Name: Nervo guiadas estimulador injeção de células-tronco autólogas perto do nervo laríngeo recorrente esquerdo equina (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Aprenda a injetar células-tronco autólogas guiadas por estimulador de nervo para tratar neuropatia laríngea recorrente em equinos. Esta técnica minimamente invasiva permite coletar e injetar células com segurança.

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O estudo foi financiado pelo centro de investigação Equine de Soie-le-Mont.

A Comissão para o uso ético de animais da Universidade de Liège aprovado o protocolo de estudo.
1. músculo Microbiopsy
<ol><li>Identifique o local de amostra por inspeção visual e palpação, na cabeça longa do músculo tríceps, aproximadamente na linha média entre o ponto do cotovelo e o ponto do ombro.</li>
	<li>Clip de uma zona de cerca de 2 x 2 cm2 com uma tosquiadeira elétrica. Aplique o esfoliante cirúrgico consistindo de sabonete líquido de polyiodide e compressas de álcool para 1 min sobre a área recortada. Injecte por via subcutânea, 1 mL de solução de lidocaína 2% com uma agulha de 25 G no centro da zona recortada e desinfectado.</li>
	<li>Esfregue as mãos com sabonete antibacteriano. Colocar luvas estéreis. Use um pano estéril descartável como uma superfície estéril para Coloque a agulha de biópsia e o trocarte.</li>
	<li>A agulha de biopsia de 14 G semiautomático do braço, puxando o mecanismo da mola, como mostrado nas figuras 1b e 1C. A agulha de biopsia para familiarizar-se com seu mecanismo de lançamento. Coloque a agulha de biopsia armados na superfície estéril. Familiarize-se com o trocarte, que consiste de uma cânula e um obturador como mostrado na Figura 1um.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58023/58023fig1.jpg"> Figura 1 : O conjunto de agulha de biópsia. O conjunto de agulha de biópsia consiste de (um) a cânula e o obturador e a biópsia agulha (de cima para baixo). Os outros painéis mostram a agulha de biópsia em seu (b) neutro e (c) armados de posição. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58023/58023fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<ol start="5"><li>Prepare o trocarte, montagem da cânula e o obturador e mantê-los em uma posição de bloqueio. Introduza o trocarte perpendicularmente à pele através da zona anteriormente insensíveis. Avance o trocarte para uma posição onde a ponta do trocarte é aproximadamente 1,5 cm profundamente no músculo. Tiro o trocarte, dissociar a cânula do seu obturador e colocar o obturador na superfície estéril.</li>
	<li>Introduza a agulha de biópsia armada através da cânula. Introduza a agulha e a cânula através da incisão de pele no músculo. Avance a agulha para uma posição onde a ponta da agulha está no meio da cabeça longa do músculo tríceps.</li>
	<li>Solte a agulha de biópsia e em seguida puxe a agulha de biopsia juntamente com a cânula. Puxe a agulha de biopsia fora da cânula. Deixe a cânula na superfície estéril.</li>
	<li>Abra a agulha de biopsia puxando a mola com uma mão e segurando-o com o outro. Nota: A amostra se torna visível na ponta da agulha de biópsia.</li>
	<li>Com a ajuda de uma segunda pessoa, abra o tubo de amostra que contém a média da amostra. Use uma agulha hipodérmica de 19 G para remover o pedaço de músculo minúsculo da agulha de biópsia. Coloca a amostra de músculo no meio de amostragem. Fechar o tubo com a tampa de rosca e incline-o suavemente 2x para garantir que a amostra está flutuando no meio.</li>
	<li>O braço da agulha de biópsia. Pegue a cânula da superfície estéril e remonte a agulha de biopsia armados e a cânula. Introduza a agulha armada e a cânula através da incisão na pele como descrita anteriormente. Repita o procedimento de exemplo 2 – 3 x até aproximadamente 20 mg de tecido muscular é amostrado. Feche o tubo de amostragem. Gire suavemente o tubo 2 x para misturar os pedaços de músculo com o meio de amostragem.</li>
	<li>Enviar as amostras para o laboratório, a uma temperatura constante entre 4 a 8 ° C. Nota: O laboratório depois processa a amostra. O protocolo pode ser pausado aqui.</li>
	<li>O procedimento é bem tolerado e dor no lado de amostragem não é observado. No caso improvável da dor muscular observada no local de amostragem, administre tratamento analgésico adequado.</li>
</ol>2. tratamento das células
Nota: As células-tronco utilizadas neste estudo foram preparadas de acordo com o método descrito por Ceusters et al 7. o artigo também descreve a caracterização das células.
