Imagem tridimensional em grande escala de organização celular no neocórtex Mouse
5 de setembro de 2018
Aqui descrevemos um procedimento para tecido limpando, etiquetando fluorescente e imagens em grande escala do tecido de cérebro de rato que, desse modo, permite a visualização da organização tridimensional de tipos de células no neocórtex.
Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurociência, como a análise da estrutura e da função do neocórtex. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode revelar a estrutura tridimensional em grande escala no cérebro. Embora esse método possa fornecer informações sobre o neocórtex, ele também pode ser aplicado a outros sistemas nervosos, como a medula espinhal.
Para injetar o marcador na ponte dos camundongos adultos, primeiro coloque um microlitro da subunidade B da toxina da cólera marcada com fluorescência em uma seringa Hamilton de calibre 26. Coloque uma bomba injetora na seringa e, em seguida, coloque a seringa e a bomba no porta-ferramentas de um manipulador em um instrumento estereotáxico. Incline o manipulador 12 graus posteriormente em relação ao eixo vertical.
Depois, coloque o mouse no instrumento estereotáxico. Usando uma lâmina de barbear, remova o cabelo para evitar infecções. Em seguida, corte 10 milímetros do couro cabeludo para que o bregma e o lambda fiquem visíveis.
Administre 0,1 mililitros de lidocaína a 1% usando uma pipeta. Defina o ângulo da cabeça ajustando a posição vertical do bocal no instrumento estereotáxico para que o bregma e o lambda tenham o mesmo nível Z. Em seguida, ajuste a posição do manipulador deslizando-o sobre o instrumento estereotáxico de modo que a ponta da seringa fique próxima ao bregma.
Registre a posição do manipulador. Retraia a seringa movendo o porta-ferramentas no manipulador. Em seguida, mova o manipulador 5,4 milímetros posteriormente e 0,4 milímetros lateralmente.
Avance a seringa de modo que a ponta fique próxima ao ponto de entrada no crânio, depois retraia a seringa e marque o ponto de entrada. Na posição marcada, faça um furo com um diâmetro de aproximadamente um milímetro. Insira a ponta da seringa através do orifício de modo que a profundidade da ponta seja 6,9 milímetros maior do que a medida no bregma.
Em seguida, injete um microlitro de traçadores usando a bomba a 0,2 microlitros por minuto. Após a injeção, retire a seringa do cérebro. Se necessário, cubra o cérebro exposto com pequenos fragmentos de hemostático microfibrilar e adesivo instantâneo.
Limpe o cérebro exposto com solução salina para prevenir infecções e suturar o couro cabeludo. Em seguida, remova o mouse do instrumento estereotáxico. Deixe o camundongo se recuperar da anestesia em uma incubadora a 30 graus Celsius por cerca de uma hora.
Não deixe o rato sem vigilância até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. Retorne o rato para a companhia de outros animais depois que ele estiver totalmente recuperado. Para coletar o tecido cerebral, corte o couro cabeludo usando uma tesoura para expor o crânio.
Em seguida, corte a linha média do crânio exposto usando uma tesoura. Em seguida, remova o crânio usando uma pinça. Se for necessário marcar a posição do bregma e lambda, primeiro remova um lado do crânio.
Em seguida, insira agulhas finas de tungstênio no cérebro nas posições do bregma e lambda e, em seguida, remova o crânio restante. Em seguida, coloque a amostra do cérebro na plataforma do vibratomo. Corte as seções de até 500 micrômetros de espessura em PBS em temperatura ambiente.
Neste procedimento, transfira as fatias para um tubo plástico de cinco mililitros contendo quatro mililitros de solução de escala S0. Em seguida, incube-os por 12 horas com agitação suave a 37 graus Celsius. Após 12 horas, remova a solução do tubo usando uma pipeta e adicione quatro mililitros de solução de escala A2.
Incube as fatias por 36 horas com agitação suave a 37 graus Celsius. Após 36 horas, remova a solução do tubo e adicione quatro mililitros de solução de escala B4. Incube as fatias por 24 horas com agitação suave a 37 graus Celsius.
Após 24 horas, remova a solução do tubo e adicione quatro mililitros de solução de escala A2. Incube as fatias por 12 horas agitando suavemente a 37 graus Celsius. Após 12 horas, remova a solução do tubo e adicione quatro mililitros de PBS.
