Name: O uso do Mouse Splenocytes para avaliar a influência do patógeno associado padrão Molecular na expressão gênica de relógio (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: Aprenda a avaliar como padrões moleculares associados a patógenos alteram a expressão gênica do relógio molecular em esplenócitos de camundongo. Este método reprodutível auxilia pesquisadores em imunologia e cronobiologia.

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Este trabalho foi apoiado pela pesquisa de faculdade concede do escritório da faculdade de artes e Ciências do reitor na Universidade de Hartford.

Durante o estudo, tratamento e cuidados com animais cumprido com a política do National Institutes of Health, estavam em conformidade com as orientações institucionais e foram aprovados pelo Comitê de uso e cuidado Animal institucional Animal Universidade de Hartford.
1. o arrastamento de animais
Nota: Vinte semanas masculino B6129SF2/J os ratos são usados no estudo.
<ol><li>Arrastar os ratos para um 12 h luz (padrão sobrecarga luz branca) / ciclo de 12h escuro durante 2 semanas antes do experimento. Nota: Aqui tempo zeitgeber (ZT) 0 corresponde a luzes acesas e ZT12 de luzes apagadas, mantendo todos os outros fatores ambientais (ou seja, comida, água e temperatura) constante 21.</li>
</ol>2. preparação dos instrumentos, meio de cultura e meio de desafio
<ol><li>Autoclave fórceps e a tesoura de dissecação. Enrole pares de corrediças do microscópio fosco em folha de alumínio e autoclave.</li>
	<li>Prepare o meio de cultura por adição de soro fetal bovino (FBS) para RPMI 1640 para uma concentração final de 10%. Prepare-se 10 mL de meio de desafio em tubos de 50 mL, adicionando os seguintes PAMPs ao meio de cultura (RPMI com 10% FBS); LPS (5 µ g/mL), ODN1826 (5 µ g/mL), calor-matou Listeria monocytogenes (108 HKLM/mL), ou outro PAMP em sua concentração sugerida.</li>
	<li>Aquecer o meio de cultura e meio de desafio a 37 ° C em banho-maria e manter cerca de 70 mL de soro fisiológico estéril tamponado de fosfato (PBS, pH 7,2) à temperatura ambiente.</li>
	<li>Adicione 10 mL de meio de cultura usando uma pipeta de 10 mL e pipeta ajuda para um tubo de 50 mL e lugar no gelo.</li>
	<li>Adicione aproximadamente 30 mL de etanol a 70% para fins de copo e coloque um 100ml de tesoura e pinça de dissecação no copo medidor para evitar a contaminação microbiana.</li>
	<li>Prepare-se do lysis para isolamento de RNA adicionando 10 µ l de β-mercaptoetanol (sob uma coifa) para cada 1 mL de tampão RLT em um tubo de 50 mL. Faça apenas a quantidade que será necessária (600 µ l por amostra, que consiste em aproximadamente 1 x 106 células). Nota: O Buffer RLT é um componente do kit de extração de RNA que suporta a ligação do RNA para a membrana de silicone.</li>
</ol>3. Splenocyte isolamento e desafio
<ol><li>Eutanásia em ratos a um momento de particular zeitgeber através de narcose por mantê-los em sua gaiola original e adição de CO2 para a gaiola, a uma taxa de fluxo de 3 L/min. Continue fornecendo CO2 por 1 min após a respiração para.</li>
	<li>Confirme a morte através do deslocamento cervical, colocando o polegar e o dedo indicador em ambos os lados do pescoço na base do crânio. Alternativamente, pressione uma haste na base do crânio enquanto puxa rapidamente (usando a outra mão) a base da cauda ou membros posteriores para causar a separação das vértebras cervicais do crânio22.</li>