<ol><li>Começar por preparar o meio de cultura específico, DF20, adicionando-se 20% do calor-inativado fetal soro bovino, 5 mL de penicilina (1.000 UI/mL)-estreptomicina (10.000 µ g/mL) e 2,5 mL de anfotericina B (250 µ g/mL) para uma garrafa de 500 mL de um comercialmente disponível meio de cultura com glutamina e vermelho de fenol.</li>
	<li>Despeje a 150 µ l do meio de cultura DF20 em cada um dos 16 poços internos de um prato de 24-multi-bem. Despeje os restantes poços exteriores, 1 mL de tampão fosfato salino (PBS) [cloreto de potássio (200 mg/L), monofásico de fosfato de potássio (200 mg/L), cloreto de sódio (8.000 mg/L) e fosfato de potássio diphasic (2.160 mg/L)].</li>
	<li>Enxágue o músculo minúsculo pedaços 2x em PBS. Separá-los em pedaços muito pequenos, com a ajuda de um bisturi e uma pinça e coloque um pedaço pequeno (do tamanho da ponta da lâmina bisturi) em cada interno-16 bem do prato multi bem.</li>
	<li>Coloque o prato multi bem na incubadora mantida às seguintes condições: 5% de CO2, 37 ° C e 21% O2. Monitorar os poços cada dia sob um microscópio invertido e adicionar 50 µ l de DF20 se necessário para evitar que as células da secagem. Nota: Depois de aproximadamente 10 d, haverá suficiente células cultivadas a partir do explante para permitir o isolamento de células-tronco. O protocolo pode ser pausado aqui.</li>
	<li>Quando um halo de células é visível em torno do músculo explants, descarte o explante do tecido muscular. Separar as células usando 150 µ l de uma solução de tripsina contendo EDTA em cada poço: descartar o meio de cultura, enxágue as células com 1 mL de PBS, descartar a PBS e adicionar a solução de tripsina para um máximo de 10 min a 37 ° C. Adicionar o meio de cultura para parar a ação da tripsina, colher a suspensão de células e, em seguida, centrifugar a suspensão de eritrócitos a 200 x g durante 10 minutos a 37 ° C. Desprezar o sobrenadante e suspender o sedimento em uma solução salina equilibrada.</li>
	<li>Transfira a suspensão de células em um gradiente descontínuo de densidade de 3 camadas (15%, 25% e 35%). Centrifugar o tubo contendo a suspensão de células e a solução de gradiente descontínuo de densidade a 1.250 x g por 20 min a 25 ° C. Não use o freio da centrífuga. Observe as frações de células com diferentes densidades que aparecerão entre as diferentes camadas da solução gradiente descontínuo de densidade após a centrifugação.</li>
	<li>Continue a cultura com a fração entre 15% e 25%. Transfira para um tubo e lave-o com a solução salina equilibrada. Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 200 x g durante 10 minutos a 37 ° C. Desprezar o sobrenadante. Prossiga com a suspender o sedimento em 1 mL de DF20. Prefill um frasco de cultura de células, com uma superfície de 25 cm2, com 6 mL de DF20. Transferir as células para o frasco de cultura celular pré-carregadas e cultura-los em uma incubadora com as seguintes condições: 5% de CO2, 37° C e 21% O2. Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.</li>
	<li>Monitore as células todos os dias sob um microscópio invertido. Mudar o meio de cultura, se necessário (descartar o meio velho e adicionar 6 mL de meio de cultura de novo). Determine a confluência celular, observando as camadas de célula nos pratos de cultura, usando um microscópio óptico em uma ampliação predefinida. Estime a superfície do prato que é ocupado pelas células. Trabalho em uma ampliação microscópica fixa para cada observação ser capaz de avaliar a confluência. Quando as células ocupam 85% da superfície do prato, prosseguir com uma passagem das células.</li>
	<li>Quando as células são confluentes, desanexá-los usando uma solução de tripsina contendo EDTA com o mesmo protocolo, conforme descrito na etapa 2.4. Em seguida, centrifugar a suspensão de eritrócitos a 200 x g durante 10 minutos a 37 ° C. Desprezar o sobrenadante e proceder com a ressuspensão das células em 5 mL de DF20. Colocá-los em um frasco de cultura celular de 175 cm2 pré-carregadas com 25 mL de DF20. Coloque o frasco em uma incubadora com as seguintes condições: 5% de CO2, 37° C e 21% O2. Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.</li>
	<li>Monitore as células todos os dias sob um microscópio invertido. Mudar o meio, se necessário (descartar o meio velho e adicionar 30 mL de meio de novo). Quando as células são confluentes, desanexá-los usando do trypsin-EDTA, conforme descrito na etapa 2.4. Em seguida, centrifugar a suspensão de eritrócitos a 200 x g durante 10 minutos a 37 ° C. Desprezar o sobrenadante e suspender as células em 6 mL de DF20. Coloque 1 mL da suspensão celular em seis 175 cm2 frascos, cada um preenchido com 25 mL de DF20 e cultura-los a 37 ° C numa incubadora de CO2 (com 21% O2 e 5% CO2).</li>
	<li>Monitore as células todos os dias sob um microscópio invertido. Mudar o meio, se necessário (descartar o meio velho e adicionar 30 mL de meio de novo em cada balão). Quando as células são confluentes, desanexá-los usando do trypsin-EDTA, conforme descrito na etapa 2.5. Centrifugue os 3 x 200 x g durante 10 minutos a 37 ° C e descartar o sobrenadante em cada etapa.</li>
	<li>Conte as células com a ajuda de um Bürker contando a câmara e um microscópio de luz. Prepare uma suspensão celular de 10 milhões de células/mL de um meio específico de criopreservação.</li>
	<li>Congelação as doses terapêuticas de 1 x 107 células em 1 mL de meio de criopreservação e armazená-los na fase de vapor de nitrogênio líquido até sua utilização. Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.</li>
	<li>As células no frasco em gelo seco para utilização final do navio.</li>
</ol>3. injeção das células
Nota: São necessárias duas pessoas para realizar a injeção de células tronco.
