Name: Estudando ribonucleótido incorporação: Deteção de vertente específica de ribonucleotídeos no genoma da levedura e mutagênese induzida pela ribonucleotídeo de medição (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Aprenda a quantificar a incorporação de ribonucleotídeos no DNA de levedura usando eletroforese em gel alcalino e Southern blot específico de fita. Este método permite avaliar efeitos mutagênicos e estabilidade genômica.

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Agradecemos a todos os antigos e atuais membros Kunkel laboratório para os seus trabalhos e discussões relacionadas ao protocolo e reutilizados dados aqui apresentados. Este trabalho foi financiado pelo projeto Z01 ES065070 para T.A.K. da divisão de pesquisa Intramural dos institutos nacionais de saúde (NIH), National Institute de Ciências de saúde ambiental (NIEHS).

1. alcalina hidrólise e vertente específica de Southern Blot (Figura 1)
<ol><li>Crescimento da célula e isolamento de DNA genômico<ol>
<li>Isole o DNA genômico de levedura usando um kit de purificação de DNA seguindo as instruções do fabricante do fermento. Use as culturas que estão na fase exponencial de crescimento entre (uma densidade óptica de 0.5) e 1. Resuspenda o pellet de DNA final em 35 mL de tampão TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, ácido de 1 mM ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)) 1x.</li>
		<li>Adicionar 1 mL de 5mg/mL RNase ao DNA e incube por 30 min a 37 ° C.</li>
		<li>Precipitar o DNA utilizando 0,1 volumes de acetato de sódio 3M (pH 5.2) e 2,5 volumes de etanol 100% por 20 min no gelo.</li>
		<li>Centrifugar a 16.000 x g por 20 min a 4 ° C. Remova o sobrenadante com uma pipeta.</li>
		<li>Lave o pellet duas vezes com 500 mL de etanol a 70%. Remova o sobrenadante com uma pipeta.</li>
		<li>Secar a pelota no banco e ressuspender em 35 ml de tampão TE 1x.</li>
		<li>Dose o DNA usando um fluorímetro (Tabela de materiais) com o kit de ensaio BR dsDNA.</li>
		<li>Precipitar a 5 mg de DNA de cada amostra utilizando 0,1 volumes de acetato de sódio 3M, volumes de pH 5.2 e 2.5 de 100% EtOH para um volume total de 200 mL (adicionar H2O, se necessário, adicional de 5 mg de DNA é necessário se o controle de gel neutro é necessário). Incube no gelo por 20 min.</li>
		<li>Centrifugar a 16.000 x g por 20 min a 4 ° C. Remova o sobrenadante com uma pipeta.</li>
		<li>Seque a pelota no banco. Resuspenda o DNA em 14 mL de H2O.</li>
	</ol></li>
	<li>Eletroforese de gel e hidrólise alcalina<ol>
<li>Adicione 6 mL de 1m KOH e incubar a 55 ° C por 2 h.</li>
		<li>Incube as amostras no gelo por 5 min.</li>
		<li>Adicionar 4 mL de 6x do amortecedor do carregamento de DNA alcalina: 300mm KOH, 6 mM EDTA, pH 8.0, polysucrose 18% (Tabela de materiais), 0,15% verde de bromocresol e 0,25% xileno cianol FF.</li>
		<li>Converter um gel alcalino que é composto de agarose a 1%, 50mm NaOH, 1 mM EDTA, pH 8.0. Use um pente que permite 24 mL de amostra de DNA para ser carregado por faixa.</li>
		<li>Funcione o gel à temperatura ambiente em tampão de eletroforese alcalina 1x: 50mm NaOH, 1 mM EDTA, pH 8.0. Incluem um marcador de tamanho apropriado do DNA.</li>
		<li>Spin para baixo os tubos brevemente e carregar o inteiro 24 mL de amostra para o gel de agarose alcalina. Electrophorese por 30 min em 30 V, seguido por 18-20 h em 10 V.</li>
		<li>Neutralize o gel para incubação 2 de 45 min à temperatura ambiente com agitação suave na neutralização Buffer i: 1 M Tris-HCl, 1,5 M de NaCl.</li>
		<li>Mancha o DNA embebendo o gel neutralizado em 200 mL de água contendo uma diluição de 1/10.000 da mancha SYBR Gold para 2 h à temperatura ambiente com agitação suave.</li>
		<li>Visualize o DNA usando um transiluminador UV. Alcaloide-sensibilidade aumentada provoca o aparecimento de pequenos fragmentos de DNA, indicando uma maior densidade de ribonucleotídeos não reparados no DNA5.</li>
	</ol></li>
	<li>Transferência do Sul<ol>
<li>Transferi o DNA do gel alcalino para a membrana de nylon positivamente carregado por ação capilar10. Um exemplo de como esta transferência pode ser configurada é fornecido no manual Sapeka e Russell está10.</li>
		<li>Mergulhe o gel alcalino para 15 min à temperatura ambiente em tampão alcalino transferência: 0,4 M de NaOH, 1 M de NaCl.</li>
		<li>Molhe a membrana de nylon (corte ao tamanho do gel) brevemente com água e em seguida, mergulhe por 5 min em tampão alcalino transferir.</li>
		<li>Configurar a plataforma de transferência invertendo-se 3 copos de vidro (100 mL) em um assadeira de vidro. Este prato deve ser ligeiramente maior que o tamanho do gel do agarose. Defina uma placa de vidro por cima deles.</li>