	<li>Pulverize o tronco de rato com etanol a 70% e limpe com uma toalha de papel. Posicione o mouse na sua traseira e ligeiramente inclinada para o seu lado direito. Cortar o pelo, usar dissecando tesoura, ao longo do lado esquerdo do mouse, sobre no meio do caminho entre a frente e pernas traseiras.</li>
	<li>Usando a pinça, pegue o peritônio e cuidadosamente fazer uma incisão para não danificar o baço. Remover o baço com pinça e coloque em um tubo estéril 50 mL contendo cerca de 10 mL de meio de cultura no gelo. Repita para os restantes animais. Nota: O baço é a cor de um grão de feijão, e é mais longo e mais plana do que o rim.</li>
	<li>
Transferi um baço com 2 mL de meio de cultura para uma pequena placa de Petri estéril.
	<ol>
<li>Homogeneizar o baço por moagem é entre a parte geada de dois slides foscas estéril. Se possível, manter a questão e células no meio durante o processo de homogeneização.</li>
		<li>Uma vez completamente homogeneizado, pipeta de 2 mL de meio de cultura contendo os splenocytes através de um filtro de célula de nylon µm 40 em um tubo de 50 mL.</li>
		<li>Repita as etapas acima para os restantes baços usando novos pares de slides geados, tubos de 50 mL com meio de cultura e filtros de célula.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicione 8 mL de meio de cultura de frio a cada um dos tubos de 50 mL contendo os splenocytes para um volume total de 10 mL/tubo. Determine o número de células por mililitro, usando um hemocytometer.</li>
	<li>Adicione aproximadamente 1 x 106 células/poço para placas 6-poço de cultura. Adicione células ao número de poços que correspondem ao número de diferentes PAMPs sendo usado para o experimento e incluir um controle bem. Adicione 3 mL de meio de cultura ou 3 mL de meio de desafio aos respectivos poços.</li>
	<li>Incube as placas a 37 ° C em 5% de CO2 por 3 h.</li>
	<li>Raspe as células da parte inferior do bem, usando a ponta da pipeta 1.000 µ l anexado a uma micropipeta P1000. Transferi a mídia que contém as células com a mesma ponta da pipeta µ l 1.000 para um tubo de 15 mL.</li>
	<li>Granule as células através de centrifugação a 167 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Remover o sobrenadante e lavar o centrifugado com 5 mL de PBS.</li>
	<li>As células de pelotas uma segunda vez a 167 x g por 5 min, retire o sobrenadante e adicionar 600 µ l de tampão de Lise para o centrifugado para lisar as células. Em seguida proceda ao isolamento de RNA.</li>
</ol>4. RNA isolamento e síntese de cDNA
<ol><li>Isolar o RNA do splenocytes usando o kit de extração de RNA de acordo com as instruções do fabricante e realizar a digestão de DNA na coluna 'opcional'.</li>
	<li>Antes da síntese do cDNA, determine a concentração de RNA usando um espectrofotômetro microvolume para verificar se a concentração está dentro da faixa ideal de RNA (até 2 µ g) do kit de síntese do cDNA.</li>
	<li>
Synthesize cDNA para cada uma das amostras usando o kit de transcrição reversa de acordo com as instruções do fabricante. Use 10 µ l de RNA para cada uma das amostras em um volume de reação total de 20 µ l. Após a conclusão da transcrição reversa (thermocycler executado) adicionar 20 μL H2O para cada reação.