<ol><li>Aquecer a suspensão de células progressivamente a temperatura ambiente. Aspire a suspensão em uma seringa de 2 mL.</li>
	<li>Sede o cavalo injetando detomidine 10 µ g/kg para a veia jugular com uma agulha hipodérmica de 19g. Espere por 5 min ver o efeito de sedação, que se torna visível pela posição de cabeça para baixo característica do cavalo.</li>
	<li>Clip de uma zona de 20 x 10 cm2 sobre a região da laringe esquerda do cavalo com uma tesoura, conforme mostrado na Figura 2. Em seguida, aplica um esfoliante cirúrgico de álcool e sabão de polyiodide à região recortada.</li>
	<li>Coloque um padrão flexível vídeo endoscópio pela narina esquerda do cavalo e faça-o avançar em direção a nasofaringe. Ajuste a posição do endoscópio até à obtenção de uma visão completa da cartilagem aritenoide e a epiglote. Mantenha o endoscópio nesta posição durante o procedimento e virar a tela do vídeo endoscópio para os operadores.</li>
	<li>Conecte a agulha de injeção/estimulação ao elétrodo negativo do estimulador de nervo. Manter as condições estéreis da agulha. Conecte o eletrodo positivo do estimulador de nervo para um patch do eletrodo, que está preso à área da pele cortada.</li>
	<li>Conectar a seringa contendo a suspensão de células para a linha de injecção e prefill o tubo para perseguir o ar do sistema. Lembre-se o volume do sistema e prepare uma seringa com o mesmo volume de solução salina estéril.</li>
	<li>Se não estão familiarizados com esta técnica, use um transdutor de ultrassom linear de 5 a 7 MHz desinfectados para visualizar as estruturas anatômicas da região de interesse. Use um ultra-som estéril acoplamento gel para aumentar a qualidade de imagem. Visualiza a laringe e os navios que são executados na região dorsal da laringe.</li>
	<li>Uma vez familiarizado com a anatomia da região, introduza a agulha de injeção/estimulação para o aspecto dorsolateral da laringe. Ao abordar o aspecto dorsolateral da laringe, iniciar o estimulador de nervo no modo de estimulação de 1 Hz, com uma corrente de 2 mA.</li>
	<li>Movimente suavemente a agulha em direção a posição do nervo laríngeo recorrente, enquanto observa a vista endoscópica na tela. Assim que o movimento de abdução da cartilagem aritenoide esquerdo é visível na tela do vídeo, reduza a corrente até que o movimento desaparece, mantendo a agulha no lugar.</li>
	<li>Identifica a posição ideal da agulha. Considere uma perda de resposta motora em 0.5 mA como a distância ideal do nervo. Quando os movimentos de cartilagem aritenoide persistirem em correntes inferiores a 0,4 mA, não injetar as células, pois isso pode resultar em uma injeção intraneuronal.</li>
	<li>Quando a perda de resposta motora em 0.5 mA é observada, injetar a suspensão de células contendo 107 células-tronco autólogas e liberar a linha de injeção com solução salina preparada na etapa 3.6. Isto vai injetar o resto da suspensão de células que permaneceu no tubo de injeção.</li>
	<li>Após a injeção das células, retire a agulha e o endoscópio.</li>
	<li>Deixe o cavalo recuperar da sedação. Nenhum tratamento adicional é necessário para o local da biopsia.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Este protocolo descreve o sucesso da aplicação de células-tronco autólogas músculo-derivado aos nervos laríngeos recorrentes em cavalos, usando uma abordagem orientada por estimulador de nervo. A colheita da amostra de microbiopsy o músculo, bem como o isolamento, cultura e caracterização das células tronco, têm sido descritos em detalhe antes, enquanto a injeção dessas células na proximidade de um nervo periférico é original. A electro-Localização do nervo com um estimulador de nervo elétrico tem servido para o presente estudo e foi usada para injetar células-tronco mesenquimais em proximidade directa com o nervo laríngeo recorrente. A resposta motora foi monitorada por vídeo endoscopia através da nasofaringe. Se, durante o processo de posicionamento da agulha, outros nervos foram estimulados, o movimento correspondente era visível na tela de endoscopia. Uma bem sucedida estimulação do nervo laríngeo recorrente caracterizava-se a abdução típica da cartilagem aritenoide. Em um cavalo, anestésico local foi injetado para induzir uma paralisia transitória da musculatura aritenoide. Embora a implantação bem sucedida das células na proximidade do nervo não foi testada especificamente no presente estudo, a electro-Localização do nervo e a injeção em uma baixa corrente provou que as células-tronco foram aplicadas perto do nervo. A proximidade da injectate ao nervo demonstrou-se ainda mais por um bem sucedido bloco motor induzido por uma injeção de anestésico local.
