Extração de DNA do elevado-throughput e genotipagem de larvas de Zebrafish 3dpf por Fin recorte

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo biomédico. Como o uso de peixe-zebra para gerar modelos genéticos de doenças. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a identificação precoce de genótipos usando um método simples de alto rendimento.

Embora esse método possa permitir uma extensa pesquisa usando modelos de peixe-zebra de epilepsias genéticas, ele também pode ser aplicado a outros modelos de doenças genéticas e a qualquer tipo de estudo de mutação. Geralmente, indivíduos novos neste método podem ter dificuldades, pois a transecção da barbatana larval deve ser realizada com precisão dentro da lacuna de pigmento da cauda. Antes de iniciar o corte das barbatanas das larvas do peixe-zebra, prepare a superfície de dissecação.

Cole um pedaço de fita de autoclave na superfície interna de uma tampa de placa de Petri de nove centímetros e posicione a tampa sob um microscópio estéreo. Prepare uma ponta de pipeta P1000 para acomodar uma larva de três dpf com estresse mínimo, cortando a extremidade da ponta da pipeta com um diâmetro de dois milímetros. Coloque três a cinco dias após a fertilização, ou dpf, larvas de peixe-zebra em uma placa de Petri e anestesiar em tricaína 1,5 milimolar em meio embrionário 1x E3.

Usando a micropipeta P1000 modificada, pegue e anestesie a larva do peixe-zebra e coloque-a na fita de autoclave posicionada na tampa da placa de Petri. Remova o excesso de solução de tricaína ao redor da larva. A área deve estar o mais seca possível para seccionar e pegar a barbatana com sucesso, mas ainda úmida para garantir a sobrevivência.

Para evitar sangramento e garantir a sobrevivência da larva durante a tosquia das barbatanas, a transecção deve ocorrer dentro da lacuna de pigmento. Distal ao limite da circulação sanguínea, conforme indicado nesta imagem. Trabalhando sob um microscópio estéreo, use um microbisturi para seccionar a barbatana caudal.

Durante a incisão, aplique uma pressão constante, mas suave, para baixo para evitar danificar a notocorda. Visualize a barbatana seccionada sob o microscópio e posicione a peça em cima da ponta da lâmina do micro bisturi. Coloque o microbisturi contendo a barbatana na superfície de um pequeno pedaço de papel de filtro.

Devido à presença de melanócitos no tecido seccionado, a barbatana aparece como uma pequena mancha preta. Para garantir a extração de DNA bem-sucedida, é importante que um ponto preto marcando a colocação da aleta seja observado no papel de filtro antes de continuar com o protocolo. Usando uma tesoura e uma pinça, transfira o papel de filtro contendo a aleta para um poço de uma placa de PCR de 96 poços contendo 25 microlitros de uma solução de hidróxido de sódio a 50 milimolares.

Em seguida, prepare uma placa de cultura de tecidos de fundo plano de 96 poços, numerando os poços de acordo com o rótulo da placa de PCR. Usando a pipeta P1000 modificada, preenchida com 200 microlitros de meio embrionário e3 fresco, colete cuidadosamente a larva do peixe-zebra usando uma leve pressão. Dispense a larva na placa de 96 poços no mesmo número de poços da placa de PCR.

Certifique-se de que o papel de filtro que contém a barbatana esteja bem submerso na solução. Para evitar a contaminação cruzada entre cada corte, limpe a lâmina do microbisturi e a pinça mergulhando em uma solução de etanol a 70%. Limpe a lâmina com um lenço de papel limpo ou limpe.

Quando todas as larvas tiverem sido cortadas, armazene-as na placa de 96 poços a 28 graus Celsius até que seus genótipos sejam identificados. Comece este procedimento selando a placa de PCR de 96 poços contendo os pedaços de aleta e centrifugando as amostras a 1000 vezes G por um minuto. Para certificar-se de que todos os papéis de filtro estão submersos na solução de hidróxido de sódio.

Para lise tecidual, aqueça as amostras em um termociclador a 95 graus Celsius por cinco minutos. Seguido de resfriamento a quatro graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, adicione seis microlitros de 500 milimolares tris-HCL pH8.0 a cada amostra.

