Name: Modelagem de microcircuito sináptica com Cocultures 3D de astrócitos e neurônios de células-tronco pluripotentes humanas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Aprenda a criar coculturas 3D de neurônios e astrócitos derivados de células-tronco pluripotentes humanas para modelar atividade de circuitos sinápticos. Este método reprodutível utiliza análise imunológica e gravações com multieletrodos.

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Gostaríamos de agradecer o contributo intelectual sobre o design desses procedimentos, Dr. Michael Ward (NIH) para aconselhamento técnico na diferenciação de iNeuron e Saba Barlas para análise preliminar de imagens Dr. Erik Uliano (UCSF).

Os autores não têm nada para divulgar.

Neste protocolo, descrevemos um método sistemático para a produção de esferas 3D de cocultures neurais. As esferas são compostas de astrócitos e neurônios, que são derivados independentemente de hPSCs. Embora não o foco do presente protocolo, a geração das populações puras de astrócitos de hPSCs28 é uma etapa crítica e pode ser tecnicamente desafiador se realizada sem experiência prévia. Este primeiro passo na geração destes microcircuitos sinápticos deve ser realizado com sincronismo meticuloso e...

Astrócitos são um tipo de célula glial altamente abundante no sistema nervoso central (SNC) com uma variedade de responsabilidades funcionais, além de suporte estrutural. Através da secreção de fatores solúveis synaptogenic e componentes da matriz extracelular (ECM), astrócitos ajudar no estabelecimento e clustering de sinapses maduras durante desenvolvimento1. Eles também desempenham um papel fundamental na manutenção da saúde e da plasticidade de sinapses a extracelular sinalização2,3,4,5e contribuam para a estabilidade a longo prazo de homeostático ambientes regulando o potássio extracelular e glutamato, bem como a secreção de substratos de energia e ATP6,7,8. Finalmente, eles podem contribuir para a neurotransmissão, influenciando as correntes extrasynaptic9e indiretamente podem influenciar a atividade através de outros tipos de células, tais como a promoção de mielinização10. Importante, porque a anomalia ou disfunção de astrócitos pode levar a muitas síndromes de desenvolvimento neurológico e neuropatologia adulta, há uma necessidade óbvia de incluem astrócitos ao lado de neurônios dentro engenharia redes neurais em ordem para uma melhoria modelo do ambiente endógeno do cérebro. Uma característica integral de astrócitos é sua capacidade de interações dinâmicas de forma com sinapses neuronais1,11,12. Na ausência da glia, os neurônios formam um número limitado de sinapses, que em geral também falta maturidade funcional13.
Astrócitos humanos apresentam características morfológicas, transcriptional e funcionais — tais como o aumento do tamanho e complexidade de ramificação, bem como espécie-específicos de genes — que não são recapitulada em roedores12,14, 15. Como resultado, estudos utilizando células-tronco pluripotentes humanas (hPSC)-células neurais derivadas tornam-se amplamente aceito como um meio de examinar doenças relacionadas com a CNS em vitro durante o desenvolvimento de novas terapias, lesão modelos e paradigmas de cultura16 ,17. Além disso, o hPSCs permite o estudo da formação humana sinapse e função sem a necessidade de tecido primário18,19.
Uma barreira à nossa compreensão de como vários tipos de células e sinais contribuem para a função sináptica circuito é a falta de modelos relevantes do cérebro humano. Há uma necessidade de uma plataforma adequada recapitular suas redes sinápticas com alta fidelidade e reprodutibilidade. Recentemente, o interesse surgiu na produção de sistemas de cultura 3D (amplamente conhecido como 'organoids', 'esferoides', ou 'mini cérebro')20 para modelar complexo tridimensional (3D) estruturas a nível celular e macro. Sistemas de cultura 3D retém ECM e célula-célula de interações que são normalmente ausente ou limitado durante coculture 2D típico paradigmas21,22. Uma abundância de técnicas existem para cultivo esferoides neural 3D23,24,25; no entanto, muitos exigem períodos longos de cultura (meses a anos) para o desenvolvimento espontâneo e preservação de camada, com o usuário, exibindo muito pouco controle sobre a saída.
Aqui, podemos ilustrar um método sistemático para rapidamente e consistentemente bioengineer neural interações entre vários tipos de células (neurônios pre-diferenciados e astrócitos) derivado de hPSCs pela montagem de células em cocultures de esfera (asteroides)26 que recapitular humanos específicas complexidades morfológicas em 3D. Este sistema neural de alta densidade gera uniformemente dispersa os subtipos neurais que assumir Propriedades maduras ao longo do tempo e podem ser exibidos ou analisados de uma forma de alta produtividade. Demonstramos pela primeira vez que humano astrócitos induzem atividade de explosão rede sináptica nestas cocultures 3D. Além disso, este protocolo é facilmente adaptável para gerar esferas de tamanhos diferentes, utilizam células especificadas para diferentes identidades regionais do SNC e estudar as interações de vários outros tipos de células, como desejado.