</li>
	<li>Construa a curva padrão usando uma micropipeta P10 ou P20 para piscina mRNA de algumas amostras de controlo (por exemplo, 5 µ l de 2 amostras num total de 10 µ l) em um tubo de 0,5 mL para preparar o cDNA.<ol>
<li>Adicione 10 µ l 2 x mestre mistura transcriptase reversa.</li>
		<li>Após a conclusão da transcrição reversa, adicione 10 µ l de H2O para o tubo de reação, que servirá como a concentração inicial ("1") da série de diluição para a curva padrão.</li>
		<li>Execute uma série de diluições de 10 vezes (de 1 a 10-4) adicionando 45 µ l de água utilizando uma micropipeta P100 ou P200 em quatro tubos de 0,5 mL, designados de 10-1, 10-2, 10-3e 10-4.<ol>
<li>Adicionar 5 µ l da concentração inicial "1" no primeiro tubo (10-1) utilizando um micropepitador P20, mistura pipetando para cima e para baixo várias vezes, então transferência 5 µ l do tubo de 10-1 para o tubo designado 10-2 e misture.</li>
			<li>Transferência de 5 µ l utilizando uma micropipeta P20 do tubo de 10-2 no tubo designado 10-3 e misturar. Transferência de 5 µ l utilizando um micropepitador P20 do tubo de 10-3 no tubo designado 10-4 e misture.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. quantitativo reação em cadeia da polimerase (qPCR)
<ol><li>Determine a quantificação relativa dos níveis de mRNA por qPCR. Dentro do conjunto experimental acima, selecione "Quantificação – curva padrão relativo" e "TaqMan" química. Alterar o volume de reação de 10 µ l. Insira as informações relevantes para o layout da placa (por exemplo, gene alvo, curva de calibração, repórter, etc.).</li>
	<li>Preparar a reação, para que ele contém 0,5 µ l do ensaio da primeira demão/sonda, 5 µ l de mistura mestre de expressão de gene, 2 µ l de H2O e 2,5 µ l de cDNA (10-100 ng).<ol>
<li>Preparar uma mistura de mestre multiplicando cada um dos reagentes anteriores (exceto o cDNA) pelo número de reações, certificando-se de incluir aqueles da curva padrão, controles negativos, realizando cada reação em duplicata e 2 reações extras que serão responsáveis para variação de pipetagem.</li>
		<li>Pipeta de 7,5 µ l da mistura preparada mestre em poços pré-determinado em uma placa de 96 poços de reação com uma micropipeta ou uma pipeta multicanal. Pipetar 2,5 µ l de cDNA no bem apropriado para as incógnitas e os padrões e 2,5 µ l de H2O para os poços de controle negativo.</li>
		<li>Incluir ensaios de primer/sonda para vários genes do relógio molecular e também incluem um ensaio para um controle endógeno (por exemplo, β-actina).</li>
	</ol>
</li>
	<li>A fim de determinar os valores de expressão relativa, calcular a quantidade relativa média para cada replicar, em seguida, para cada amostra, dividir a quantidade relativa média para o gene alvo pela quantidade relativa média para β-actina.</li>
</ol>6. análise estatística
<ol><li>Usando o software de análise estatística, inserir dados no programa sob a opção de estatísticas de coluna. Selecione uma ANOVA One-Way com teste post hoc de Dunnett para avaliar as diferenças entre os valores médios da expressão do gene relógio após desafio PAMP contra o controle.</li>
</ol>