Os restantes cinco cavalos, o tempo desde a primeira estimulação até que a injeção de células-tronco bem sucedida variou de 3 a 12 min. cavalos foram ligeiramente sedados durante o procedimento, o que aumentou a sua conformidade com a estimulação elétrica. Nenhum dos cavalos apresentou reações adversas a qualquer momento, indicando que a duração da estimulação pode ser prolongada se necessário para obter a agulha bom posicionamento. Uma curva de aprendizagem deverá ser observado se o operador está usando esta técnica regularmente e em um maior número de cavalos com anatomia variada.
Cavalos, comumente, sofrem RLN, que é caracterizado por vários graus de paralisia da cartilagem aritenoide esquerda levando a sons respiratórios anormais e exercerem a intolerância. A histologia dos nervos afetados revela lesões típicas de neuropatia periférica16. Neuropatia periférica é um termo usado para descrever vários tipos de lesões de nervos periféricos, levando a sensações visuais, movimentos ou funções do órgão. As causas são altamente variáveis e podem incluir diabetes, deficiências de nutrientes, um tratamento com drogas específicas, uma lesão traumática, isquemia ou infecção, ou pode ser idiopática. Independente da causa, neuropatias periféricas compartilham sinais histopatológicos comuns, tais como degeneração Wallerian, axonopathy distal ou desmielinização segmentar. Tem sido demonstrado que a administração de células-tronco mesenquimais para danificado nervos periféricos pode ser benéfica para a sua regeneração; no entanto, os mecanismos subjacentes não são bem compreendidos. Tradicionalmente, nós acreditamos que as células-tronco mesenquimais só irá diferenciar em progenitores de adiposo, músculo, cartilagem e tecido ósseo, mas sob condições específicas, eles foram mostrados para diferenciar em miócitos17, astrócitos18 e microambiental células do sistema nervoso central19e periféricos19 . Durante uma cultura em vitro , uma exposição de neuropeptídeos favorecerá a diferenciação de células-tronco mesenquimais em células expressando marcadores neuronais21,22. Várias em vivo estudos têm demonstrado o efeito benéfico de células-tronco mesenquimais na regeneração do nervo e uma recuperação funcional em modelos do rato de lesão de nervo ciático10,23. Isso provavelmente é causado por condições ambientais favoráveis que contribuem para a diferenciação de células-tronco em células do tecido-específica24. Estudos futuros devem também investigar esta técnica de gestão de células pre-diferenciadas em cavalos RLN afetados.
O melhor de nosso conhecimento, este é o primeiro relatório que descreve o uso de um estimulador de nervo para localizar um nervo periférico para injetar um tratamento específico para ele. Outras patologias do nervo periférico em várias espécies, tais como dor neuropática, podem ser tratadas pela administração de células-tronco em proximidade com o nervo25,26. Estudos futuros devem testar o efeito desta técnica em pacientes clínicos e investigar o risco de migração e o potencial de diferenciação das células injetadas.

RLN é uma patologia comum das vias aéreas superiores em cavalos caracterizado por vários graus de paralisia aritenoide. O lado esquerdo da laringe é mais comumente afetado. A prevalência da doença pode chegar até 35% em determinadas populações de cavalo. Embora várias hipóteses tentaram explicar a etiologia e patogênese da doença, a causa exata da RLN permanece incerta. A patologia é descrita como um axonopathy distal do nervo laríngeo recorrente, com lesões de desmielinização, mas também algum grau de mielinogênese. Esta axonopathy leva a denervação dos músculos intrínsecos da laringe e atrofia concomitante1,2. Esta patologia é muitas vezes lentamente progressiva e pode levar a uma perda total do rapto aritenoide do lado afetado3.
Cavalos afetados emitem sons respiratórios anormais durante o exercício e, às vezes, mostram intolerância de exercício nos casos mais graves. O diagnóstico definitivo é feito pelo exame endoscópico em um cavalo não sedado em pé onde uma perda parcial ou total de abdução da laringe é observada1,2,4. Atualmente, o tratamento mais comum é laryngoplasty (também conhecido como "tie-back"), que às vezes está associada um ventriculo-cordectomia. Embora a taxa global de sucesso destas cirurgias é considerada tão bom para excelente5, complicações pós-operatórias são muito comuns. A complicação mais comum é uma perda gradual de abdução. Barnett et al . 6 relatou uma perda de pelo menos um grau de abdução dentro as primeiras seis semanas após a cirurgia em pelo menos 76% dos cavalos. Outras complicações, tais como falha de prótese, tossindo e contaminação das vias respiratórias, também são relatados5.