		<li>Drape 2 pedaços grandes de 3mm CHR cromatografia em papel (corte ao tamanho da largura do gel plus mais lados que podem armar sobre as bordas no reservatório tampão) sobre a placa de vidro.</li>
		<li>Despeje Alkaline Buffer de transferência sobre o papel para cromatografia e metade encher o prato de vidro. Suavizar as bolhas usando uma pipeta de vidro de 5 mL.</li>
		<li>Coloque o gel de agarose em cima, outra vez, suavizar as bolhas. Cerca todas as bordas do gel com parafilme. Despeje uma pequena quantidade de Buffer alcalino de transferir para o gel.</li>
		<li>Coloque a membrana de nylon previamente embebido em cima do gel. Suavizar as bolhas.</li>
		<li>Molhados 2 pedaços de papel cortado para o tamanho do gel do agarose. Coloque-os em cima da membrana e suavizar as bolhas.</li>
		<li>Coloque uma pilha de toalhas de papel (corte para um tamanho ligeiramente maior do que o gel de agarose) em cima do sanduíche de transferência. Cuidadosamente coloque uma placa de vidro em cima as toalhas de papel. Adicione um objeto ponderado para o topo (um livro com uma massa de 400 g funciona bem).</li>
		<li>Deixe a transferência prosseguir durante a noite em temperatura ambiente.</li>
		<li>Cuidadosamente, desmontar a pilha de transferência e mergulhe a membrana durante 15 minutos à temperatura de neutralização Buffer II: 0.5 M Tris-HCl, pH 7.2, 1 M de NaCl.</li>
		<li>Crosslink o DNA para a membrana de nylon carregado usando um agente reticulante UV. Coloque a membrana no cross-linker e usar a configuração de autocrosslink.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação do Sul da sonda Nota: A abordagem descrita aqui para detectar sites sensíveis ao alcaloide no líder emergente-contra atraso-fio de uma cadeia de DNA é baseado em um protocolo previamente publicado11. Para a nossa experiência, a sondagem é realizada no gene repórter URA3 que tem sido inserido em uma das duas orientações (OR1 ou OR2) adjacentes à origem de replicação de ARS306 no cromossomo III (Figura 3A). A presença do alcaloide-sensíveis sites no DNA genômico de levedura é um indicador de incorporação ribonucleotídeo, permitindo o uso de ribonucleotídeos como os biomarcadores de DNA polimerase atividade12,13,14. Esta abordagem, usando uma sequência de DNA adjacente à eficiente ARS306 origem de replicação, de destino deve ser passível de outras localizações genômicas e genes-alvo também.<ol>
<li>PCR-amplificação de uma base de 520 segmento de par do gene repórter URA3 usando o seguinte par de primer: URA3-F1 (5´-GCTACATATAAGGAACGTGCTGC) e URA3-R1 (5´-CTTTGTCGCTCTTCGCAATGTC).</li>
		<li>Realizar a reação de PCR usando 10-20 ng de DNA genômico de levedura como um modelo, 4 μL de cada primer (estoque de 10 μM), 10 μL de 10 x Ex Taq Buffer (Mg2 + plus), 8 μL da mistura do dNTP (2,5 mM cada), 0,5 μL de Ex Taq DNA polimerase (5 U/μL) e ajustar o volume final de 100 μL com H2O.</li>
		<li>Execute o seguinte programa PCR: 95 ° C por 5 min; 30 ciclos de 95 ° C por 1 min, a 55 ° C por 1 min, 72 ° C por 2 min; 72 ° C por 10 min e espera a 4 ° C.</li>
		<li>Purificar o produto do PCR usando um kit de purificação de PCR e eluir o DNA com 50 mL de H2O. Isso agora pode ser usado como o modelo na reação de radiolabeling.</li>
		<li>Use os seguintes primers para vertente específica radioativos: uso URA3-A (5´-CTCATCCTAGTCCTGTTGCTGCC) para a visualização de DNA que anneals a sonda A. Isso corresponde o nascente principal vertente DNA quando URA3 está em OR2 e o tnascent ficando strand DNA quando URA3 está em OR1. Usar URA3-B (5´-CAGTACCCTTAGTATATTCTCCAG) para a visualização de DNA nascente que anneals a sonda B. Isso corresponde o nascente principal vertente DNA quando URA3 estiver em OR1 e revestimento nascente strand DNA quando URA3 está em OR2 (Figura 3).<ol>
<li>Realizar a reação radiolabeling usando 10-20 ng amplificado URA3 fragmento como modelo de DNA, 2 μL da primeira demão (estoque de 10 μM), 5 μL de 10 x Ex Taq Buffer (Mg2 + plus), 4 μL de dNTPs 2,5 mM (menos dCTP), 5 μL (50 μCi) de um -32P-dCTP , 0,5 μL de ExTaq DNA polimerase (5 U/μL) e ajustar o volume final de 50 μL com H2O. executar o seguinte programa para radioativos: 94 ° C por 5 min; 25 ciclos de 94 ° C por 1 min, a 55 ° C por 30 s, 72 ° C por 1 min; 72 ° C por 5 min e espera a 4 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Use uma coluna de rotação G-25 para remover marcador radioativo sem personalidade jurídica. Antes de adicionar a amostra radiolabeled, centrifugar a coluna por 1 min em 720 x g e removero tampão pipetando. Carrega o produto da reação radiolabeled e centrifugar por 2 min a 720 x g para eluir a sondas marcadas.</li>
