O uso do Mouse Splenocytes para avaliar a influência do patógeno associado padrão Molecular na expressão gênica de relógio

Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da imunologia e cronobiologia, como a forma como os componentes microbianos alteram o relógio molecular. As principais vantagens desta técnica são que ela é fácil de executar, os efeitos de diferentes componentes microbianos no relógio molecular são avaliados e é altamente reprodutível. Para iniciar o protocolo, prepare o meio de cultura adicionando soro fetal bovino ao RPMI 1640 a uma concentração final de 10%Prepare 10 mililitros de meio de desafio para cada um dos PAMPS a serem testados em tubos de 50 mililitros adicionando o meio de cultura PAMP listado.

Pulverize um tronco de rato previamente preparado com 70% de etanol e limpe-o com uma toalha de papel. Coloque o mouse de costas, ligeiramente inclinado para o lado direito. Em seguida, corte o pelo usando uma tesoura de dissecação ao longo do lado esquerdo do mouse, a meio caminho entre as patas dianteiras e traseiras.

Usando uma pinça, segure o peritônio e faça uma incisão com cuidado sem danificar o baço. Remova o baço com uma pinça e coloque-o em um tubo estéril de 50 mililitros contendo aproximadamente 10 mililitros de meios de cultura no gelo. Em seguida, transfira o baço com dois mililitros de meio de cultura para uma placa de Petri pequena e estéril.

Homogeneizar o baço triturando-o entre a parte fosca de duas lâminas foscas estéreis. Depois de completamente homogeneizado, pipetar os dois mililitros de meio de cultura contendo os esplenócitos através de um filtro de células de náilon de 40 mícrons em um tubo de 50 mililitros. Adicione oito mililitros de meio de cultura a frio a cada um dos tubos de 50 mililitros contendo os esplenócitos, para um volume total de 10 mililitros por tubo.

Determine o número de células por mililitro usando um hemocitômetro. Adicione aproximadamente uma vez 10 às sextas células por poço às placas de cultura de seis poços. Depois de adicionar as células, adicione três mililitros de meio de cultura ou três mililitros de meio de desafio às células.

Em seguida, incube as placas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por três horas. Raspe as células do fundo do poço usando uma ponta de pipeta de 1.000 microlitros conectada a uma micropipeta P1000. Com a mesma ponta de pipeta, transferir o meio que contém as células para um tubo de 15 mililitros.

Pulverizar as células a 167 vezes g durante cinco minutos à temperatura ambiente. Remova o sobrenadante e lave o pellet celular com cinco mililitros de PBS. Depois de peletizar as células uma segunda vez a 167 vezes g por cinco minutos, remova o sobrenadante e adicione 600 microlitros de tampão de lise ao pellet celular.

Isole o RNA dos esplenócitos usando o kit de extração de RNA de acordo com as instruções do fabricante e execute a digestão opcional do DNA na coluna. Sintetize o cDNA para cada uma das amostras usando o kit de transcrição reversa de acordo com as instruções do fabricante. Use 10 microlitros de RNA para cada uma das amostras em um volume total de reação de 20 microlitros.

Puxe o mRNA de algumas amostras de controle para um tubo de 0,5 mililitro para preparar o cDNA a ser usado para a curva padrão ao realizar PCR quantitativo. Adicione 10 microlitros de mistura master de transcriptase reversa 2X. Ao completar a transcrição reversa, adicionar 10 microlitros de água ao tubo de reação, que serve como concentração inicial na série de diluição para a curva padrão.

Realize uma série de diluição de dez vezes adicionando 45 microlitros de água em quatro tubos de 0,5 mililitro designados 10 para menos um, 10 para menos dois, 10 para menos três e 10 para menos quatro. Adicione cinco microlitros da concentração inicial um no segundo tubo, 10 no negativo, usando um micropipetador P20. Misture pipetando para cima e para baixo várias vezes, depois transfira cinco microlitros do tubo de 10 para o tubo de menos um para o tubo designado de 10 para o tubo de menos dois e misture.

Transfira cinco microlitros usando uma micropipeta P20 do tubo de 10 para menos dois para o tubo designado 10 para menos três e misture. Finalmente, transfira cinco microlitros usando um micropipetador P20 do tubo de 10 para menos três para o tubo designado 10 para menos quatro e misture. Prepare a reação de modo que contenha 0,5 microlitros do ensaio da sonda de primer, cinco microlitros de master mix de expressão gênica, dois microlitros de água e 2,5 microlitros de cDNA.

Pipetar as amostras de RNA em uma placa de qPCR de 96 poços. Incube ensaios de sonda de primer para vários genes de relógio molecular e inclua um ensaio para um controle endógeno e carregue-o em uma máquina de qPCR para determinar a quantificação relativa dos níveis de mRNA. Dentro da configuração experimental, selecione quantificação, curva padrão relativa e química TaqMan.

Em seguida, altere o volume da reação para 10 microlitros. Insira as informações relevantes no layout da placa. qPCR foi realizada em RNA isolado para avaliar os níveis de expressão relativa dos genes do relógio molecular, clock, Per2, Dbp e Rev-erb alfa.

Após o desafio com PAMP, os níveis de expressão do relógio não foram significativamente diferentes em comparação com as células de controle. Os níveis de expressão de Per2 foram significativamente elevados em células desafiadas com LPS e ODN1826 quando comparadas a controles não desafiados. O LPS foi o único PAMP a alterar a expressão de Rev-erb alfa, pois os níveis de mRNA foram significativamente mais baixos do que nos controles não desafiados.

Níveis significativamente mais baixos de mRNA foram observados para Dbp após o desafio com cada um dos PAMPs quando comparados aos controles. Após este procedimento, outras moléculas além dos PAMPs podem ser usadas para avaliar sua influência no relógio molecular dos esplenócitos.