Células-tronco mesenquimais (MSCs) ter sido uma parte da medicina equina na pesquisa e na prática por mais de uma década, apesar de comprovada a estudos sobre a sua eficiência ainda são escassos. As duas fontes mais comumente exploradas de células-tronco mesenquimais adultas em cavalos são da medula óssea e tecido adiposo7. Ambas as técnicas de amostragem são relativamente invasivas e nem sempre leva a um número suficiente de células. Recentemente, Ceusters et al 7 descreveu a cultura de células-tronco derivadas de tecido muscular estriado, que é obtido por uma técnica menos invasiva de microbiopsy.
MSCs são capazes de auto-renovação, autogeração, multipotency e diferenciação7,8. Sua capacidade de se diferenciarem em todas as linhagens de mesoderme de cartilagem, osso, músculo e gordura está agora bem estabelecida9. No entanto, sob condições ambientais específicas, eles podem diferenciar em linhagens não-mesenquimais como neurônios, astrócitos e microambiental células do sistema nervoso periférico e da medula espinhal9,10. MSCs já foram usadas em neuropatia vários modelos10,11. Após uma administração sistêmica e local11, demonstrou-se sua capacidade de migrar para áreas do tecido nervoso degenerado e regenerar as células neurais. Além disso, as células de Schwann, como derivadas de MSCs podem recrutar os macrófagos para remover restos celulares e secretam fatores neurotróficos promover o crescimento axonal e mielinogênese9.
O objetivo deste estudo é descrever a técnica de uma injeção de guiadas estimulador de nervo de células-tronco autólogas músculo-derivado perto do nervo laríngeo recorrente esquerdo em cavalos saudáveis. Normalmente, um estimulador de nervo conectado a uma agulha de injeção é usado para electro-Localização de nervos periféricos a fim de aplicar anestésicos locais para aquela área12. Um impulso fraco corrente direta é fornecido na proximidade do nervo para induzir uma resposta motora. A capacidade de produzir esta resposta motora depende de vários parâmetros, tais como a área condutora da agulha, qualquer impedância do tecido, a corrente aplicada, a duração do pulso e a distância entre a agulha para o nervo. Agulhas do estimulador de nervo são projetadas para ter uma área condutora muito restritiva na ponta da agulha, enquanto o resto da agulha é isolado. Este projeto ajuda a localizar precisamente o nervo. Estimuladores de nervos modernos se adaptar a diferentes impedâncias de tecido e entregam a amperagem constante configurado na máquina. Além disso, a maioria das máquinas utilizam uma duração de pulso de 0,1 s, para que os parâmetros determinantes são a corrente aplicada e a distância para a agulha. A relação entre a distância de agulha-para-nervo e a corrente necessária para produzir uma resposta motora é descrita pela lei de Coulomb: E = kQ/r; onde E é a carga necessária estimulação, k é a constante de Coulomb, Q é a carga mínima necessária estimulação e r é a distância entre os dois eletrodos. A electro-Localização de nervos, a distância entre os dois eletrodos é considerada a distância de nervo agulha-para12. Carga elétrica dissipa-se seguindo a regra do quadrado inverso da distância de agulha-para-nervo13. Prática clínica tem mostrado que o motor do nervo estimulação em 0.5 mA é altamente correlacionada com o sucesso do bloqueio do nervo e que uma perda de sinal motor em correntes inferiores irá impedir o usuário de administrar injeções intraneuronal acidentais. O objetivo deste estudo é testar a viabilidade e a segurança desta técnica em um número limitado de cavalos. Se a viabilidade e a segurança dessa técnica são confirmadas, podem ser facilmente transferido para cavalos afetados. Além disso, equino RLN pode servir como modelo de neuropatia periférica degenerativa.