		<li>Incube a 95 ° C por 5 min desnaturar a sonda imediatamente antes da hibridização. Cool brevemente no gelo.</li>
	</ol></li>
	<li>Hibridação do Sul<ol>
<li>Roll a membrana imersos em um tubo de hibridização e adicionar 25 mL de tampão de hibridização preparado: tampão de fosfato de sódio 0,5 M, pH 7,2, 7% Dodecil sulfato de sódio (SDS), 1% albumina de soro bovino (BSA). Incube a 65 ° C, durante 1-2 h com a rotação em um forno de hibridização.</li>
		<li>Cuidadosamente, decantar a solução e adicionar 25 mL de tampão de hibridização mais a sonda marcadas com radioisótopos. Incube a 65 ° C para 16-18 h com a rotação.</li>
		<li>Decantar a solução em um recipiente de resíduos radioactivo. Realizar 5 lavagens de 5 min à temperatura ambiente com tampão de fosfato de sódio fosfato-SDS lavagem solução i: 40 mM, pH 7,2, pH de 5% SDS, 0,5% BSA, 1 mM EDTA, 8.0.</li>
		<li>Executar 2 lavagens de 15 min a 65 ° C, com solução de lavagem fosfato-SDS II: 40 mM de tampão de fosfato de sódio, pH 7.2, 1% SDS, 1 mM EDTA, pH 8.0.</li>
		<li>Remover a membrana no tubo de hibridização usando uma pinça e coloque em um protetor de manga de plástico aberto. Cobrir e expor a uma placa de imagem. Tente um número de diferente tempos que variam de 4 h a 4D de exposição.</li>
		<li>Se necessário, strip e re-sonda blot usando uma sonda diferente aproximadamente 3 - 4 vezes. Para tira, incube a membrana para h 2 a 65 ° C, em 25 mL de uma formamida 50%, solução de x SSPE 2. Nota: 20 x SSPE solução: 3 M NaCl, 0,2 M NaH2PO4, EDTA 0,02 M, pH 7,4.</li>
		<li>Decantar a solução em um recipiente de resíduos radioactivo. Execute 2 lavagens de 15 min a 65 ° C em solução de lavagem fosfato-SDS II.</li>
		<li>Verifique se a membrana com um contador Geiger e repita o descascamento protocolo se sinal permanece.</li>
		<li>Realizar pré-hibridização e hibridação conforme descrito acima.</li>
	</ol></li>
</ol>2. medir a taxa de mutação e especificidade em cepas de S. cerevisiae
<ol><li>Preparar a cultura de células<ol>
<li>Inocular uma colônia única (colônias de 2-3 dias a 30 ° C, a forma adequada de porte do leva de células de levedura saudável) cultivada em ágar YPD suplementado com adenina de 100 mg/mL em 5 mL de caldo YPDA suplementado com adenina 250mg/mL (suplementação de adenina é necessário apenas se a tensão utilizada é um auxotroph de adenina). Cresce em uma incubadora shaker ou em rotacao a 30 ° C até que a cultura atinja a saturação (36-48 h para uma tensão sem um defeito grave de crescimento).</li>
		<li>Gire para baixo as células a ~ 2000 x g por 5 min.</li>
		<li>Desprezar o sobrenadante e lavar as células com 5 mL de água estéril.</li>
		<li>Ressuspender as células em 500 mL de água estéril.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Diluição da cultura de pilha e chapeamento<ol>
<li>Para controles de não selecção, dilua as células em uma placa de 96 poços por um fator de 1.600.000 e placa 100 mL de cada cultura em um prato (COM) completa.</li>
		<li>Para selecionar para ura3 mutantes, placa 100 mL de células não diluídas em uma placa de 5-FOA para uma estirpe do selvagem-tipo (WT). Dilua as células em conformidade, se a taxa de mutação da estirpe de interesse deverá ser maior do que em uma cepa WT.</li>
		<li>Para selecionar para mutantes can1 , diluir as células 5-fold e placa 100 mL em uma placa contendo canavanine (CAN) para uma tensão WT. O factor de diluição é 0,5.</li>
		<li>Incube as placas a 30 ° C até formar colônias de levedura. Para cepas sem um defeito de crescimento, 2-3 dias é geralmente suficientes para COM e placas e 3-5 dias para placas 5-FOA. Para comparar as taxas de mutação entre estirpes diferentes, é melhor escolher o mesmo dia de crescimento para a contagem das colónias. Armazene as placas prontas a serem contados no quarto frio (~ 4 ° C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cálculo da taxa de mutação espontânea<ol>
<li>Contagem das colónias visíveis em cada prato e tome nota dos números de colônia</li>
		<li>Calcular a taxa de mutação, usando a fórmula do Drake: μ = f ÷ ln (μNt). f é a frequência de mutação calculada pelo número de mutantes, dividido pelo número de células em cultura final. NT é o número de células em cultura final e μ é a taxa de mutação. Esta equação pode ser resolvida por um método iterativo, como o método de Newton-Raphson. Existem outros métodos de estimador, incluindo o teste de Lea e Coulson, para calcular a taxa de mutação15.</li>