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O autor não tem nada para divulgar.

Neste protocolo, um espectrofotômetro microvolume pode ser usado para quantificar e avaliar a pureza do RNA sendo usado para determinar a expressão do gene. Ácidos nucleicos absorvem UV luz em 260 nm, proteínas normalmente absorvem luz em 280 nm, enquanto outros contaminantes potenciais usados durante um procedimento de extração de RNA (por exemplo, fenol) são detectáveis em 230 nm. Portanto, avaliando a absorvância (A) relação em 260/280 nm (RNA à proteína) e 260/230 nm (RNA de contaminantes não proteico) a qua...

O pulso de disparo mestre em mamíferos, que coordena as oscilações de 24h para quase todos os aspectos da fisiologia e comportamento, está localizado dentro do núcleo supraquiasmático (SCN) do hipotálamo1,2. Além de processos biológicos a nível de regulação, o pulso de disparo mestre também sincroniza periféricos relógios celulares em todo o corpo,3,4,5. Enquanto as máquinas de relógio molecular consiste de pelo menos três loops de feedback transcriptional-translacional interligadas, o núcleo é composto do período (Per1-3), prevenção (Cry1-2), Bmal1, e relógio genes6,7. Além de manter a altura exata do relógio molecular núcleo, alguns produtos de genes do relógio auxiliares (por exemplo, Rev-erbα e Dbp) também regulam a expressão de genes não-tempo, ou seja, clock genes controlados (CCGs)6 , 7.
Funcionais relógios moleculares têm sido descritos em vários tecidos imune (por exemplo, baço e linfonodos)8 e células (por exemplo, B células, as células dendríticas, macrófagos)8,9. Estas células detectam e respondem a padrões moleculares associados patógeno (PAMPs), componentes microbianos conservadas, via receptores de reconhecimento imune inata como receptores Toll-like (TLRs)10. Até à data, têm sido descritos 13 TLRs funcionais, que reconhecem constituintes microbianos, como componentes da parede celular bacteriana, flagelar proteínas e ácidos nucleicos microbial10. O PAMP, lipopolissacarídeo (LPS), um componente da parede celular de bactérias Gram-negativas, reconhecido por TLR4, foi mostrado para alterar o ritmo circadiano nos níveis de organismos e moleculares. Por exemplo, na vivo desafio de LPS induzido atrasos fótica-como fase medido pela atividade em ratos11 e levou à expressão do gene relógio reduzida no SCN e no fígado, conforme determinado pela hibridação in situ e PCR quantitativo, respectivamente, em ratos,12. Depois de um desafio na vivo com LPS, análise de leucócitos do sangue periférico humano13 e tecido adiposo subcutâneo14 revelou expressão alterada de vários genes de relógio, medido através de qPCR. Por último, ex vivo desafios LPS de macrófagos humanos e macrófagos peritoneais de rato, também levados a alteraram a expressão relógio medida pelo qPCR14.
Aqui, descrevemos um protocolo para avaliar a influência dos PAMPs LPS, ODN1826 (oligonucleotídeos sintéticos contendo unmethylated motivos CpG) e matou o calor Listeria monocytogenes (HKLM), reconhecido por TLR4 e TLR9 TLR2, respectivamente, na expressão gênica de relógio molecular em splenocytes de rato. O protocolo inclui esplenectomia rato, isolamento de splenocyte e desafio, RNA extração, síntese do cDNA e qPCR para avaliar a expressão de vários genes do relógio. Este protocolo permite a aquisição atempada de um grande número de células do sistema imunológico com muito pouco animal ou manipulação celular, que pode então ser desafiado ex vivo com diversos PAMPs. O relógio molecular tem sido mostrado para modular a vários aspectos da resposta imune8,15,16, portanto, interrupção do relógio molecular provavelmente iria prejudicar a adequada variação dependente do tempo da resposta imune. Além disso, uma vez que as perturbações do ritmo circadiano podem levar a graves patologias17,18,19,20, pode ser de interesse para os investigadores desafiar splenocytes com uma ampla gama de moléculas e avaliar sua influência sobre o relógio.

<table><tbody><tr><td>Lâminas foscas</td><td>Fisher</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de células</td><td>Fisher</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolissacarídeo&nbsp;</td><td>InvivoGen</td><td>ltrl-eklps</td><td></td></tr><tr><td>ODN1826</td><td>InvivoGen</td><td>Tlrl-1826-1</td><td></td></tr><tr><td>HKLM</td><td>InvivoGen</td><td>Tlrl-hklm</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012-043</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104 ou 74106</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto DNase livre de RNase</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de células de 6 poços</td><td>Denville</td><td>T1006</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 50 mL</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 15 mL</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Kit de transcrição reversa de cDNA de alta capacidade</td><td>ThermoFisher</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Ensaios de expressão gênica b-actina</td><td>ThermoFisher</td><td>Mm00607939_s1</td><td></td></tr><tr><td>Ensaios de expressão gênica TaqMan Per2</td> Ensaios de expressão gênica <td>ThermoFisher</td><td>Mm00478113_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Rev-erba</td><td>ThermoFisher</td><td>Mm00520708_m1</td><td></td></tr><tr><td>Ensaios de expressão gênica TaqMan Bmal1</td><td>ThermoFisher</td><td>Mm00500226_m1</td><td></td></tr><tr><td>Ensaios de expressão gênica TaqMan Dbp</td><td>ThermoFisher</td><td>Mm00497539_m1</td><td></td></tr><tr><td>máquina de qPCR StepOnePlus</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Placa de reação rápida de 96 poços (0,1 mL)</td><td>ThermoFisher</td><td>4346907</td><td></td></tr><tr><td>Software de Análise Estatística</td><td>Prism 7.0a</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

o uso do mouse splenocytes para avaliar a influência do patógeno associado padrão molecular na expressão gênica de relógio