<table><tbody><tr><td>Detomidina (Domidina)&nbsp;</td><td>Dechra</td><td></td><td>vendido através da farmácia</td></tr><tr><td>Lidocaína (xilocaína)&nbsp;</td><td>Movianto</td><td></td><td>vendido através da farmácia</td></tr><tr><td>TOF Watch S (estimulador de nervo)</td> <td>Alsevia</td><td>79950161</td><td></td></tr><tr><td>TSK Starcut (agulha de biópsia)</td> <td>STSK laboratory</td><td>SAG - 14090C</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de eletroestimulação&nbsp;</td><td>Pajunk</td><td>001185-79</td><td></td></tr><tr><td>DMEM - F12 (meio de cultura)</td><td>Lonza</td><td>LO BE12-719F</td><td></td></tr><tr><td>FBS inativado por calor</td><td>Life technologies</td><td>10500</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Lonza</td><td>DE17-602E</td><td></td></tr><tr><td>Anfotericina B (Fungizone)</td><td>Lonza</td><td>17-836E</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Lonza</td><td>LO BE17-512F</td><td></td></tr><tr><td>Prato de 24 poços</td><td>múltiplos Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Life technologies</td><td>12604</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Lonza</td><td>LO BE10-508F</td><td></td></tr><tr><td>Percoll PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>17544502</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S8776</td><td></td></tr><tr><td>T-25 cm&sup2; frascos</td><td>Nunclon</td><td>136196</td><td></td></tr><tr><td>T-175 cm&sup2; frascos</td><td>Nunclon</td><td>178883</td><td></td></tr><tr><td>Cryostore CS5</td><td>Biolife solutions</td><td>205373</td><td></td></tr></tbody></table>

nervo guiadas estimulador injeção de células-tronco autólogas perto do nervo laríngeo recorrente esquerdo equina

Nerve Stimulator-guided Injection of Autologous Stem Cells Near the Equine Left Recurrent Laryngeal Nerve

Neuropatia laríngea recorrente (RLN) comumente afeta os cavalos e é caracterizada pela intolerância ao exercício e sons respiratória anormal. O nervo laríngeo recorrente mostra lesões de desmielinização. O benefício da aplicação de células-tronco para nervos desmielinizados tem sido demonstrado em vários modelos animais. O objetivo do estudo foi testar a viabilidade e a segurança de uma injeção peri-neuronal de autólogas músculo-derivados mesenquimais células-tronco para o nervo laríngeo recorrente esquerdo em cavalos saudáveis usando um estimulador de nervo elétrico.
Célula muscular-derivado de hastes são obtidos a partir de cinco cavalos de Standardbred saudáveis por amostragem 20 mg de tecido muscular com uma agulha de biopsia de 14 G semi automática do músculo tríceps. Os movimentos da laringe são monitorados através de vídeo endoscopia superior-das vias respiratórias. O nervo laríngeo recorrente esquerdo é abordado com uma agulha de bloqueio do nervo isolado. Estimulação do nervo é aplicada, começando com 2 mA e o rapto de sucesso da esquerda aritenoide é monitorado. A intensidade de estimulação é reduzida progressivamente. Quando uma perda de resposta da motor é observada em 0,5 mA, 107 autólogo músculo-derivado tronco células são injetadas. Dois examinadores, que são cegos a ponto de tempo, marcam a função da laringe dos cavalos antes do tratamento e no dia 1, dia 7 e dia 28, após a injeção das células. Em um cavalo sexto, 1 mL de lidocaína a 2% é injetado para confirmar o correto posicionamento da agulha. Isto leva a uma paralisia temporária da cartilagem aritenoide à esquerda.
Este estudo prova que o nervo laríngeo recorrente pode ser abordado com a ajuda de um estimulador de nervo elétrica e que a estimulação elétrica do nervo é bem tolerado pelos cavalos. Nenhuma modificação da função da laringe foi observada em qualquer um dos cavalos após a injeção de células tronco. Mais estudos devem ser conduzidos para descrever os efeitos de uma injeção peri-neuronal de autólogas músculo-derivados mesenquimais células-tronco para cavalos sofrendo RLN.

A Comissão para o uso ético de animais da Universidade de Liège aprovado o protocolo de estudo. Seis cavalos do rebanho de cavalos de pesquisa no centro de investigação Equine Mont-le-Soie foram incluídos neste estudo. No primeiro o cavalo, o nervo laríngeo recorrente era localizado por eletroestimulação. A Figura 2 mostra a configuração usada, com a agulha de estimulação inserida o aspecto dorsolateral esquerdo da laringe do cavalo no estimulador de nervo. Quando a perda de movimento da cartilagem aritenoide é observada em 0,5 mA, 1 mL de lidocaína a 2% é injectada. Isto resultou em uma ausência de movimento em correntes mais elevados e uma paralisia transitória da aritenoide a esquerda. A endoscopia de controle, 24h depois, revelou uma recuperação completa da função aritenoide. O protocolo completo com sucesso foi repetido em cinco cavalos. Nenhum dos cavalos mostrou uma reação negativa para o músculo microbiopsy. Em todos os cavalos, um número suficiente de células foram cultivado no tempo definido. A endoscopia de via aérea superior foi realizada em todos os cinco cavalos e os escores de função laríngea de I ou II. 1 segundo Robinson et al . 14 foram determinados. Todos os cavalos tolerada a estimulação do nervo do nervo laríngeo recorrente muito bem. Nenhum efeito adverso foi observado durante ou após a estimulação ou a injeção de células tronco.
Todas as endoscopias foram gravadas e marcou por dois médicos cegos. Não houve diferença entre as pontuações de pre-injeção das funções da laringe e as pontuações obtidas no dia 1, 7 e 28 após a injeção de células-tronco, como testado por Wilcoxon rank análise15. A tabela 1 resume as pontuações da laringe de todos os cavalos em pontos de tempo diferentes, bem como o tempo desde a inserção da agulha para a injeção das células-tronco e a corrente que provocou o movimento aritenoide quando as células onde injetado.