		<li>Calcule o intervalo de confiança supondo log distribuição normal das taxas individuais isolados de utation. O intervalo de confiança de 95% é usado mais frequentemente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Análise de espectro de mutação<ol>
<li>Escolher uma única colônia de cada 5-FOA ou pode da placa e atualize-se sobre uma placa YPDA.</li>
		<li>Executar a colônia PCR para amplificar o gene URA3 ou CAN1 e sequência para detectar mutações usando os seguintes primers: URA3-F (5'-CGCATATGTGGTGTTGAAGAA-3') e URA3-R (5'-TGTGAGTTTAGTATACATGCA-3') para ambos os amplificação por PCR e sequenciamento do gene URA3 bp 800; CAN1-F (5'-CTTCTACTCCGTCTGCTTTC-3') e CAN1-R (5'-CAGAGTTCTTCAGACTTC-3') para amplificação e CAN1-AR (5'-TGAAATGTGAAGGCAGCGTT-3'), CAN1-9R (5'-CCTGCAACACCAGTGATA-3'), CAN1-10R (5'-GAGGATGTAACAGGGATGAAT-3') e (CAN1-BR 5'-CGGTGTATGACTTATGAGGG-3') para o sequenciamento do gene repórter 1800 bp CAN1 .</li>
		<li>Para realizar o PCR de colônia, resuspenda uma única colônia em 5 μL de H2O e 1 μL, usar como modelo. Adicionar 1 μL de cada um dos primers (estoque de 5 μM), 2 μL de tampão de x KAPA2G 5 (Mg2 + plus), 0,5 μL de dNTP (2,5 mM), 0,5 μL de KAPA2G rápido DNA polimerase, 12 μL de H2O.</li>
		<li>Para a amplificação do gene URA3 , execute o seguinte programa PCR: 95 ° C por 5 min; 5 ciclos de 95 ° C por 10 s, 61 ° C, por 15 s, 72 ° C por 30 s; 35 ciclos de 95 ° C por 10 s, 61 ° C, por 15 s, 72 ° C por 30 s; 72 ° C por 2 min e espera a 4 ° C. Para a amplificação do gene CAN1 , execute o seguinte programa PCR: 95 ° C por 5 min; 5 ciclos de 95 ° C por 10 s, 61 ° C, por 15 s, 72 ° C por 45 s; 35 ciclos de 95 ° C por 10 s, 61 ° C, por 15 s, 72 ° C por 45 s; 72 ° C por 2 min e espera a 4 ° C.</li>
		<li>Alinhe os resultados de sequenciamento para uma sequência de referência usando um programa como o DNASTAR Seqman Pro ou Sequencher para identificar as mutações.</li>
		<li>Compile os dados de mutações por tipo de mutação (Figura 4) ou localização de mutação (Figura 5). Calcule as taxas de mutação específica pela frequência de uma mutação (o número de eventos observados dividido pelo número de mutantes sequenciados) multiplicaram pela taxa de mutação global.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Nick McElhinny, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+correction+of+lagging-strand+replication+errors+made+by+DNA+polymerases+%7Balpha%7D+and+%7Bdelta%7D%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Acaddemy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Differential correction of lagging-strand replication errors made by DNA polymerases {alpha} and {delta}.</a> Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (49), 21070-21075 (2010).</li>
<li>Clark, A. B., Lujan, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mismatch+repair-independent+tandem+repeat+sequence+instability+resulting+from+ribonucleotide+incorporation+by+DNA+polymerase+epsilon%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Mismatch repair-independent tandem repeat sequence instability resulting from ribonucleotide incorporation by DNA polymerase epsilon.</a> DNA Repair (Amst). 10 (5), 476-482 (2011).</li>
<li>Lujan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mismatch+repair+balances+leading+and+lagging+strand+DNA+replication+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mismatch repair balances leading and lagging strand DNA replication fidelity.</a> PLoS Genetics. 8 (10), e1003016(2012).</li>
<li>Reijns, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+removal+of+ribonucleotides+from+DNA+is+essential+for+mammalian+genome+integrity+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Enzymatic removal of ribonucleotides from DNA is essential for mammalian genome integrity and development.</a> Cell. 149 (5), 1008-1022 (2012).</li>
<li>Lujan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+polymerase+fidelity+and+mismatch+repair+bias+genome+variation+and+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous polymerase fidelity and mismatch repair bias genome variation and composition.</a> Genome Research. 24 (11), 1751-1764 (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Aqui, descrevemos os protocolos para dois conjuntos de experiências que são frequentemente usados para analisar semi-quantitativamente ribonucleotídeos incorporados durante a replicação do DNA e os efeitos mutagênicos de ribonucleotídeos não reparados. Embora essas abordagens envolvem a eucariota modelo S. cerevisiae, estas técnicas podem ser facilmente adaptadas para outros micróbios e eucariontes ainda maiores.
Sondagem para ribonucleotídeos não reparados no DNA utilizando eletrofor...