<table><tbody><tr><td>Placa de 6 poços</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos de 15 mL</td><td>Olympus Plastics</td><td>28-101</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma</td><td>A6964-100ML</td><td>Solução de desprendimento</td></tr><tr><td>Placa AggreWell</td><td>Stemcell Technologies</td><td>34850</td><td></td></tr><tr><td>Solução de enxágue antiaderente</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7010</td><td>Prevenir células adesão a placas de micropoços</td></tr><tr><td>Anti/anti</td><td>Thermofisher</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Thermofisher</td><td>17504044</td><td>Suplemento de mídia</td></tr><tr><td>Meio neuronal BrainPhys Stemcell</td><td>Technologies</td><td>5790</td><td>Alternativa de meio basal neurofisiológico</td></tr><tr><td>Lamínulas de vidro circular</td><td>Neuvitro</td><td>GG-12-oz</td><td></td></tr><tr><td>Cryostor CS10</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7930</td><td>Meio de criopreservação com 10% de DMSO DMEM</td></tr><tr><td>/F12</td><td>Thermofisher</td><td>10565-042</td><td>Com suplemento GlutaMAX</td></tr><tr><td>DMH-1</td><td>Stemcell Technologies</td><td>73634</td><td>PERIGO: Tóxico se ingerido. Concentração de trabalho: 2 &mu; </td></tr><tr><td>M Soro de burro</td><td>Lampire Biological Laboratories</td><td>7332100</td><td>Concentração de trabalho: 5% no tampão de bloqueio primário, 1% no tampão de bloqueio secundário</td></tr><tr><td>Cloridrato de doxiciclina (Dox)</td><td>Sigma</td><td>D3072-1ml</td><td>PERIGO: Tóxico para mulheres grávidas. Concentração de trabalho: 2 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Fator de crescimento epidérmico (EGF)</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>Concentração de trabalho: 10 ng/mL</td></tr><tr><td>Fator de crescimento de fibroblastos-2 (FGF)</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>Concentração de trabalho: 10 ng/mL</td></tr><tr><td>Solução de montagem Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de vidro</td><td>Fisherbrand</td><td>22-037-246</td><td></td></tr><tr><td>Soro</td> <td>de cabraLampire Biological Laboratories</td><td>7332500</td><td>Concentração de trabalho: 5% no tampão de bloqueio primário, 1% no tampão de bloqueio secundário</td></tr><tr><td>Hemacitômetro ou contador automático de células</td> Life <td>Technologies</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma</td><td>H3149-50KU</td><td>Concentração de trabalho: 2 mg/mL</td></tr><tr><td>Placa magnética</td><td>DLAB</td><td>8030170200</td><td></td></tr><tr><td>Matriz</td> <td>de membrana MatrigelSolução de revestimento Corning</td><td>354230</td><td>ECM. Concentração de trabalho: 80 &mu; g/ml. Prepare no gelo e certifique-se de que pipetas, tubos e meios sejam pré-resfriados.