Name: Monitoramento não destrutiva de desenvolvimento degradáveis baseados em andaime engenharia de tecidos dos vasos sanguíneos, usando a tomografia de coerência óptica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Aprenda a usar tomografia de coerência óptica para monitorar não destrutivamente a remodelação vascular e degradação de andaimes de PGA em engenharia de tecidos sanguíneos.

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1. degradáveis PGA andaime com base em engenharia de tecidos vasos cultura
<ol><li>Fabricação de andaime de PGA<ol>
<li>Costurar malha PGA (19 mm de diâmetro e 1 mm de espessura) em torno da tubulação do silicone esterilizada por óxido de etileno (17 cm de comprimento, diâmetro de 5,0 mm e 0,3 mm de espessura) usando sutura de 5-0.</li>
		<li>Costurar o politetrafluoroetileno (ePTFE, 1cm de comprimento) com 4-0 sutura em cada extremidade da malha de PGA e sobreposto por 2 mm.</li>
		<li>Mergulhe andaimes PGA com a mão no 1 mol/L do NaOH para 1 min para ajustar a estrutura espacial da malha e molhe com água de grau de cultura de tecidos três vezes por 2 min cada. Cada tempo... suavemente pat seco o andaime com um papel absorvente. Em seguida seca andaimes em uma capa com um ventilador por 1h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Montagem do biorreator e a junção-Y para a imagem latente OCT<ol>
<li>Mergulhe o auto-desenvolvimento vidro cilíndrico biorreator (10 cm de diâmetro e 11,7 cm de altura com quatro lábios dentro e quatro lado-braços para fora do reator, como mostrado na Figura 1), PGA andaimes, tubo de silicone (diâmetro externo de 5 mm, espessura 0,3 mm), biocompatíveis tubos, conectores, barra de agitação e equipamentos para montagem em um tanque de etanol 95% por 2 h.</li>
		<li>Andaime de PGA puxar pelo lado-braços de bioreator conectado a um lado com um conector, bem como um outro lado com a junção-Y costumava entregar OCT fio-guia. Monte outro andaime PGA em bioreator da mesma forma. Por favor, consulte a Figura 1.</li>
		<li>Caber aos lábios de biorreator de ePTFE apertando com suturas de 4-0.</li>
		<li>Colocar o biorreator no tanque de etanol novamente por 1h e secar durante a noite de capuz com ventilador.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Semeadura de HUASMCs e condicionamento de biorreator estático<ol>
<li>Isole o HUASMCs das artérias umbilicais humanas por técnicas padrão explante.</li>
		<li>Expandir e manter as células em meio de crescimento de células de músculo liso é composto por meio DMEM, 20% de soro fetal bovino, 2,36 mg/mL HEPES, penicilina de U/mL 100 G, 50 µ g/mL prolina, 20 alanina µ g/mL, 50 glicina µ g/mL, 1,5 µ g/mL CuSO4, ácido ascórbico de 50 µ g/mL , 10 ng/mL fator de crescimento fibroblástico básico e ng/mL 10 fator de crescimento derivado de plaquetas.</li>
		<li>Sementes HUASMCs na concentração de 5 × 106 células/mL em meio de cultura acima para os andaimes de PGA.</li>
		<li>Colocar uma celeuma bar (1,5 cm de comprimento) em bioreator. Inserir um tubo de alimentação (5 mm de diâmetro, 15 cm de comprimento) e três segmentos de tubo curto (5 mm de diâmetro, comprimento de 7 cm) para a troca gasosa através da tampa de rolha de silicone.</li>
		<li>Anexe filtros de 0,22 µm PTFE para cada tubo de mudança de ar e tampa de um heparina para o tubo de alimentação. Ajuste a barra de agitação com uma velocidade de agita de 13 tiros por minuto. Monte o biorreator de vidro, tampa de rolha de silicone e andaime PGA para o sistema de cultura.</li>
		<li>Permitir que HUASMCs aderir para 45 min, apoiando o biorreator cada 15 min com suporte, para a esquerda e direita. As portas de reator e articulações são seladas com película de parafina.</li>
		<li>Conectar o Luo-Ye bomba, saco do PBS, o driver com tubos biocompatíveis, como o sistema de perfusão. Abra a unidade para encher os tubos com PBS.</li>
		<li>Coloque o biorreator global numa incubadora umidificado com 5% CO2 a 37 ° C. Encha a câmara de cultura com 450 mL de meio de cultura de HUASMCs.</li>
		<li>Pressione o botão parar e desligar a energia do dispositivo rígido. Crescem os andaimes semeados sob cultura estática por uma semana.</li>