Vórtice as amostras. Centrifugar brevemente a placa a 1500 vezes G durante cinco minutos à temperatura ambiente. Para extrair o DNA genômico usando este método, corte a aleta conforme demonstrado anteriormente, mas adicione o papel de filtro com a aleta cortada a um poço de uma placa de PCR de 96 poços contendo 30 microlitros de resina quelante a 5%.

Depois que todas as peças da aleta tiverem sido cortadas, sele a placa de PCR de 96 poços e centrifugue brevemente as amostras para garantir que todos os papéis de filtro estejam submersos com a resina quelante. Aqueça as amostras em um termociclador a 95 graus Celsius por 15 minutos, seguido de resfriamento a quatro graus Celsius por 10 minutos. Centrifugue brevemente as amostras para pellet as esferas de resina e obtenha o DNA na suspensão.

Um ensaio de PCR multiplex permitirá a discriminação entre mutantes homozigotos, heterozigotos e larvas do tipo selvagem. Configure a reação de PCR conforme detalhado no protocolo de texto. Execute as reações de PCR em termociclador de 96 poços.

Prepare um gel de agarose 1% em tampão de borato de sódio, corado com 1x gel vermelho. Para facilitar o processo, se possível, use um sistema de gel compatível com pipetas multicanal para permitir recursos de maior rendimento, reduzindo o tempo de carregamento de amostras. Execute o gel em 1x tampão de borato de sódio a 250 volts por 15 minutos.

Imagem do gel sob luz ultravioleta para permitir a discriminação dos diferentes genótipos. Inicie este ensaio preparando dois géis de poliacrilamida a 12% usando a placa espaçadora de 1,5 milímetro e os 15 pentes de amostra, conforme descrito no protocolo de texto. Use um sistema de eletroforese vertical e 1x tampão TBE como buffer de corrida.

Depois de realizar a PCR conforme descrito no protocolo de texto, aqueça os produtos de PCR a 94 graus Celsius por cinco minutos, seguido de resfriamento a quatro graus Celsius por 10 minutos. Carregue 10 microlitros por amostra de PCR e oito microlitros de marcador de peso molecular. Execute o gel a 150 volts por uma hora ou até que o marcador de peso molecular quase atinja a linha do pé da placa de vidro.

Imagem do gel sob luz ultravioleta para permitir a discriminação dos diferentes genótipos. Este protocolo foi utilizado para genotipar a prole de um cruzamento heterozigoto, no qual o ileal mutante possui uma inserção de 5 pares de bases no primeiro éxon de revestimento do gene aldh7a1. O resultado esperado da amplificação por PCR de ileais selvagens e mutantes é um amplicon de 434 BP.

Uma banda de 293 BP surge da amplificação do ileal mutante, e uma banda de 195 BP é obtida para o ileal do tipo selvagem. A análise das reações de PCR em um gel de borato de sódio a 1% de agarose identificou genótipos selvagens nas pistas dois e seis, genótipos heterozigotos nas pistas três, quatro e cinco e um genótipo mutante homozigoto na pista um. Várias mutações foram genotipadas por um ensaio de fusão heteroduplex.

Os ileais mutantes plpbpot101 e plpbpot102 do gene plpbp permitem uma mudança de quadro e um códon de parada precoce. Após a desnaturação e o recozimento, os fragmentos de PCR para animais heterozigotos conteriam DNA heteroduplex e homoduplex que são facilmente separados e visualizados usando eletroforeses em gel de poliacrilamida. Genótipos mutantes heterozigotos compostos foram identificados nas raias dois, quatro e oito, genótipos heterozigotos nas raias três, seis, sete, nove e dez, e um genótipo selvagem na raia cinco.

Uma vez dominado, o corte de barbatanas 96 larvas usando essa técnica pode ser feito em menos de uma hora, se executado corretamente. Após este procedimento, outros métodos, como o agrupamento de larvas de peixe-zebra do mesmo genótipo para extração de tecidos, podem ser realizados e ordenados para responder a perguntas adicionais, como investigação de biomarcadores e modelos de doenças. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisas no campo de modelos de epilepsia metabólica para explorar a fisiologia do caminho da doença em peixe-zebra.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como genotipar adequadamente larvas de peixe-zebra de três dias por microdissecção de uma barbatana caudal.