The Use of Mouse Splenocytes to Assess Pathogen-associated Molecular Pattern Influence on Clock Gene Expression

De comportamento de expressão gênica, ritmos circadianos regulam quase todos os aspectos da fisiologia. Aqui, apresentamos uma metodologia para desafiar splenocytes de rato com o lipopolissacarídeo (PAMPs) de padrões moleculares associados patógeno (LPS), ODN1826 e calor-matou Listeria monocytogenes e examinar seu efeito sobre o molecular circadian pulso de disparo. Anteriormente, estudos têm focado a analisar a influência dos LPS do relógio molecular, usando uma variedade de abordagens in vivo e ex vivo de uma variedade de modelos (por exemplo, rato, rato e humanos). Este protocolo descreve a isolação e o desafio de splenocytes, bem como a metodologia para avaliar a expressão de gene de relógio pós-desafio através de PCR quantitativo. Esta abordagem pode ser usada para avaliar não só a influência de componentes microbianos do relógio molecular mas também outras moléculas que podem alterar a expressão do relógio. Esta abordagem poderia ser utilizada para arreliar distante o mecanismo molecular de como interação de PAMP-Toll-like receptor influencia a expressão do relógio.

Os ratos foram sacrificados em ZT13, splenocytes foram isoladas e desafiou ex vivo com o LPS PAMPs, ODN1826 ou HKLM. Depois de 3 h, RNA foi isolado, e qPCR foi usada para avaliar os níveis de expressão relativa dos genes relógio molecular relógio, Per2, Dbp e Rev-erbα em comparação com células de controle sem contestação. Após o desafio PAMP, níveis de expressão de relógio não foram significativamente diferentes do que a expressão nas ...

Este protocolo descreve uma técnica usando splenocytes rato para descobrir padrões moleculares associados patógeno que alteram a expressão de gene do relógio molecular.

O uso do Mouse Splenocytes para avaliar a influência do patógeno associado padrão Molecular na expressão gênica de relógio

From behavior to gene expression, circadian rhythms regulate nearly all aspects of physiology. Here, we present a methodology to challenge mouse ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da imunologia e cronobiologia, como a forma como os componentes microbianos alteram o relógio molecular. As principais vantagens desta técnica são que ela é fácil de executar, os efeitos de diferentes componentes microbianos no relógio molecular são avaliados e é altamente reprodutível. Para iniciar o protocolo, prepare o meio de cultura adicionando soro fetal bovino ao RPMI 1640 a uma concentração final de 10%Prepare 10 mililitros de meio de desafio para cada um dos PAMPS a serem testados em tubos de 50 mililitros adicionando o meio de cultura PAMP listado.Pulverize um tronco de rato previamente preparado com 70% de etanol e limpe-o com uma toalha de papel. Coloque o mouse de costas, ligeiramente inclinado para o lado direito. Em seguida, corte o pelo usando uma tesoura de dissecação ao longo do lado esquerdo do mouse, a meio caminho entre as patas dianteiras e traseiras.Usando uma pinça, segure o peritônio e faça uma incisão com cuidado sem danificar o baço. Remova o baço com uma pinça e coloque-o em um tubo estéril de 50 mililitros contendo aproximadamente 10 mililitros de meios de cultura no gelo. Em seguida, trans

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Relógios circadianos funcionam no interior das células individuais, ou seja, são células-autónomo. Aqui, descrevem métodos para a geração de modelos de células autónomas relógio usando não-invasiva, com base em tecnologia de luciferase bioluminescência em tempo real. Células repórter fornecer tratáveis, sistemas modelo funcional para estudar biologia circadiano.