		<li>Altere o meio de cultura cada 3-4 dias, metade do meio velho através do tubo de alimentação e voltar a encher o reator com uma quantidade equivalente de meio de cultura fresco por aspiração.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação do sistema de perfusão para a imagem latente OCT<ol>
<li>Bomba de líquidos na bolsa PBS a circular por tubos biocompatíveis e voltar para o saco.</li>
		<li>Abra o poder do driver e regular o ajuste da bomba com uma frequência de 60 batimentos por minuto e saída de pressão sistólica de 120 mmHg. Ajuste os parâmetros mecânicos de acordo com as necessidades da cultura vascular engenharia de tecidos.</li>
		<li>Clique no botão Executar para funcionar o sistema de perfusão. Fornece a estimulação pulsátil fixa acima para os vasos por 3 semanas, iterativamente, pressurizando tubos biocompatíveis10,12 após 1 semana de cultura estática.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. realização de imagem óptica com OCT
<ol><li>Use uma fonte de luz para garantir a resolução axial de 10-20µm e a profundidade da imagem de 1-2 mm para identificar a estrutura de TEBV com base no domínio da frequência OCT intravascular de imagem sistema9.</li>
	<li>Ligue o interruptor de energia e abrir o software de captura de imagem.</li>
	<li>Conecte o cateter de imagem óptica de fibra para o controlador de motor de acionamento e óptico (DOC) com função de retirada automática do cateter.</li>
	<li>Definir parâmetros de taxa de aquisição de imagem para 10 quadros por segundo com uma velocidade de recuo automático de 10 mm/s.</li>
	<li>Fixe cateter de imagem Y-junção através do tampão de heparina com uma agulha de 18G.</li>
	<li>Coloque o cateter para dentro do tubo do silicone e identificar a tensão da sutura de malha PGA antes de carregar o andaime PGA para o biorreator.</li>
	<li>Coloque a ponta do cateter sobre a região de interesse. Ajuste o dispositivo de retração e verificar a qualidade de imagem8.</li>
	<li>Adquirir imagens em 1, 4, 7, 10, 14, 17, 21, 28 dias em cultura para cada TEBV individual e salvar sequencialmente com tempo real observação da microestrutura TEBV, incluindo morfologia superficial, estrutura interna e composição.</li>
	<li>Repita a medição por 3 vezes para obter a mensuração fiável dos navios projetados cada vez. Capture uma série de imagens durante todo o teste usando o software de captura de imagem.</li>
</ol>3. análise de imagem
<ol><li>Use o software de análise de imagem para medir a espessura de parede TEBV. Selecione a imagem a ser analisada. Clique na ferramenta de rastreamento para identificar o lado interno do TEBV pelo software automaticamente e esboçar manualmente o lado exterior. Um diagrama de espessura irá aparecer na tela.</li>
	<li>Repita a medição por 5 vezes obter uma medida confiável das construções. A análise de OCT foi realizada por dois investigadores independentes cegados para a informação obtida.</li>
</ol>4. colheita de TEBV e processamento de tecido
<ol><li>Abrir a tampa de rolha de silicone colocado sobre o biorreator quando a cultura for concluída e descartar o meio de cultura. Afrouxar dos lábios de biorreator de ePTFE e cortar os tubos de silicone do lado exterior da ePTFE com uma tesoura. TEBVs de bioreator de colheita e cortadas em seções para exame de microscopia eletrônica de varredura.</li>
	<li>Tirar o resto de TEBVs e corte em 4 µm seções espessas. Retire o suporte do tubo do silicone e corrigir as seções com paraformaldeído 4%. Execute rotina histológica coloração de Masson tricromo e Sirius vermelho para examinar a morfologia do colágeno e PGA10,13,14.</li>
	<li>Para avaliar o conteúdo do PGA e componente do colágeno, observe amostras histológicas com coloração de Sirius vermelho por um microscópio de polarização. Remanescentes de PGA são claramente demarcadas através de birrefringência e área remanescente pode ser quantificada com base na área de seção transversal10.</li>
</ol>

<ol><li>Chan-Park, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+control+of+vascular+smooth+muscle+cell+morphology+and+phenotype+for+functional+tissue-engineered+small-diameter+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">Biomimetic control of vascular smooth muscle cell morphology and phenotype for functional tissue-engineered small-diameter blood vessels.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 88, 1104-1121 (2009).</li>
