Imagem tridimensional em grande escala de organização celular no neocórtex Mouse
September 5th, 2018
Aqui descrevemos um procedimento para tecido limpando, etiquetando fluorescente e imagens em grande escala do tecido de cérebro de rato que, desse modo, permite a visualização da organização tridimensional de tipos de células no neocórtex.
Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurociência, como a análise da estrutura e da função do neocórtex. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode revelar a estrutura tridimensional em grande escala no cérebro. Embora esse método possa fornecer informações sobre o neocórtex, ele também pode ser aplicado a outros sistemas nervosos, como a medula espinhal.
Para injetar o marcador na ponte dos camundongos adultos, primeiro coloque um microlitro da subunidade B da toxina da cólera marcada com fluorescência em uma seringa Hamilton de calibre 26. Coloque uma bomba injetora na seringa e, em seguida, coloque a seringa e a bomba no porta-ferramentas de um manipulador em um instrumento estereotáxico. Incline o manipulador 12 graus posteriormente em relação ao eixo vertical.
Depois, coloque o mouse no instrumento estereotáxico. Usando uma lâmina de barbear, remova o cabelo para evitar infecções. Em seguida, corte 10 milímetros do couro cabeludo para que o bregma e o lambda fiquem visíveis.
Administre 0,1 mililitros de lidocaína a 1% usando uma pipeta. Defina o ângulo da cabeça ajustando a posição vertical do bocal no instrumento estereotáxico para que o bregma e o lambda tenham o mesmo nível Z. Em seguida, ajuste a posição do manipulador deslizando-o sobre o instrumento estereotáxico de modo que a ponta da seringa fique próxima ao bregma.
Registre a posição do manipulador. Retraia a seringa movendo o porta-ferramentas no manipulador. Em seguida, mova o manipulador 5,4 milímetros posteriormente e 0,4 milímetros lateralmente.
Avance a seringa de modo que a ponta fique próxima ao ponto de entrada no crânio, depois retraia a seringa e marque o ponto de entrada. Na posição marcada, faça um furo com um diâmetro de aproximadamente um milímetro. Insira a ponta da seringa através do orifício de modo que a profundidade da ponta seja 6,9 milímetros maior do que a medida no bregma.
Em seguida, injete um microlitro de traçadores usando a bomba a 0,2 microlitros por minuto. Após a injeção, retire a seringa do cérebro. Se necessário, cubra o cérebro exposto com pequenos fragmentos de hemostático microfibrilar e adesivo instantâneo.
Limpe o cérebro exposto com solução salina para prevenir infecções e suturar o couro cabeludo. Em seguida, remova o mouse do instrumento estereotáxico. Deixe o camundongo se recuperar da anestesia em uma incubadora a 30 graus Celsius por cerca de uma hora.
Não deixe o rato sem vigilância até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. Retorne o rato para a companhia de outros animais depois que ele estiver totalmente recuperado. Para coletar o tecido cerebral, corte o couro cabeludo usando uma tesoura para expor o crânio.
Em seguida, corte a linha média do crânio exposto usando uma tesoura. Em seguida, remova o crânio usando uma pinça. Se for necessário marcar a posição do bregma e lambda, primeiro remova um lado do crânio.
Em seguida, insira agulhas finas de tungstênio no cérebro nas posições do bregma e lambda e, em seguida, remova o crânio restante. Em seguida, coloque a amostra do cérebro na plataforma do vibratomo. Corte as seções de até 500 micrômetros de espessura em PBS em temperatura ambiente.
Neste procedimento, transfira as fatias para um tubo plástico de cinco mililitros contendo quatro mililitros de solução de escala S0. Em seguida, incube-os por 12 horas com agitação suave a 37 graus Celsius. Após 12 horas, remova a solução do tubo usando uma pipeta e adicione quatro mililitros de solução de escala A2.
Incube as fatias por 36 horas com agitação suave a 37 graus Celsius. Após 36 horas, remova a solução do tubo e adicione quatro mililitros de solução de escala B4. Incube as fatias por 24 horas com agitação suave a 37 graus Celsius.
Após 24 horas, remova a solução do tubo e adicione quatro mililitros de solução de escala A2. Incube as fatias por 12 horas agitando suavemente a 37 graus Celsius. Após 12 horas, remova a solução do tubo e adicione quatro mililitros de PBS.
Incube as fatias por seis horas agitando suavemente em temperatura ambiente. Em seguida, remova cuidadosamente as fatias para um tubo de plástico de dois mililitros. Incube-os com um anticorpo primário em um mililitro de solução de balança AB por 48 a 72 horas a 37 graus Celsius com agitação suave.
Depois, remova cuidadosamente as fatias para um tubo de plástico de cinco mililitros. Incube-os em quatro mililitros de solução AB Scale por duas horas, duas vezes em temperatura ambiente, agitando suavemente. Depois, remova cuidadosamente as fatias para um tubo de plástico de dois mililitros.
Incube com um anticorpo secundário marcado com fluorescência em um mililitro de solução AB Scale por 48 horas a 37 graus Celsius com agitação suave. Remova cuidadosamente as fatias para um tubo de plástico de cinco mililitros contendo quatro mililitros da solução de incrustação de anticorpos e incube as fatias por seis horas com agitação suave em temperatura ambiente. Remova a solução e adicione quatro mililitros da solução AB Scale e incube as fatias por duas horas, duas vezes com uma agitação suave em temperatura ambiente.
Em seguida, remova a solução e adicione quatro mililitros de 4% de PFA e incube as fatias por uma hora com agitação suave em temperatura ambiente. Em seguida, remova a solução e adicione quatro mililitros de PBS e incube as fatias por uma hora com agitação suave em temperatura ambiente. Remova a solução e adicione quatro mililitros da solução Scale S4 e incube as fatias por 12 horas com agitação suave a 37 graus Celsius.