Durante a replicação do DNA eucariótica nuclear, ribonucleotídeos são incorporados ao genoma por todos os três principais replicases de DNA, DNA polimerase (Pols) α, ε e δ1,2. Reparo de excisão do RNase H2-dependente ribonucleótido (RER3) remove a maioria destes ribonucleotídeos incorporados.
Um ribonucleótido no DNA é suscetível à hidrólise, como 2' grupo hidroxila da fracção de açúcar pode atacar o fosfodiéster adjacente, liberando uma extremidade com um fosfato cíclico 2' - 3' e o outro com uma 5'-OH4. Condições alcalinas grandemente podem acelerar esta reação. Assim, a hidrólise de ribonucleotídeos incorporados durante a incubação em uma solução básica causa a fragmentação de DNA genômico, que pode ser visualizado por electroforese de agarose alcalina5. Este DNA pode ser transferido para uma membrana e analisado pela análise de Southern blot utilizando sondas de vertente específicas que permitem a identificação dos locais sensíveis ao alcaloide causada por ribonucleotídeos incorporados para o nascente líder - ou revestimento-strand DNA, respectivamente.
Em células de levedura, falta de atividade RNase H2, remoção de ribonucleotídeos pode ser iniciada quando topoisomerase eu (Top1) rouba o DNA incorporado ribonucleótido6,7. No entanto, quando Top1 fende do lado 3' o ribonucleotídeo, isso gera 5'-OH e 2' - 3' fosfato cíclica DNA extremidades que são refratárias a religation. A reparação ou transformação aberrante destas extremidades' sujas' pode provocar instabilidade genômica. Além disso, se a incisão ocorre dentro de uma sequência de DNA a repetição, o processo de reparação pode levar a mutações de exclusão. Isto é particularmente problemático para repetições em tandem, onde curto exclusões (de entre dois e cinco pares de bases) são comumente observados em células de RNase H2-deficiente. Os efeitos deletérios de Top1-dependente na ausência de levedura RNase H2 atividade são exacerbados em um mutante ε da DNA polimerase (pol2-M644G) promíscuo para incorporação ribonucleótido durante a síntese de vertente principal nascente.
Processamento de ribonucleotídeos no DNA leva a mutações espontâneas e este mutagênese pode ser detectada usando genes repórter apropriado e selecionando para a mudança fenotípica que acompanha. Um teste de flutuação ou experiência de Luria e Delbrück é um dos métodos mais comumente utilizados para medir taxas de mutação espontânea, usando o repórter selecionável genes8,9. Fermento, os genes URA3 e CAN1 podem ser usados como repórteres em um ensaio de mutação para a frente, o que permite a detecção de todos os tipos de mutação que resultam em perda da função do gene. A taxa de mutação espontânea é estimada como a mediana de observadas em múltiplas culturas paralelas, iniciadas a partir de colônias única sem mutações no gene repórter do alvo. Uma levedura RNase H2-deficiente estirpe como rnh201Δ tem uma taxa de mutação espontânea em geral moderadamente elevados em grande parte causada por uma elevada incidência de exclusões de 2-5 bp em tandem repeat sequências. Assim, para caracterizar totalmente os efeitos mutagênicos de ribonucleotídeos no genoma, taxas de mutação específica precisam ser determinado. Neste caso, os genes repórter URA3 ou CAN1 podem ser amplificados e sequenciados para determinar os tipos e locais das mutações, e taxas de mutação específica podem ser calculadas. Compilar as mutações identificadas em vários mutantes independentes de URA3 ou CAN1 então pode ser usado para gerar um espectro de mutação.