As células que têm sido utilizadas no presente estudo foram preparadas de acordo com um protocolo previamente publicado7. As células de todas as frações foram capazes de diferenciação trilineage, expressaram CD90 e CD44, não expressar CD45 e MHC II e tinham capacidades de clonogenic. As células da fração de 15 – 25% foram escolhidas para processamento adicional porque eles mostraram a maior expressão da CD90 e a maior capacidade proliferativa.
O objetivo do presente estudo não foi testar a eficiência da aplicação de células-tronco para regenerar um danificado nervo periférico, mas apenas para testar a viabilidade do processo e para avaliar a segurança da injeção de células-tronco para o nervo laríngeo recorrente em um smal l número de cavalos saudáveis. A ausência de quaisquer alterações funcionais sobre a imagem endoscópica em cinco cavalos até 28 dias após a injeção e a ausência de quaisquer sinais clínicos em quatro dos cinco cavalos até 1 ano após a injeção confirma a viabilidade e a segurança do procedimento. Um cavalo teve que ser sacrificado, no período de seguimento, por razões não relacionadas com o estudo. Embora as técnicas provar para ser salvo em um pequeno número de cavalos, o número de cavalos incluídos no presente estudo é insuficiente para demonstrar a ausência de eventos raros.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Marcar antes da injeção</td>
			<td>Tempo de injeção (min)</td>
			<td>Corrente na injeção (mA)</td>
			<td>Placar no 1º dia pós injeção</td>
			<td>Placar no 7º dia pós injeção</td>
			<td>Placar no dia 28 post injeção</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cavalo 1 (Standardbred, égua, 16 anos de idade)</td>
			<td>II. 1</td>
			<td>12</td>
			<td>0,5</td>
			<td>Eu</td>
			<td>II. 1</td>
			<td>II. 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cavalo 2 (Standardbred, égua, 22 anos de idade)</td>
			<td>Eu</td>
			<td>3</td>
			<td>0.7</td>
			<td>Eu</td>
			<td>Eu</td>
			<td>Eu</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cavalo 3 (Standardbred, égua, 11 anos de idade)</td>
			<td>II. 1</td>
			<td>4</td>
			<td>0,5</td>
			<td>II. 2</td>
			<td>II. 1</td>
			<td>II. 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cavalo 4 (Standardbred, égua, 12 anos de idade)</td>
			<td>Eu</td>
			<td>7</td>
			<td>0,5</td>
			<td>Eu</td>
			<td>II. 1</td>
			<td>Eu</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cavalo 5 (Standardbred, égua, 10 anos de idade)</td>
			<td>Eu</td>
			<td>3</td>
			<td>0.7</td>
			<td>II. 1</td>
			<td>Eu</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: pontuações dos cavalos de função Signalment e laríngeas. Esta tabela mostra o tempo de injeção, a corrente mais baixa, provocando qualquer movimento aritenoide antes da injeção e as pontuações da laringe de cinco cavalos saudáveis antes e no dia 1, 7 e 28 após a injeção de autólogos músculo-derivados mesenquimais células-tronco em proximidade com o nervo laríngeo recorrente esquerdo. Cavalo #5 não estava disponível para o controle no dia 28 após a injeção por razões não relacionado com este estudo. O golo de referir-se os escores descritos por Robinson et al . 14. aqui, marcar o que significa que os movimentos de ambas as cartilagens aritenoide foram síncrono e simétrico, e uma completa abdução de ambas as cartilagens aritenoide poderia ser obtida e mantida. Pontuação II. 1 significa que os movimentos de cartilagens aritenoide eram assíncronos ou podem ser assimétricos em determinados momentos; no entanto, um sequestro completo de ambas as cartilagens aritenoide pode ser obtido e mantido.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58023/58023fig2.jpg"> Figura 2 : Configuração durante a injeção de células tronco. A agulha de estimulação do nervo é introduzida no lado esquerdo da laringe e direcionada para o nervo laríngeo recorrente esquerdo. O estimulador de nervo é fixado em 0,8 mA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58023/58023fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Aqui, apresentamos um protocolo para injetar autólogas músculo-derivado células-tronco em proximidade com o nervo laríngeo recorrente, com a ajuda de um estimulador de nervo elétrico. Esta nova técnica pode tornar-se útil para o tratamento da neuropatia laríngeo recorrente equina.