Em seguida, coloque o espaçador em uma lâmina de vidro e coloque as fatias no espaçador e mergulhe as fatias na solução Scale S4. Sele o espaçador com uma lamínula. Coloque um pouco de água na lamínula e obtenha imagens das fatias usando microscopia confocal ou de dois fótons com uma objetiva de longa distância de trabalho de imersão em água.
Neste estudo, os neurônios de projeção cortical foram marcados em verde pela expressão de tdTomato em camundongos transgênicos Tlx3-cre AI9 e os neurônios de projeção subcerebral em magenta foram visualizados injetando o traçador retrógrado CTB488 na ponte às sete semanas de idade. Esta é a vista superior para mostrar as posições aproximadas das áreas corticais. Aqui estão as vistas oblíquas da fluorescência CTB488 mostrando neurônios de projeção subcerebral e fluorescência tdTomato mostrando neurônios de projeção cortical e esta é a imagem mesclada.
Os corpos celulares dos dois tipos de células eram visíveis em uma ampla gama de áreas cerebrais e as seções ópticas mostravam micro colunas periódicas. Esta imagem mostra os corpos celulares e dendritos apicais de neurônios de projeção subcerebral que expressam eGFP na seção óptica de um camundongo Crym-eGFP e esta imagem mostra as células que expressam parvalbumina marcadas em verde e neurônios de projeção subcerebral marcados em magenta injetando CTB488 na ponte de um camundongo C57 Black 6 pelo método de escala de anticorpos. Após este procedimento, outros métodos, como o processamento de imagens 3D, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a caracterização quantitativa da organização cerebral.
Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia cortical explorarem uma nova organização modular no cérebro de camundongos.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Visão Geral
Este estudo descreve um protocolo detalhado para clarificação de tecido, marcação fluorescente e imagens em larga escala de tecido cerebral de camundongo. A metodologia permite aos pesquisadores visualizar a organização tridimensional dos tipos celulares no neocórtex, oferecendo valiosas percepções sobre sua estrutura e função.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Imagem de Tecidos
- Marcação Fluorescente
Fundo
- A estrutura e função do neocórtex são fundamentais na neurociência.
- Entender a organização celular pode ajudar a abordar questões-chave de pesquisa.
- Esta técnica pode ser estendida a outras regiões do sistema nervoso, como a medula espinhal.
Propósito do Estudo
- Desenvolver uma metodologia para visualização aprimorada de estruturas cerebrais.
- Investigar a organização de tipos celulares dentro do neocórtex.
- Fornecer uma estrutura aplicável a estudos mais amplos do sistema nervoso.
Métodos Usados
- Imagem em larga escala usando microscopia confocal ou bifotônica.
- O modelo usado inclui camundongos adultos e regiões cerebrais específicas como o ponte.
- O protocolo detalha etapas processuais para injeção de marcador e preparação de tecido.
- A incubação em soluções como Scale S0, A2, B4, e o uso de anticorpos fluorescentes foram etapas críticas.
Principais Resultados
- O método revela estruturas tridimensionais em larga escala no tecido cerebral de camundongo.
- A marcação específica de neurônios de projeção cortical e outros tipos celulares foi alcançada.
Conclusões
- Este estudo demonstra um método robusto para visualizar a organização neuronal.
- As descobertas contribuem significativamente para a compreensão da estrutura e função neocortical.
- A metodologia pode ser adaptada para diversas aplicações em pesquisa neurocientífica.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Understanding the three-dimensional cellular architecture of complex tissues like the neocortex supports target validation by revealing spatially resolved organization of neuronal subtypes. This mechanistic insight enables de-risking of therapeutic hypotheses through direct visualization of target engagement and network-level organization in disease-relevant systems. The method provides predictive confidence in preclinical models by linking anatomical organization to functional readouts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping cell-type-specific microcolumn organization in the neocortex.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct visualization of neuronal subtypes and their spatial relationships.
- Predictive Value: Enhances target confidence by resolving periodic functional modules relevant to network-level drug effects.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream assay standardization by preserving three-dimensional tissue architecture.
- Operational Value: Enables reproducible imaging workflows through standardized tissue clearing and labeling protocols.
- Scalability: Facilitates platform reuse across brain regions and complex tissues via motorized stage scanning and long-working-distance objectives.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage organization insights to preclinical validation through disease-relevant system modeling.
- Mechanistic De-risking: Supports risk-adjusted advancement decisions by visualizing target engagement across distributed neural networks.
- Biomarker Alignment: Enables correlation of structural phenotypes with functional outputs for translational biomarker development.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation by providing spatially resolved, quantitative anatomical data.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving cell-type-specific organization in intact tissue.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible tissue preparation and quantitative fluorescence readouts.
- Analytics: Enables comparative analysis via three-dimensional imaging and cell counting across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by preserving disease-relevant tissue architecture for longitudinal study.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable imaging platform applicable to multiple brain regions and complex tissues beyond the neocortex.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation through direct visualization of neuronal organization and microcolumn periodicity.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via defined tissue clearing, labeling, and imaging workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in complex tissue systems.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by linking anatomical phenotypes to functional outcomes in disease models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroscience, tissue preparation, and fluorescence microscopy.
- Depends on access to confocal or two-photon microscopes with large working distance objectives and motorized stages.
- Necessitates cross-team standardization for tissue clearing, antibody labeling, and imaging protocols.
- Involves adaptation considerations when applying the method to diverse model systems such as spinal cord or human tissue surrogates.
- Limited by tissue size and optical penetration depth, which may restrict imaging of whole-brain samples without sectioning.