<table><tbody><tr><td>Meio</td><td></td><td></td> YPD <td>20 g de dextrose, 20 g de peptona, 10g de extrato de levedura, em H2O deionizado até 1 L, adicione 20 g de ágar Bacto para meio sólido, autoclave.</td></tr><tr><td>Placas</td><td></td><td></td> COM <td>1,3 g de mistura de eliminação SC, 1,7 g de base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos ou (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g de dextrose, 20 g de ágar bacto desionizado H2O até 1 L. Ajuste o pH para 5,8. Autoclave e 30 - 35 ml por placa.</td></tr><tr><td>Placas</td><td></td><td></td> CAN <td>1,3 g de pó de gota SC-Ura, 1,7 g de base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos ou (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g de dextrose, 20 g de ágar Bacto, 25 mg de uracila e H2O até 1 L. Autoclave por 15 minutos a 121 &graus; C e esfriar até 56 ° C. Adicione 6 mL de solução de sulfato de canavanina a 1% esterilizada por filtro.</td></tr><tr>Placas <td></td><td></td><td>5-FOA</td><td>1,3 g de pó de escape SC-Ura, 1,7 g de base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos ou (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g de dextrose, 20 g de ágar Bacto, 25 mg de uracila e H2O até 800 mL. Autoclave por 15 minutos a 121 > C e esfriar até 60 ° C. Adicione 200 mL de solução de 5-FOA a 0,5% esterilizada por filtro.</td></tr><tr><td>L-Canavanine sulfato</td><td>US Biological</td><td>C1050</td><td></td></tr><tr><td>5-FOA</td><td>US Biological</td><td>F5050</td><td></td></tr><tr><td>20 mL tubo</td><td></td><td></td> de cultura de vidro <td>Qualquer marca</td></tr><tr><td>Rotador de cultura em 30 &deg; Incubadora C</td> A incubadora <td></td><td></td><td>Shaker pode ser usada em vez de</td></tr><tr><td>96 placas</td><td></td><td></td> de fundo bem redondas <td>Estéril, qualquer marca</td></tr><tr><td>Contas de vidro de 3 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-312A</td><td>Autoclave antes do uso</td></tr><tr><td>Pipetas</td><td></td><td></td> de 12 canais <td>Qualquer marca</td></tr><tr><td>Ex Taq DNA Polimerase TaKaRa</td><td></td><td>RR001</td><td></td></tr><tr><td>Epicentre MasterPure Yeast DNA Kit de purificação</td><td>Epicentro</td><td>MPY80200</td><td></td></tr><tr><td>acetato de sódio 3 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7899</td><td></td></tr><tr><td>100% etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorômetro</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td>Modelo mais recente disponível</td></tr><tr><td>dsDNA BR Kit de ensaio</td><td>Invitrogen</td><td>Q32850</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Dot Scientific Inc.</td><td></td><td></td>DSF10400</tr><tr><td>Bromocresol verde</td><td>Eastman</td><td>6356</td><td></td></tr><tr><td>Xileno cianol FF</td><td>International Technologies Inc.</td><td>72120</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl (pH 8.0)</td> <td>Teknova</td><td>T5080</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Gold Ácido Nucleico Gel Mancha</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>Transiluminador</td><td></td><td></td><td></td>UV</tr><tr><td>Amersham Membrana de Nylon Hybond-N +</td> <td>GE Healthcare</td><td>RPN303B</td><td></td></tr><tr><td>3 MM CHR Papel de cromatografia</td><td>Whatman</td><td>3030-392</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Caledon</td><td>7560-1</td><td></td></tr><tr><td>Stratalinker 1800</td><td>Stratagene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Kit de purificação de PCR</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>G-25 coluna giratória</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tampão fosfato de sódio (pH 7,2)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>NaH2PO4 (S9638); Na2HPO4 (S9390)</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4522</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Formamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47671</td><td></td></tr><tr>Contador <td></td><td></td><td></td><td>Geiger</td></tr></tbody></table>