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<li>Smith, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+imaging+methodologies+for+3D+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+%26+Technique%22%5BJournal%5D)">A comparison of imaging methodologies for 3D tissue engineering.</a> Microscopy Research & Technique. 73, 1123-1133 (2010).</li>
<li>Chang, W. G., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+short+discourse+on+vascular+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">A short discourse on vascular tissue engineering.</a> NPJ Regenerative Medicine. 2, (2017).</li>
<li>Appel, A. A., Anastasio, M. A., Larson, J. C., Brey, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+challenges+in+biomaterials+and+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Imaging challenges in biomaterials and tissue engineering.</a> Biomaterials. 34, 6615-6630 (2013).</li>
<li>Rice, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+characterization+of+structure+and+morphology+of+silk+fibroin+biomaterials+using+non-linear+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Non-invasive characterization of structure and morphology of silk fibroin biomaterials using non-linear microscopy.</a> Biomaterials. 29, 2015-2024 (2008).</li>
<li>Niklason, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enabling+tools+for+engineering+collagenous+tissues+integrating+bioreactors%2C+intravital+imaging%2C+and+biomechanical+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Enabling tools for engineering collagenous tissues integrating bioreactors, intravital imaging, and biomechanical modeling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 3335-3339 (2010).</li>
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<li>Gurjarpadhye, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+characterization+of+bioengineered+blood+vessels+within+a+bioreactor+using+free-space+and+catheter-based+OCT%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+Surgery+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Imaging and characterization of bioengineered blood vessels within a bioreactor using free-space and catheter-based OCT.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 45, 391-400 (2013).</li>
<li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+remodeling+and+structural+characterization+of+degradable+polymer+scaffold-based+tissue-engineered+vascular+grafts+using+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+%26+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">In vitro remodeling and structural characterization of degradable polymer scaffold-based tissue-engineered vascular grafts using optical coherence tomography.</a> Cell & Tissue Research. 370, 417-426 (2017).</li>
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<li>Ye, C., et al. <a target="_blank" href="https://scholar.google.com/scholar?hl=en&as_sdt=0%2C22&q=The+design+conception+and+realization+of+pulsatile+ventricular+assist+devices-from+Spiral-Vortex+pump+to+Luo-Ye+pump+&btnG=">The design conception and realization of pulsatile ventricular assist devices-from Spiral-Vortex pump to Luo-Ye pump.</a> Chinese Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 9, 35-40 (2002).</li>
<li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="https://scholar.google.com/scholar?hl=en&as_sdt=0%2C22&q=Application+of+optical+coherence+tomography+in+tissue+engineered+blood+vessel+culture+based+on+Luo-Ye+pump&btnG=">Application of optical coherence tomography in tissue engineered blood vessel culture based on Luo-Ye pump.</a> Chinese Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 31, 687-690 (2015).</li>
<li>Pickering, J. G., Boughner, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+the+age+of+fibrotic+lesions+using+polarized+light+microscopy+and+digital+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of the age of fibrotic lesions using polarized light microscopy and digital image analysis.</a> American Journal of Pathology. 138, 1225-1231 (1991).</li>
<li>Martinho, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependence+of+optical+attenuation+coefficient+and+mechanical+tension+of+irradiated+human+cartilage+measured+by+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Bank%22%5BJournal%5D)">Dependence of optical attenuation coefficient and mechanical tension of irradiated human cartilage measured by optical coherence tomography.</a> Cell Tissue Bank. 16, 47-53 (2015).</li>