</td></tr><tr><td>MEA 2100 Sistemas</td><td>Multicanal</td><td>MEA2100</td><td></td></tr><tr><td>Solução</td><td></td><td></td><td></td>de montagem</tr><tr><td>N2</td><td>Thermofisher</td><td>17502048</td><td>Suplemento de mídia</td></tr><tr><td>OCT</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td>Solução de incorporação de tecido para crioseccionamento</td></tr><tr><td>Caneta de Papanicolau (Aqua Hold)</td><td>Laboratório de Dispositivos Científicos</td><td>9804-02</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído ( PFA)</td><td>Acros Organics</td><td>169650025</td><td>PERIGO: Tóxico se inalado. Concentração de trabalho: 4% em PBS</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>CA008-300</td><td></td></tr><tr><td>Poli-l-ornitina (PLO)</td><td>Sigma</td><td>P3655-100MG</td><td>Concentração de trabalho: 0,5 mg/mL</td></tr><tr><td>Lamínulas de vidro retangulares</td><td>Fisherfinest Premium Superslip</td><td>12-545-88</td><td></td></tr><tr><td>ReLeSR</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5872</td><td>Desprendimento e passagem reagente</td></tr><tr><td>Inibidor de Rho-Quinase Y27632- (Y)</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>Concentração de trabalho: 10 uM</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Stemcell Technologies</td><td>72234</td><td>Concentração de trabalho: 2 &mu; </td></tr><tr><td>Frascos giratórios</td><td>M Fisher Scientific</td><td>4500-125</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Fisher Chemical</td><td>S5-3</td><td>Concentração de trabalho: 20% ou 30% em PBS</td></tr><tr><td>T25 Frasco de cultura</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-207</td><td>Tampas ventiladas</td></tr><tr><td>T75 Frasco de cultura</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-209</td><td>Tampas ventiladas</td></tr><tr><td>Terg-A-zyme</td><td>Sigma</td><td>Z273287-1EA</td><td>Detergente. Concentração de trabalho: 1%</td></tr> <tr><td>de meio basal TeSR-E8</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5940</td><td>Meio de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC)</td></tr><tr><td>Suplementos TeSR-E8 Stemcell</td><td>Technologies</td><td>5940</td><td>Suplementos para meio de células-tronco pluripotentes</td></tr><tr><td>humanas TritonX-100</td><td>Sigma</td><td>X100-500ML</td><td>Detergente para permeabilização celular. Concentração de trabalho: 0,25% no tampão de bloqueio</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488</td><td>Thermofisher</td><td>A-11029</td><td>Anticorpo secundário</td></tr><tr><td>AlexaFluor 594</td><td>Thermofisher</td><td>A-11037</td><td>Anticorpo secundário</td></tr><tr><td>Ezrin</td><td>Thermofisher</td><td>MA5-13862</td><td>Anticorpo primário; astrócitos perissinápticos</td></tr><tr><td>GFAP</td><td>Chemicon</td><td>MAB360</td><td>Anticorpo primário; astrócitos</td></tr><tr><td>GFP</td><td>Aves</td><td>GFP-1020</td><td>Anticorpo primário; astrócitos</td></tr><tr><td>Glt1</td><td>Presente do Dr. Jeffrey Rothstein</td><td>n/a</td><td>Anticorpo primário; astrócitos</td></tr><tr><td>Homer</td><td>Synaptic Systems</td><td>160 011</td><td>Anticorpo primário; neurônios pós-sinápticos</td></tr><tr><td>MAP2</td><td>Sistemas sinápticos</td><td>188 004</td><td>Anticorpo primário; neurônios</td></tr><tr><td>PSD95</td><td>Abcam</td><td>ab2723</td><td>Anticorpo primário; neurônios pós-sinápticos</td></tr><tr><td>S100</td><td>Abcam</td><td>ab868</td><td>Anticorpo primário; astrócitos</td></tr><tr><td>Sinapsina 1</td><td>Sistemas sinápticos</td><td>106 103</td><td>Anticorpo primário; neurônios pré-sinápticos</td></tr><tr><td>TuJ1/&beta; 3-tubulina (TUBB3)</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td>Anticorpo primário; neurônios</td></tr></tbody></table>