Monitorização das células-autônomas Ritmos relógio circadiano de expressão genética dos Repórteres Bioluminescência luciferase

Fonte: Madenspacher, J. H. e Fessler, M. B. Um método não invasivo e tecnicamente não intensivo para indução e fenotipagem de pneumonia bacteriana experimental em camundongos. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra o processo de quantificar a carga bacteriana no baço de um camundongo infectado para avaliar a gravidade da infecção. O baço homogeneizado é diluído em série e placado para determinar a carga bacteriana total. Os dados resultantes fornecem insights sobre as interações...

Avaliação da Carga Bacteriana no Baço de Camundongos para Estudos de Infecção

Source: Ahn, J. J., et al., Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-γ Responses. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the preparation of mouse splenocyte cultures from Listeria monocytogenes-infected mice for downstream cytokine analysis. It includes ex vivo bacteria-derived antigen stimulation and sample processing to study T cell responses.

In Vitro Stimulation of Mouse Splenocytes with Heat-Killed Listeria monocytogenes

A transferência de linfócitos bm12 para um receptor C57BL/6 é um modelo estabelecido de lúpus eritematoso sistêmico. Aqui descrevemos como iniciar a doença usando este modelo e como caracterizar células T foliculares auxiliares, células B do centro germinativo e células plasmáticas por citometria de fluxo.

O Inducible Modelo BM12 de Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES) em camundongos C57BL / 6

Aqui, descrevemos as configurações para monitorar em paralelo a bioluminescência circadiana e a atividade secretora das células das ilhotas humanas e miotubos primários. Para isso, empregamos a entrega do gene lentiviral de um repórter de relógio central de luciferase, seguido de sincronização in vitro e coleta de meio de saída por perifusão celular contínua.

Medição paralela da expressão do gene relógio circadiano e hormonal secreção em culturas de células primárias humanas

Este protocolo descreve a quantificação de alvos múltiplos de citocinas simultaneamente em sobrenadantes de cultura de tecidos coletados de rato estimulada splenocytes usando multiplex do grânulo imunoensaio baseado em plataforma e um citômetro de fluxo.

Multiplexar Cytokine perfilação de Mouse estimulada Splenocytes usando uma plataforma baseada em Cytometric Bead imunoensaio

Esta tecnologia baseada em fluorescência recém-desenvolvido permite a monitoração a longo prazo da transcrição de genes do relógio circadiano no núcleo supraquiasmático (SCN) de movimentando-se livremente os ratos em tempo real e em uma alta resolução temporal.

Na Vivo Monitoramento de expressão de Gene relógio circadiano no núcleo supraquiasmático do Mouse usando a repórteres de fluorescência

Descrevemos dois ensaios in vitro e in vivo de infecção que podem ser usados para analisar as atividades dos fatores do hospedeiro-codificação.

Usando um patógeno bacteriano para sonda para celular e organísmica-nível Host respostas

Aqui, nós descrevemos um método confocal simples da imagem latente para visualizar a localização in situ das pilhas que secretoras a gama do interferon do citocinas em órgãos lymphoid secundários murino. Este protocolo pode ser estendido para a visualização de outras citocinas em diversos tecidos.

Imagem latente da produção in situ da gama do interferon no spleen do rato depois da infecção dos monocytogenes de Listeria

Este estudo apresenta estratégias quimiogenéticas e baseadas em luz violeta para permitir um deslocamento de fase circadiano diurno confiável.

Induzir deslocamentos de fase circadianos diurnos usando abordagens quimiogenéticas e espectrais

Aprenda a avaliar como padrões moleculares associados a patógenos alteram a expressão gênica do relógio molecular em esplenócitos de camundongo. Este método reprodutível auxilia pesquisadores em imunologia e cronobiologia.

O uso do Mouse Splenocytes para avaliar a influência do patógeno associado padrão Molecular na expressão gênica de relógio

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