Incube as fatias por seis horas agitando suavemente em temperatura ambiente. Em seguida, remova cuidadosamente as fatias para um tubo de plástico de dois mililitros. Incube-os com um anticorpo primário em um mililitro de solução de balança AB por 48 a 72 horas a 37 graus Celsius com agitação suave.
Depois, remova cuidadosamente as fatias para um tubo de plástico de cinco mililitros. Incube-os em quatro mililitros de solução AB Scale por duas horas, duas vezes em temperatura ambiente, agitando suavemente. Depois, remova cuidadosamente as fatias para um tubo de plástico de dois mililitros.
Incube com um anticorpo secundário marcado com fluorescência em um mililitro de solução AB Scale por 48 horas a 37 graus Celsius com agitação suave. Remova cuidadosamente as fatias para um tubo de plástico de cinco mililitros contendo quatro mililitros da solução de incrustação de anticorpos e incube as fatias por seis horas com agitação suave em temperatura ambiente. Remova a solução e adicione quatro mililitros da solução AB Scale e incube as fatias por duas horas, duas vezes com uma agitação suave em temperatura ambiente.
Em seguida, remova a solução e adicione quatro mililitros de 4% de PFA e incube as fatias por uma hora com agitação suave em temperatura ambiente. Em seguida, remova a solução e adicione quatro mililitros de PBS e incube as fatias por uma hora com agitação suave em temperatura ambiente. Remova a solução e adicione quatro mililitros da solução Scale S4 e incube as fatias por 12 horas com agitação suave a 37 graus Celsius.
Em seguida, coloque o espaçador em uma lâmina de vidro e coloque as fatias no espaçador e mergulhe as fatias na solução Scale S4. Sele o espaçador com uma lamínula. Coloque um pouco de água na lamínula e obtenha imagens das fatias usando microscopia confocal ou de dois fótons com uma objetiva de longa distância de trabalho de imersão em água.
Neste estudo, os neurônios de projeção cortical foram marcados em verde pela expressão de tdTomato em camundongos transgênicos Tlx3-cre AI9 e os neurônios de projeção subcerebral em magenta foram visualizados injetando o traçador retrógrado CTB488 na ponte às sete semanas de idade. Esta é a vista superior para mostrar as posições aproximadas das áreas corticais. Aqui estão as vistas oblíquas da fluorescência CTB488 mostrando neurônios de projeção subcerebral e fluorescência tdTomato mostrando neurônios de projeção cortical e esta é a imagem mesclada.
Os corpos celulares dos dois tipos de células eram visíveis em uma ampla gama de áreas cerebrais e as seções ópticas mostravam micro colunas periódicas. Esta imagem mostra os corpos celulares e dendritos apicais de neurônios de projeção subcerebral que expressam eGFP na seção óptica de um camundongo Crym-eGFP e esta imagem mostra as células que expressam parvalbumina marcadas em verde e neurônios de projeção subcerebral marcados em magenta injetando CTB488 na ponte de um camundongo C57 Black 6 pelo método de escala de anticorpos. Após este procedimento, outros métodos, como o processamento de imagens 3D, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a caracterização quantitativa da organização cerebral.
Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia cortical explorarem uma nova organização modular no cérebro de camundongos.
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Visão Geral
Este estudo descreve um protocolo detalhado para clareamento de tecidos, marcação fluorescente e imageamento em larga escala de tecido cerebral de camundongo. A metodologia permite aos pesquisadores visualizar a organização tridimensional dos tipos celulares na neocórtex, oferecendo insights valiosos sobre sua estrutura e função.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Imagem de Tecidos
- Marcação Fluorescente
Contexto
- A estrutura e a função da neocórtex são fundamentais na neurociência.
- Compreender a organização celular pode ajudar a responder perguntas-chave da pesquisa.
- Essa técnica pode ser estendida a outras regiões do sistema nervoso, como a medula espinhal.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver uma metodologia para a visualização aprimorada de estruturas cerebrais.
- Investigar a organização dos tipos celulares dentro da neocórtex.
- Fornecer uma estrutura aplicável a estudos mais amplos do sistema nervoso.
Métodos Utilizados
- Imagem em larga escala utilizando microscopia confocal ou de dois fótons.
- O modelo utilizado inclui camundongos adultos e regiões cerebrais específicas, como a ponte.