estudando ribonucleótido incorporação: deteção de vertente específica de ribonucleotídeos no genoma da levedura e mutagênese induzida pela ribonucleotídeo de medição

Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

A presença de ribonucleotídeos no DNA nuclear tem demonstrada ser uma fonte de instabilidade genômica. A extensão da incorporação do ribonucleotídeo pode ser avaliada por hidrólise alcalina e electroforese do gel como o RNA é altamente suscetível à hidrólise em condições alcalinas. Isto, em combinação com a análise de Southern blot pode ser usado para determinar a localização e a vertente em que foram incorporados os ribonucleotídeos. No entanto, este procedimento só é semiquantitativo e pode não ser suficientemente sensível para detectar pequenas alterações no conteúdo do ribonucleotídeo, apesar de Southern blot vertente específica de sondagem melhora a sensibilidade. Como uma medida de uma das consequências mais marcantes de ribonucleotídeos no DNA biológicas, mutagênese espontânea pode ser analisado usando um ensaio de mutação para a frente. Usando genes repórter apropriado, raras mutações que resulta na perda de função podem ser selecionada e total e taxas de mutação específico podem ser medidas pela combinação de dados das experiências de flutuação com o sequenciamento de DNA do gene repórter. O ensaio de flutuação é aplicável para examinar uma ampla variedade de processos mutagênicos no fundo genético específico ou condições de crescimento.

Tratamento de DNA genômico com alcaloide seguido por eletroforese em gel alcalina permite detecção semi-quantitativa da fragmentação de DNA devido à abundância de ribonucleotídeos estàvel incorporados. A Figura 2 mostra as imagens de gel de levedura DNA genômico tratado com ou sem KOH5. A variante M644L de Pol2, a subunidade catalítica de Polε, reduziu a capacidade de incorporar ribonucleotídeos enquanto o mutante M644G incorpora ribon...

Ribonucleotídeos estão entre os mais abundantes nucleotídeos não-canônicos incorporados do genoma durante a replicação do DNA nuclear eucariótica. Se não forem devidamente removidos, ribonucleotídeos podem causar mutagênese e dano do ADN. Aqui, apresentamos duas abordagens experimentais que são usadas para avaliar a abundância de incorporação de ribonucleotídeo DNA e seus efeitos mutagénicos.

Estudando ribonucleótido incorporação: Deteção de vertente específica de ribonucleotídeos no genoma da levedura e mutagênese induzida pela ribonucleotídeo de medição

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas como quantos ribonucleotídeos são incorporados ao DNA de fita nascente, principal e atrasada no genoma. Embora este método possa fornecer informações quantitativas e qualitativas sobre a densidade de ribonucleaotídeos no genoma da levedura, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como genomas de mamíferos. A eletroforese em gel alcalino fornece uma visão semiquantitativa da incorporação de ribonucleotídeos em todo o genoma e o southern blotting específico da fita permite maior sensibilidade e quantificação em um locus genômico específico.Para iniciar este procedimento, adicione seis microlitros de hidróxido de potássio molar a cada amostra de DNA genômico de levedura recém-preparada e incube a 55 graus Celsius por duas horas. Após duas horas, incubar as amostras no gelo durante cinco minutos. Em seguida, adicione a cada amostra quatro microlitros de tampão de carga de DNA alcalino 6-6.Moldar um gel alcalino composto de um por cento de agarose, 50 milimolares de hidróxido de sódio e um milimolar EDTA pH oito com um pente que permite que 24 microlitros de amostra de DNA sejam carregados por pista. Gire os tubos de amostras breve

studying-ribonucleotide-incorporation-strand-specific-detection

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Estudos de genética em leveduras podem ser empregadas para investigar as funções de celular e molecular dos genes humanos no metabolismo do DNA celular. Métodos são descritos para a caracterização genética do ser...