modelagem de microcircuito sináptica com cocultures 3d de astrócitos e neurônios de células-tronco pluripotentes humanas

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Uma barreira à nossa compreensão de como vários tipos de células e sinais contribuem para a função sináptica circuito é a falta de modelos relevantes para o estudo do cérebro humano. Uma tecnologia emergente para abordar esta questão é o uso de três dimensões (3D) neural as culturas celulares, denominado 'organoids' ou 'esferoides', para a preservação de longo prazo das interações intercelulares incluindo moléculas de adesão extracelular. No entanto, estes sistemas de cultura são demoradas e não sistematicamente gerado. Aqui, detalhamos um método rapidamente e consistentemente produzir cocultures 3D dos neurônios e células-tronco astrócitos de pluripotentes humanas. Primeiros, pre-diferenciados astrócitos progenitores neuronais dissociadas e estão contados. Em seguida, as células são combinadas em esfera-formando pratos com um inibidor de Rho-quinase e em proporções específicas para produzir esferas de tamanho reprodutível. Após várias semanas de cultura como esferas flutuantes, cocultures ('asteroides') são finalmente seccionados por imunocoloração ou chapeados sobre matrizes multielectrode para medir a força e a densidade sináptica. Em geral, espera-se que este protocolo vai render 3D esferas neurais que exibir os marcadores de célula madura-tipo restringido, formam sinapses funcionais e apresentam atividade de explosão espontânea rede sináptica. Juntos, este sistema permite rastreio de drogas e investigações sobre os mecanismos da doença em um modelo mais adequado, em comparação com as culturas monocamada.

Quando executado corretamente, este protocolo irá produzir populações definidas de cocultures funcionais de astrócitos28,33,34 e neurônios35 gerados a partir de hPSCs (figura 1A-1C), como detalhados anteriormente26 e aqui descrito em passos 2.1 – 2.2. Este procedimento passo a passo, com o uso de placas...

Neste protocolo, nosso objetivo é descrever um método reprodutível para os neurônios de células-tronco derivadas de pluripotentes humanas combinando dissociado e astrócitos juntos em 3D sphere cocultures, mantendo estas esferas em condições de flutuação livre e, posteriormente medindo a atividade sináptica circuito das esferas com immunoanalysis e gravações de matriz multielectrode.

Modelagem de microcircuito sináptica com Cocultures 3D de astrócitos e neurônios de células-tronco pluripotentes humanas

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave na neurociência sobre como a comunicação intercelular entre vários tipos de células neurais humanas contribui para a formação e função do circuito sináptico. Essa técnica gera rápida e sistematicamente esferas de cocultura tridimensionais de astrócitos e neurônios funcionalmente maduros a partir de células-tronco pluripotentes humanas. Estes podem ser utilizados para investigação experimental rigorosa.A reprodutibilidade e escalabilidade deste protocolo é uma alternativa definida às tecnologias organoides emergentes. Eles se mostram promissores para o desenvolvimento de novos medicamentos e terapia de enxerto celular para promover a neurorregeneração após lesão ou doença. Comece colocando grupos de HPSCs em dois mililitros de meio HPSC contendo o inibidor de rho-quinase Y-27632 em cada poço de uma placa de seis poços revestida com ECM.Mantenha as células-tronco até que estejam cerca de 50% confluentes e, em seguida, mude o meio para o meio neural contendo SB431542 e DMH1 para promover a indução neural. Quando as células estiverem cerca de 95% confluentes, divida cada poço de um a seis em novos poços revestidos com ECM. No dia 14,

synaptic-microcircuit-modeling-with-3d-cocultures-astrocytes-neurons

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este vídeo demonstra o desenvolvimento de uma cultura neuronal 3D acoplada a uma matriz de microeletrodos planares com neurônios do hipocampo. Os neurônios isolados formam uma rede 2D na área ativa do conjunto de microeletrodos e aderem a microesferas de vidro em uma placa de vários poços com uma inserção de membrana. Ao transferir essas microesferas revestidas de neurônios para o eletrodo, elas se organizam em uma rede neural 3D interconectada.

Construindo redes neuronais tridimensionais acopladas a matrizes de microeletrodos

O vídeo demonstra um método para gerar astrosferas a partir de progenitores a partir de células-tronco pluripotentes humanas. Envolve o crescimento e proliferação de células-tronco com meios nutrientes contendo fatores de crescimento e inibidores de quinase. Essas células então se agregam e se diferenciam em astrócitos, formando astrosferas.