- O protocolo detalha os passos procedimentais para injeção de traçador e preparação do tecido.
- A incubação em soluções como Scale S0, A2, B4 e o uso de anticorpos fluorescentes foram etapas críticas.
Resultados Principais
- O método revela estruturas tridimensionais em larga escala em tecido cerebral de camundongo.
- Obteve-se a marcação específica de neurônios corticais de projeção e outros tipos celulares.
Conclusões
- Este estudo demonstra um método robusto para visualizar a organização neuronal.
- Os achados contribuem significativamente para a compreensão da estrutura neocortical e de sua função.
- A metodologia pode ser adaptada para diversas aplicações na pesquisa em neurociência.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Compreender a arquitetura celular tridimensional de tecidos complexos como a neocórtex auxilia na validação de alvos ao revelar a organização espacialmente resolvida de subtipos neuronais. Esse entendimento mecanicista permite reduzir os riscos de hipóteses terapêuticas por meio da visualização direta do engajamento do alvo e da organização em nível de rede em sistemas relevantes para a doença. O método fornece confiança preditiva em modelos pré-clínicos ao associar a organização anatômica a leituras funcionais.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio do mapeamento da organização microcolunar específica por tipo celular na neocórtex.
- Valor Operacional: Apoia a desmistificação biológica por meio da visualização direta de subtipos neuronais e suas relações espaciais.
- Valor Preditivo: Aumenta a confiança no alvo ao resolver módulos funcionais periódicos relevantes para os efeitos de fármacos em nível de rede.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para a padronização de ensaios subsequentes, preservando a arquitetura tridimensional do tecido.
- Valor Operacional: Permite fluxos de trabalho de imagem reprodutíveis por meio de protocolos padronizados de clareamento e marcação de tecidos.
- Escalabilidade: Facilita a reutilização da plataforma em diferentes regiões cerebrais e tecidos complexos por meio de varredura com estágio motorizado e objetivas de longa distância de trabalho.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Conecta as descobertas de insights organizacionais à validação pré-clínica por meio da modelagem de sistemas relevantes para a doença.
- Redução de Riscos Mecanicistas: Apoia decisões de avanço ajustadas a riscos mediante a visualização do engajamento do alvo em redes neurais distribuídas.
- Alinhamento de Biomarcadores: Permite a correlação entre fenótipos estruturais e saídas funcionais para o desenvolvimento translacional de biomarcadores.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se ao continuum de descoberta, desde a verificação da hipótese do alvo até a identificação de compostos promissores e a validação pré-clínica, fornecendo dados anatômicos quantitativos com resolução espacial.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias ao resolver a organização específica por tipo celular em tecido intacto.
- Triagem: Oferece prontidão para ensaios por meio de preparação reprodutível de tecidos e leituras quantitativas de fluorescência.
- Análises: Permite análise comparativa por meio de imagem tridimensional e contagem celular em diferentes condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Estabelece conexão com a continuidade pré-clínica ao preservar a arquitetura tecidual relevante para doenças em estudos longitudinais.
- Reutilização Empresarial: Funciona como uma plataforma de imagem reutilizável, aplicável a múltiplas regiões cerebrais e tecidos complexos além do neocórtex.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Fornece confiança preditiva na validação de alvos por meio da visualização direta da organização neuronal e da periodicidade microcolunar.
- Valor Operacional: Garante padronização e reprodutibilidade por meio de fluxos de trabalho definidos de clareamento, marcação e imagem de tecidos.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou não prosseguir ao reduzir ambiguidades mecanicistas em sistemas teciduais complexos.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco ao vincular fenótipos anatômicos a resultados funcionais em modelos de doenças.
Considerações sobre a Implementação
- Exige especialização em neurociência, preparo de tecidos e microscopia de fluorescência.
- Depende do acesso a microscópios confocais ou de dois fótons com objetivas de longa distância de trabalho e estágios motorizados.
- Necessita padronização entre equipes para protocolos de clareamento de tecidos, marcação com anticorpos e aquisição de imagens.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar o método a diferentes sistemas modelo, como medula espinhal ou tecidos humanos simulados.
- Limitado pelo tamanho do tecido e pela profundidade de penetração óptica, o que pode restringir a obtenção de imagens de amostras inteiras do cérebro sem seccionamento.
