois ao tubo de hibridização e gire a 65 graus Celsius por 15 minutos.
Verifique a membrana com um contador Geiger para confirmar a ausência de sinal antes de realizar a pré-hibridização e hibridização conforme demonstrado anteriormente. Essas imagens de gel têm DNA genômico de levedura tratado com ou sem hidróxido de potássio mostrando que as células sem RNH2 retêm mais ribonucleotídeos no genoma. A variante M644L da polimerase dois reduz a capacidade de incorporar ribonucleotídeos, enquanto o mutante M644G incorpora mais ribonucleotídeos do que a polimerase do tipo selvagem.
Um gel de agarose alcalina pode ser sondado por análise de southern blot específica da fita. Neste exemplo, as sondas recoozem para a fita de DNA principal nascente dentro do gene repórter URA3 que foi inserido próximo ao ARS306 em duas orientações opostas. Resultados representativos de southern blotting usando as sondas específicas da fita principal nascente mostram um padrão de fragmentação do DNA causado pela clivagem alcalina em ribonucleotídeos e DNA de fita principal nascente em uma cepa de tipo selvagem e em cepas que expressam as variantes de polimerases alfa, delta e épsilon que são promíscuas para a incorporação de ribonucleotídeos.
Este gráfico mostra a quantificação do sinal radioativo por fração do total em cada pista do Southern blot. Ao tentar o procedimento, é importante lembrar de sempre usar DNA recém-isolado de células faciais bloqueadas. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo do reparo de DNA quantificarem a densidade e a fita na qual os ribonucleotídeos foram incorporados pelas polimerases replicativas do DNA.
Após este procedimento, outros métodos, como sequenciamento de extremidade hidrolada ou HydEn-seq, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a localização dos ribonucleotídeos no genoma. Não se esqueça de que trabalhar com materiais radioativos pode ser extremamente perigoso e devem ser sempre tomadas precauções para evitar a contaminação da bancada e do equipamento durante a execução deste procedimento.
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Visão Geral
Este estudo apresenta abordagens experimentais para avaliar a incorporação de ribonucleotídeos no DNA durante a replicação do DNA nuclear em eucariotos. Destaca os potenciais efeitos mutagênicos dos ribonucleotídeos caso não sejam adequadamente removidos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Replicação do DNA
- Estabilidade genômica
- Mutagênese
Contexto
- Os ribonucleotídeos são nucleotídeos não canônicos encontrados no DNA.
- Eles podem causar danos ao DNA se não forem removidos.
- Compreender sua incorporação é essencial para a integridade genômica.
- São necessários métodos para quantificar a incorporação de ribonucleotídeos.
Objetivo do Estudo
- Quantificar a incorporação de ribonucleotídeos no DNA.
- Avaliar os efeitos mutagênicos dos ribonucleotídeos.
- Desenvolver métodos aplicáveis a diversos sistemas genômicos.
Métodos Utilizados
- Eletroforese em gel alcalino para análise semi-quantitativa.
- Dot blot southern com especificidade de fita para quantificação sensível.
- Uso do tratamento com hidróxido de potássio para amostras de DNA.
- Incubação em temperaturas controladas para resultados ideais.
Resultados Principais
- Dados quantitativos sobre a incorporação de ribonucleotídeos no DNA de levedura.
- Comparação da incorporação nas fitas líder e atrasada.
- Informações sobre o potencial mutagênico dos ribonucleotídeos.
- Aplicabilidade dos métodos a genomas de mamíferos.
Conclusões
- Os ribonucleotídeos representam um risco para a estabilidade genômica.
- Os métodos desenvolvidos são eficazes para quantificar a incorporação.
- Os achados têm implicações para o entendimento dos mecanismos de dano ao DNA.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A incorporação de ribonucleotídeos no DNA genômico representa uma fonte de instabilidade que pode dificultar a validação de alvos e a identificação de fármacos em descoberta de medicamentos. Quantificar essa incorporação permite a desmistificação mecanicista ao esclarecer as fontes de mutagênese espontânea que podem obscurecer as relações fenótipo-genótipo em modelos pré-clínicos. Essa capacidade reforça a confiança preditiva no estágio inicial da descoberta, distinguindo sinais terapêuticos reais de artefatos decorrentes de danos ao DNA.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Avalia se os fenótipos observados decorrem da modulação do alvo pretendido ou de danos no DNA induzidos por ribonucleotídeos.
- Valor Operacional: Fornece quantificação específica de fita para reduzir os riscos associados a hipóteses sobre a função gênica em sistemas de triagem baseados em leveduras.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Permite a preparação de linhagens isogênicas de levedura com níveis definidos de ribonucleotídeos para fundos consistentes em ensaios.
- Valor Operacional: Padroniza o controle de qualidade do DNA genômico para reduzir a variabilidade em ensaios de flutuação e na validação de genes repórter.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Mede as taxas de mutagênese induzida por ribonucleotídeos para avaliar a estabilidade genética de sistemas relevantes para doenças durante cultivo prolongado.
- Valor Operacional: Permite o monitoramento longitudinal da integridade genômica em modelos pré-clínicos utilizados na otimização de fármacos líderes.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere em fluxos de trabalho de descoberta inicial, nos quais a validação do alvo exige fundos genéticos limpos, especialmente ao utilizar modelos de levedura para investigação de vias metabólicas ou triagem fenotípica.
- Biologia da Descoberta: Esclarece se a incorporação de ribonucleotídeos contribui para a mutagênese de fundo em ensaios de flutuação utilizados na validação de alvos.
- Triagem: Garante a consistência dos reagentes ao qualificar amostras de DNA utilizadas na validação por Southern blot de construtos genéticos.
- Análises: Gera dados quantitativos específicos para a fita que permitem a comparação de variantes de polimerase ou diferentes origens genéticas em campanhas de identificação de compostos ativos.
- Pesquisa Translacional: Acompanha métricas de estabilidade genômica que orientam o avanço ajustado ao risco das fases de acerto para liderança.
- Reutilização Corporativa: Estabelece um ponto de controle de qualidade reutilizável para a integridade do DNA genômico em múltiplas plataformas de descoberta baseadas em leveduras.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao quantificar uma fonte conhecida de mutagênese espontânea em telas genéticas.
- Valor Operacional: Introduz padronização no preparo de amostras de DNA, melhorando a reprodutibilidade entre ensaios de flutuação e blotagem sulterna.
- Valor Estratégico: Aumenta a confiança nas decisões de prosseguimento ou interrupção ao controlar fatores de confusão relacionados a danos no DNA nos dados de validação de alvos.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco ao identificar modelos com níveis elevados de ribonucleotídeos que podem exigir estratégias de mitigação.
Considerações sobre a Implementação
- Expertise no manuseio de ácidos nucleicos, técnicas com sonda radioativa e hibridização por Southern blot.
- Equipamento de eletroforese em gel alcalino, cruzamento com UV e fosforimager para detecção de sinal.
- Protocolos padronizados para tratamento com hidróxido de potássio, neutralização e transferência para membrana, garantindo consistência entre laboratórios.
- Considerações para adaptação incluem a otimização do desenho da sonda para diferentes loci genômicos e o ajuste dos tempos de hidrólise conforme a qualidade das amostras de DNA.
- Limitações práticas incluem a natureza semi-quantitativa dos géis alcalinos sem Southern blot e os riscos associados aos materiais radioativos, que exigem manuseio especializado de resíduos.