Nervo guiadas estimulador injeção de células-tronco autólogas perto do nervo laríngeo recorrente esquerdo equina

Recurrent laryngeal neuropathy (RLN) commonly affects horses and is characterized by abnormal respiratory sounds and exercise intolerance. The recurrent ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre o tratamento baseado em células-tronco de neuropatias periféricas, particularmente para neuropatia laríngea recorrente equina. As principais vantagens dessa técnica são que a colheita de células-tronco é minimamente invasiva, e que o método de injeção também pode ser transferido para outras neuropatias periféricas. As implicações dessa técnica se estendem a outros estudos de outros tipos de células, já que as células-tronco podem ser diferenciadas em outras células de interesse antes da injeção.A demonstração visual deste método é crítica, pois o controle endoscópico em vídeo dos movimentos laríngeos e a manipulação das técnicas estimuladoras nervosas podem ser difíceis de aprender. Identifique o local da amostra na cabeça longa do músculo tríceps por inspeção visual e palpação, cerca de linha média entre o ponto do cotovelo e o ponto do ombro. Use cortadores elétricos para raspar uma área de aproximadamente dois por dois centímetros, e aplique um esfoliante cirúrgico composto por sabão líquido de poli-iodeto e compressas de álcool por um minuto à pele exposta.Usando uma agulha de calibre 25, injete subcutâneamente um mililitro de solução de lidocaína de 2% no centro da área desinfetada. Depois de desinfetar com sabão antibacteriano limpo e vestir luvas estéreis, coloque uma agulha de biópsia semiautomática de calibre 14 em uma cortina estéril descartável e puxe o mecanismo de mola para armar a agulha. Monte uma cânula e obturador na posição trancada para formar um trochar, e introduza o trochar perpendicularmente através da pele dessensibilizada, aproximadamente 1,5 centímetros no tecido muscular subjacente.Em seguida, remova o trochar e coloque o obturador em uma cortina estéril. Introduza a agulha através da cânula. Em seguida, introduza a agulha e a cânula através da incisão da pele no músculo, até que a ponta da agulha esteja no meio da cabeça longa do músculo tríceps.Em seguida, solte a agulha de biópsia, puxe a agulha e a cânula para fora do músculo juntos, e remova a agulha da cânula. Puxe a mola com uma mão enquanto segura a agulha com a outra mão, até que o espécime se torne visível na ponta da agulha de biópsia. Com a ajuda de um assistente, abra um tubo de amostra contendo o meio amostral, e use uma agulha hipodérmica de calibre 19 para transferir a pequena peça muscular da agulha de biópsia para o meio amostral.Feche o tubo com a tampa do parafuso e incline suavemente o tubo duas vezes para garantir que a amostra esteja flutuando no meio. Em seguida, rearquivar a agulha de biópsia e reintroduzir a cânula através da incisão da pele para coletar mais duas a três amostras até que aproximadamente 20 miligramas de tecido muscular tenha sido adquirido. Para injetar as células, depois de aquecer a suspensão celular à temperatura ambiente, aspire um mililitro de células em uma seringa de dois mililitros e confirme que o cavalo está na posição de cabeça para baixo que é indicativo de sedação total.Em seguida, corte uma área de vinte por dez centímetros sobre a região laríngea esquerda, e aplique um esfoliante cirúrgico de sabão de poli-iodeto e álcool na região exposta. Coloque um endoscópio de vídeo padrão flexível através da nare esquerda do cavalo em direção à naofaringe, ajustando a posição do endoscópio até que uma visão completa das cartilagens aritóides e da epiglote seja obtida. Conecte a agulha de injeção de estimulação ao eletrodo negativo do estimulador nervoso.Conecte a seringa que contém a suspensão celular à linha de injeção e pré-encha o tubo para retirar o ar do sistema. Conecte o eletrodo positivo do estimulador nervoso a um patch de eletrodo que ficará preso à área da pele exposta. Carregue uma seringa com um volume de solução salina estéril igual ao volume pré-preenchido do tubo, e introduza a agulha de injeção de estimulação em direção ao aspecto dorsolateral da laringe, iniciando o estimulador nervoso no modo de estimulação hertz, com uma corrente de dois miliamperes ao se aproximar do aspecto lateral dorsal da laringe.Mova suavemente a agulha em direção ao nervo laríngeo recorrente. Assim que o movimento de abdução da cartilagem aritóide esquerda for visível, reduza a corrente, até que o movimento desapareça, mantendo a agulha no lugar. Quando for observada uma perda de resposta motora a 0,5 miliamperes, mantenha a posição da agulha e injete um mililitro das células-tronco autólogas, seguida por todo o volume de soro fisiológico pré-preparado.Mantenha a agulha em posição estável durante este processo, pois a distância aos nervos é controlada pelas correntes que produzem uma resposta motora e pequenos movimentos da agulha podem produzir uma perda repentina de resposta. Em seguida, remova a agulha e o endoscópio, e permita que o cavalo se recupere com monitoramento. Em estudos anteriores, não foram observadas reações adversas durante ou após a amostragem, nem qualquer inflamação foi observada durante ou após a estimulação ou a injeção das células-tronco.Além disso, não há diferenças entre os escores pré-injeção das funções laríngeas, e os escores obtidos nos dias um, sete e 28 após a injeção de células-tronco terem sido medidos. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o procedimento de coleta de células-tronco não é invasivo e permite a cultura de um grande número de células-tronco mesenquimais autólogas em um curto espaço de tempo. Após esse procedimento, outros métodos, como a injeção de células pré-diferenciadas, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre se as células Schwann são mais propensas a contribuir para a determinação dos nervos.Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da medicina regenerativa explorarem o uso de células-tronco na Neuropatia Laríngea Recorrente Equina.

nerve-stimulator-guided-injection-autologous-stem-cells-near-equine

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

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