Azul de toluidina mancha de resina-incorporado seções para avaliação da morfologia do nervo periférico

Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da lesão e regeneração de nervos periféricos, como qual é a morfometria de um nervo periférico, quantos axônios estão presentes, qual é o estado de mielinização e há tecido fibrótico presente? A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a visualização em alta resolução das características nervosas. Comece colocando um rato anestesiado em decúbito ventral no topo de um tapete de dissecação.

Coloque um cone nasal para manter a anestesia com 1-2% de isoflurano. Para garantir a profundidade adequada da anestesia, testar os animais quanto à retirada do pé e reflexos palpebrais das patas traseiras. Uma vez alcançada uma profundidade adequada de anestesia, raspe os pelos dos membros posteriores e esterilize as áreas raspadas com etanol a 70%.

Palpe o fêmur para identificar o local adequado para a incisão. O fêmur está localizado apenas proximal ao segmento mais acessível do nervo ciático. Depois de fazer uma incisão de dois a três centímetros na pele ao longo do membro posterior, do joelho até o trocânter maior, localize o plano entre o músculo bíceps femoral e o músculo glúteo máximo.

Em seguida, use uma tesoura de microdissecção para separar a fáscia subjacente e expor dois a três centímetros do nervo ciático subjacente. Use um afastador para aumentar o espaço entre os dois músculos. Com pinças finas e tesouras de íris, separe cuidadosamente o nervo do tecido conjuntivo circundante, tomando muito cuidado para não comprimir ou cortar o nervo.

Em seguida, cubra o nervo exposto com o fixador de Trump e deixe descansar por 10 minutos. Se necessário, coloque gaze sob a perna traseira para melhorar o ângulo para que mais fixadores possam ser adicionados à cavidade. Remova o fixador após 10 minutos e repita esta etapa mais duas vezes.

Sob o microscópio de dissecação, corte o nervo ciático de ambos os lados usando uma tesoura de dissecção fina, certificando-se de não esticar ou beliscar o nervo. Coloque imediatamente as seções nervosas em tubos de 15 mL contendo o fixador de Trump e fixe a quatro graus Celsius por uma semana, trocando o fixador a cada 48 horas. Após a fixação, remova cuidadosamente qualquer gordura e tecidos conjuntivos remanescentes do nervo e use um bisturi afiado para cortar o nervo em segmentos de aproximadamente cinco milímetros de comprimento.

Os segmentos nervosos podem ser separados em diferentes tubos marcados. Mergulhe os segmentos nervosos em tetróxido de ósmio a 2% recém-preparado por duas horas. Usando um kit de incorporação de epóxi, prepare a mistura final de incorporação.

Misture o meio de inclusão de epóxi com solução de DDSA e misture o meio de inclusão de epóxi com solução NMA. Misture as duas soluções por pelo menos 20 minutos com um agitador magnético. Imediatamente antes da utilização, combinar o acelerador DPM com a solução B e, em seguida, combiná-lo com a solução A, de modo a que a proporção final do acelerador se situe entre um vírgula cinco e 2% do volume total.

Transfira os segmentos nervosos para tubos de um vírgula cinco mililitros e, após a lavagem com PBS, inicie o processo de desidratação substituindo o PBS por concentrações crescentes de acetona e água destilada por 10 minutos cada, depois em acetona a 100% três vezes por 10 minutos cada. Uma etapa crítica é a desidratação do tecido. Água e resina não interagirão, portanto, qualquer água restante no tecido não será infiltrada pela resina, deixando orifícios na seção desprovidos de qualidades histológicas.

Para infiltração de resina, primeiro coloque os segmentos nervosos em uma mistura individual de mistura de inclusão e acetona a 100% por 30 minutos. Após 30 minutos, transfira os segmentos para uma mistura de dois para um de mistura de incorporação e 100% de acetona por 30 minutos. Coloque os segmentos nervosos em moldes de borracha de silicone e adicione suavemente a resina sobre os nervos, certificando-se de cobrir todo o segmento do nervo, evitando bolhas de ar.

Deixe a resina polimerizar a 60 graus Celsius durante a noite. Coloque um bloco de resina com nervo embutido no suporte do ultramicrótomo com o lado trapezoidal voltado para cima. Ao visualizar através do escopo ultramicrotomático, use uma lâmina de um gume para aparar o excesso de resina ao redor do tecido nervoso.

Não penetre na superfície longitudinal do segmento nervoso, que é reconhecível por sua coloração escura por tetróxido de ósmio. Com uma faca de vidro simples no ultramicrótomo, faça várias seções transversais para expor uma superfície de seção transversal uniforme do nervo. Feito isso, mude para uma faca de vidro com o barco cheio de água destilada em temperatura ambiente e ajuste o ultramicrótomo para um a dois mícrons para cortar seções finas.

Use um laço de metal para transferir seções finas flutuantes do barco de faca de vidro para uma gota de água deionizada em uma lâmina de vidro. Outra etapa crítica é durante a transferência da seção fina da faca de vidro para a corrediça. Essas seções finas são muito frágeis e podem quebrar ou dobrar.

Após o corte, seque as seções nas lâminas passando uma lâmina sobre uma chama várias vezes, tomando cuidado para não superaquecer as seções. As lâminas podem ser armazenadas em temperatura ambiente por vários dias, se não forem imediatamente coradas com azul de toluidina. Para manchar as seções nervosas, use uma pipeta de plástico ou micropipetador para adicionar uma gota de solução de azul de toluidina na parte superior das seções nervosas.

Após 20 a 30 segundos, enxágue todo o excesso de solução de azul de toluidina mergulhando suavemente as lâminas em uma jarra de água deionizada, repetindo três a quatro vezes até que as seções estejam limpas. Seque as lâminas por pelo menos 15 minutos a 60 graus Celsius ou durante a noite em temperatura ambiente. Após a secagem, adicione um meio de montagem regular e cubra as seções com uma lamínula.

Finalmente, examine as seções montadas sob um microscópio de luz. Uma lente de imersão em óleo de 100X é recomendada para imagens detalhadas para calcular as proporções g. Cortes do nervo ciático embebidos em meio resinoso e corados com azul de toluidina mostraram imagens nítidas com resolução ideal para aumentar de 10X para 20X, 40X e 60X.

Este método preserva a estrutura nervosa e permite imagens de alta resolução e alta ampliação, o que facilita a medição de vários parâmetros, como a razão g, que é a razão entre o diâmetro do axônio, indicado pela seta rotulada B, e o diâmetro total da fibra, rotulado como A. Uma variedade de fatores pode levar a seções nervosas periféricas abaixo do ideal, incluindo a presença de rachaduras na seção devido ao manuseio inadequado do nervo. Buracos também podem ocorrer na seção devido à desidratação insuficiente. Outro possível erro no procedimento é o dobramento das seções, que pode ser remediado com o uso de alças inoculantes para transferência de seção para a lâmina de vidro.

Seguindo este procedimento, outros métodos, como a quantificação do axônio, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como qual é o grau de regeneração em um nervo regenerativo? Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como obter seções de nervos periféricos de um a dois mícrons para avaliar a morfometria do nervo.