Modelagem de microcircuito sináptica com Cocultures 3D de astrócitos e neurônios de células-tronco pluripotentes humanas

Este método pode ajudar a responder a questões-chave na neurociência sobre como a comunicação intercelular entre vários tipos de células neurais humanas contribui para a formação e função do circuito sináptico. Essa técnica gera rápida e sistematicamente esferas de cocultura tridimensionais de astrócitos e neurônios funcionalmente maduros a partir de células-tronco pluripotentes humanas. Estes podem ser utilizados para investigação experimental rigorosa.

A reprodutibilidade e escalabilidade deste protocolo é uma alternativa definida às tecnologias organoides emergentes. Eles se mostram promissores para o desenvolvimento de novos medicamentos e terapia de enxerto celular para promover a neurorregeneração após lesão ou doença. Comece colocando grupos de HPSCs em dois mililitros de meio HPSC contendo o inibidor de rho-quinase Y-27632 em cada poço de uma placa de seis poços revestida com ECM.

Mantenha as células-tronco até que estejam cerca de 50% confluentes e, em seguida, mude o meio para o meio neural contendo SB431542 e DMH1 para promover a indução neural. Quando as células estiverem cerca de 95% confluentes, divida cada poço de um a seis em novos poços revestidos com ECM. No dia 14, dissociar as células com solução de descolamento e transferir o conteúdo de cada poço para um frasco T25 não revestido com meio contendo Y-27632 para promover a formação de agregados.

Para gerar progenitores de astrócitos e astrócitos em agregados 3D formados espontaneamente, mude para o meio neural contendo EGF e FGF2 e alimente a cada três a quatro dias até que a identidade dos astrócitos seja confirmada em quatro a seis meses. Por padrão, este protocolo produz astrócitos corticais dorsais. No entanto, os subtipos de astrócitos podem ser especificados regionalmente pela adição de morfogênios padronizados, se desejado.

Uma vez por semana, quando aparecerem centros escuros, colete as esferas por centrifugação e, em seguida, dissocie suavemente os agregados H-astro com solução de desprendimento. Recoloque apenas as esferas que não se ligam espontaneamente para evitar a passagem de células não SNC e não neurais. Após quatro a seis meses de expansão, confirme a identidade celular no meio de congelamento e criopreservação de acordo com as instruções do fabricante ou use imediatamente para experimentação.

Para a geração de progenitores neuronais não transgênicos em neurônios, ou neurônios H, semeie progenitores neurais derivados de HPSC no dia 14 em placas de seis poços revestidas com ECM com dois mililitros de meio neural e Y-27632 por poço. Se estiver trabalhando com iNeurons induzíveis por doxiciclina, adicione meio neural contendo doxiciclina quando as células estiverem cerca de 35% confluentes para induzir a diferenciação e ativar a expressão gênica. Após dois dias, alimente linhagens transgênicas e não transgênicas com dois mililitros de meios neurais por poço por dia.

Continue até que as células estejam prontas para se levantar a 70% de confluência. Para coculturas, primeiro dissocie suavemente os H-astros dos agregados 3D com solução de desprendimento. Em seguida, prossiga para dissociar os neurônios H, ou iNeurons, de uma monocamada 2D.

Primeiro, remova o meio da placa de seis poços e adicione 500 microlitros de solução de descolamento a cada poço contendo culturas de monocamada. Incube a 37 graus Celsius por cinco minutos. Após a incubação, adicione suavemente dois a três mililitros de meio DMEM-F12 para remover as células ligadas.

Em seguida, recolher as células em meio num tubo cónico de 15 mililitros e centrifugar a 300 vezes G durante um minuto. Aspire o sobrenadante, adicione um mililitro de meio fresco e pipete para cima e para baixo suavemente com uma micropipeta de 1.000 microlitros para obter uma suspensão de célula única. Conte cada tipo de célula usando um hemocitômetro ou contador de células automatizado.

Adicione a proporção desejada de H-astros e neurônios H, ou iNeurons, dissociados em um volume total de dois mililitros para cada poço de uma microplaca. Centrifugue a placa a 100 vezes G por três minutos e retorne à incubadora por dois dias. Depois de um dia, microesferas densamente compactadas devem ter se formado na placa.

Use uma micropipeta de 1.000 microlitros para remover suavemente as esferas dos micropoços. Aplique levemente força no fundo de micro poços com meio para remover quaisquer esferas aderidas adicionais. Depois de coletar todas as esferas em um tubo cônico de 15 mililitros, deixe repousar.

Em seguida, lave as esferas aspirando primeiro o meio antigo e, em seguida, adicionando pelo menos dois mililitros de meio fresco. Adicione as esferas a um frasco giratório contendo 50 a 60 mililitros de meio. Colocar o balão na incubadora sobre uma placa de agitação magnética regulada para 60 RPM.

É necessário um mínimo de três semanas em cultura para a formação das sinapses. Comece revestindo a superfície de cada matriz de multieletrodos, ou MEA, com um mililitro de poliornitina para tornar a superfície hidrofílica e incube a 37 graus Celsius por um período mínimo de quatro horas. Após a incubação, remova a poliornitina e lave a superfície de cada MEA com água deionizada.

Em seguida, adicione um mililitro de matriz extracelular e retorne à incubadora por no mínimo quatro horas. Quando estiver pronto, remova a matriz extracelular e aplique as esferas em 1,5 mililitros de meio na superfície MEA, garantindo que as esferas estejam posicionadas no topo do feixe de eletrodos. Deixe aderir por dois dias.

Para medir a atividade elétrica das esferas neurais, coloque o MEA em um estágio de cabeça com temperatura controlada. Use um filtro passa-alta de cinco Hertz e um filtro passa-baixa de 200 Hertz e um limite de pico de cinco vezes o desvio padrão para registrar a atividade elétrica espontânea. Salve dados brutos, incluindo frequência e amplitude de pico para análise estatística.

Marcadores de proteínas restritas do tipo de célula neural, como MAP2 para neurônios e GFAP para astrócitos, demonstram visualmente o arranjo uniformemente disperso e a maturidade dos astrócitos em neurônios dentro de esferas 3D. Uma projeção máxima da morfologia e ramificação dos astrócitos é mostrada em uma esfera 3D representativa com H-astros esparsamente marcados com GFP ligada à membrana. H-astros maduros expressam marcadores, incluindo GFAP.

Embora os iNeurons expressem proteínas pré e pós-sinápticas, como mostrado na imagem à esquerda, a densidade sináptica é significativamente aumentada pela presença de H-astros e cocultura. Durante as gravações, esferas saudáveis de iNeurons colocadas em MEAs provocarão espontaneamente picos de tensão superiores a 40 microvolts com frequências de disparo consistentes. As esferas de cocultura exibem maior conectividade de rede com a presença de H-astros, resultando em um aumento de explosões de picos de rede síncrona.

Após este procedimento, outros métodos, como imagens de cálcio, podem ser realizados para medir a resposta fisiológica dos astrócitos à atividade sináptica. Além disso, o transplante em modelos animais pode ser realizado para investigar a conectividade com circuitos sinápticos preexistentes. Seguindo essa abordagem de bioengenharia, pode-se incorporar biomateriais extracelulares e tipos de células adicionais, como oligodendrócitos, microglianos e células etheliais em proporções específicas, a fim de modelar a sinalização complexa que ocorre no cérebro.