Estudos genéticos de proteínas de reparo do DNA Humano Utilizando Levedura como um sistema modelo

O nível de estado estacionário de ARNm específicos é determinada pela velocidade de síntese e decaimento do ARNm. Taxas de degradação de mRNA genome-wide ou as taxas de decaimento de mRNAs específicos pode ser medido através da determinação de ARNm de semi-vida. Este protocolo centra-se na medição das taxas de decaimento de mRNA em Saccharomyces cerevisiae.

Medição do mRNA Decay Preços em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Usando<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Cepas

Aqui apresentamos um método econômico para definir interações químico-genéticas em leveduras em brotamento. A abordagem é construída sobre técnicas fundamentais em biologia molecular de leveduras e é adequada para o interrogatório mecanicista de pequenas e médias coleções de produtos químicos e outros ambientes de mídia.

Identificação rápida de químicos Genéticos Interações em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Uma estratégia para gerar mutações em genes de histonas em sua localização endógena em Saccharomyces cerevisiae é apresentada.

Visadas<em&gt; In Situ</em&gt; mutagénese de histona Genes em brotamento Yeast

Aqui nós descrevemos um método passível de dosar simultaneamente e ribonucleotídeos mapa de todo o genoma em DNA altamente intacta na resolução de single-nucleotide, combinando a clivagem enzimática do DNA genômico com sua hidrólise alcalina e subsequente 5´-final sequenciamento.

Mapeamento simultâneo e quantificação de ribonucleotídeos no DNA mitocondrial humano

Regulamento translacional desempenha um papel importante no controle da abundância de proteína. Aqui, descrevemos um método de alta produtividade para análise quantitativa de tradução em brotamento levedura Saccharomyces cerevisiae.

Quantificação de todo o genoma de tradução no fermento Budding pelo Ribossoma perfilamento

O protocolo descrito aqui baseia-se a quantificação de todo o genoma de mRNA recentemente sintetizadas purificada de células de levedura rotuladas com 4-thiouracil. Este método permite medir a síntese de mRNA desacoplada do decaimento do mRNA e, portanto, fornece uma medição precisa da transcrição do RNA polimerase II.

Saccharomyces cerevisiae Metabólica de rotulagem com 4-thiouracil e a quantificação dos recém sintetizado mRNA como um Proxy para a RNA polimerase II atividade

Aqui apresentamos quatro protocolos para construir e explorar cepas de levedura Saccharomyces cerevisiae reporter para estudar o potencial de transativação do p53 humano, impactos de suas várias mutações associadas ao câncer, proteínas interagindo coexpressas e os efeitos de moléculas pequenas específicas.

Fermento como um chassi para desenvolver ensaios funcionais para estudar p53 humano

Aqui nós apresentamos um protocolo para o clivagem dnazyme-dependente do RNA. Isto permite a análise rápida e local-dependente do RNA 2 '-O-methylation. Esta aproximação pode ser usada para a avaliação preliminar ou principal da atividade do snoRNA.

Análise DNAzyme-dependente de rRNA 2 '-O-methylation

Este protocolo descreve um ensaio nãoradioativo para medir a atividade de quinase de quinases (PNKs) em pequenos substratos de DNA e RNA.

Ensaio nãoradioativo para medir a fosforilação de polinucleotídeos de substratos de pequenos nucleotídeos

Descrevemos dois protocolos complementares para determinar com precisão a duração da fase S em S. cerevisiae usando EdU, um análogo da timidina, que é incorporado in vivo e detectado usando a química Click por microscopia e citometria de fluxo. Ele permite a fácil caracterização da duração da replicação do DNA e defeitos de replicação negligenciados em mutantes.

Determinação da Duração da Fase S Usando a Incorporação de 5-Etil-2'-desoxiuridina em Saccharomyces cerevisiae

Aprenda a quantificar a incorporação de ribonucleotídeos no DNA de levedura usando eletroforese em gel alcalino e Southern blot específico de fita. Este método permite avaliar efeitos mutagênicos e estabilidade genômica.

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Estudando ribonucleótido incorporação: Deteção de vertente específica de ribonucleotídeos no genoma da levedura e mutagênese induzida pela ribonucleotídeo de medição

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