Geração e manutenção de astrosferas usando células-tronco pluripotentes humanas

Este vídeo demonstra um procedimento para co-cultivar os astrócitos e neurônios para formar esferas 3D. Essas esferas 3D fornecem uma plataforma distinta para examinar a formação de sinapses e a integração da rede neural, servindo assim como um modelo potencial para pesquisas em neurociência do desenvolvimento, doenças neurodegenerativas e intervenções neurofarmacológicas.

Gerando esferas de co-cultura 3D de astrócitos e neurônios para induzir a formação de sinapses

Este vídeo demonstra o procedimento de uso da matriz de multieletrodos (MEA) para medir a fisiologia sináptica em esferas de cocultura 3D. Este método permite entender a dinâmica da rede neural e a atividade de explosão da rede sináptica dentro das esferas 3D.

Utilizando matrizes de multieletrodos para medir a fisiologia sináptica em esferas de cocultura 3D

Este vídeo demonstra o estabelecimento de uma co-cultura neurônio-astrócitos para registrar a atividade da rede neuronal. Ao estabelecer a co-cultura de neurônios motores e astrócitos em uma placa multi-electrode array (MEA), a atividade elétrica rítmica síncrona da rede neuronal foi registrada extracelularmente usando o MEA.

Registro da Atividade Eletrofisiológica da Rede Neuronal em uma Co-cultura Neurônio-Astrócito

Um protocolo para gerar um sistema de co-cultura consistindo de neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), neurônios corticais primários e astrócitos é descrito. Este sistema de co-cultura permite a detecção da formação de contatos e circuitos sinápticos entre novos neurônios derivados de iPSC e neurônios corticais pré-existentes que expressam channelrhodopsina-2.

Uma Abordagem Optogenetic para Avaliar Formação das conexões neuronais em um sistema de co-cultura

Neste trabalho, um novo modelo experimental no qual culturas neuronais 3D são acopladas a matrizes planares de microeletrodos (MEAs) é presented. 3D redes são construídas semeando neurônios em um andaime composto de microesferas de vidro nas quais os neurônios crescem e formam estruturas 3D interconectadas.

Interface 3D Engineered culturas neuronais para Micro-Arrays eletrodo: An Innovative<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo Experimental

Nós modificar e implementar um protocolo publicado anteriormente descrevendo a diferenciação rápida, reprodutível e eficiente dos humanos pluripotentes induzidas (células-tronco hiPSCs) em neurônios corticais excitatórios 12. Especificamente, nossa modificação permite o controle da densidade de células neuronais e uso em matrizes de micro-eléctrodos para medir as propriedades eletrofisiológicas no nível da rede.

Rápido Neuronal diferenciação de células estaminais pluripotentes induzidas para medir a atividade de rede na Arrays Micro-eletrodo

Descrevemos um método para diferenciar astrócitos e neurônios derivados pluripotentes induzidos por humanos da medula espinhal e sua co-cultura para registro eletrofisiológico.

Estabelecimento de uma plataforma eletrofisiológica para modelagem da ELA com astrócitos e neurônios derivados de células-tronco pluripotentes humanas regionalmente específicas

Aqui, apresentamos um protocolo para produzir coculturas bioimpressas em 3D de neurônios e astrócitos derivados de iPSC. Este modelo de cocultura, gerado dentro de um arcabouço de hidrogel em formatos de 96 ou 384 poços, demonstra alta viabilidade pós-impressão e crescimento de neuritos em 7 dias e mostra a expressão de marcadores de maturidade para ambos os tipos celulares.

Bioimpressão Tridimensional de Coculturas Neurônio-Astrócitos Derivadas de iPSC Humanas para Aplicações de Triagem

Aprenda a criar coculturas 3D de neurônios e astrócitos derivados de células-tronco pluripotentes humanas para modelar atividade de circuitos sinápticos. Este método reprodutível utiliza análise imunológica e gravações com multieletrodos.

Modelagem de microcircuito sináptica com Cocultures 3D de astrócitos e neurônios de células-tronco pluripotentes humanas

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