<li>Poirierquinot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+1.5-Tesla+magnetic+resonance+imaging+for+tissue-engineered+constructs%3A+a+noninvasive+tool+to+assess+three-dimensional+scaffold+architecture+and+cell+seeding%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">High-resolution 1.5-Tesla magnetic resonance imaging for tissue-engineered constructs: a noninvasive tool to assess three-dimensional scaffold architecture and cell seeding.</a> Tissue Engineering Part C Methods. 16, 185-200 (2010).</li>
<li>Naito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+burst+pressure%3A+initial+evaluation+of+the+natural+history+of+the+biaxial+mechanical+properties+of+tissue-engineered+vascular+grafts+in+the+venous+circulation+using+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Beyond burst pressure: initial evaluation of the natural history of the biaxial mechanical properties of tissue-engineered vascular grafts in the venous circulation using a murine model.</a> Tissue Engineering Part A. 20, 346-355 (2014).</li>
<li>Smart, N., Dube, K. N., Riley, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+vessel+development+and+insight+towards+neovascular+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Clinical+and+Experimental+Pathology%22%5BJournal%5D)">Coronary vessel development and insight towards neovascular therapy.</a> International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 90, 262-283 (2009).</li>
</ol>

Os autores declaram que têm sem interesses financeiros concorrentes.

Para gerar engenharia vasos com estruturais e propriedades mecânicas semelhantes dos nativos de vasos sanguíneos podem levar a encurtar o tempo para uso clínico e é o objetivo final de engenharia vascular. Técnicas de imagem ópticas permitem a visualização da engenharia de tecidos vasculares componentes específicos, que não pode monitorar as construções individuais ao longo de enxertos de cultura e exposição a um ambiente de cultura sem comprometer a esterilidade7. Neste artigo, a câmara de cultur...

Engenharia de tecidos vasos sanguíneos (TEBVs) é o material mais promissor como um enxerto vascular ideal1. A fim desenvolver enxertos para ser clinicamente útil com propriedades estruturais e funcionais semelhantes como vasos nativos, várias técnicas foram projetadas para manter a função vascular2,3. Embora tenha havido navios projetados com perviedade aceitável durante a implantação e em estudo clínico de fase III4, cultura a longo prazo e alto custo também mostram a necessidade de acompanhamento do desenvolvimento de TEBVs. Compreensão dos processos de crescimento, remodelação e adaptação de matrix(ECM) extracelular em TEBVs no ambiente biomimético mecânica pode fornecer informações cruciais para o desenvolvimento da engenharia de tecido vascular.
A estratégia ideal para acompanhar o desenvolvimento da engenharia vasos de pequeno diâmetro5 deve ser não-destrutiva, estéril, longitudinal, tridimensional e quantitativa. TEBVs em condições de cultura diferentes puderam ser avaliadas por esta modalidade de imagem, mesmo incluindo alterações antes e após transplante vascular. São necessárias estratégias para descrever as características dos navios de vida projetada. Técnicas de imagem ópticas permitem a visualização e quantificação de deposição de tecidos e biomateriais. Outras vantagens são a possibilidade de habilitar tecidos profundos e sem etiqueta de imagem com alta resolução6,7. No entanto, as moléculas de imagem específicos e menos facilmente acessível equipamento óptico para monitoramento em tempo real é um obstáculo prático, que limitou a aplicação extensiva da microscopia óptica não-linear. Tomografia de coerência óptica (OCT) é uma abordagem óptica com intravascular modalidade de imagem como uma ferramenta clínica utilizado para orientar a terapia intervencionista cardíaca8. Na literatura, o método de outubro foi relatado como uma forma de avaliar a espessura da parede do TEBVs9,10, juntamente com a afirmativas modalidades de imagem para pesquisa de engenharia de tecido vascular. Considerando que, a dinâmica da engenharia vascular crescimento e remodelação não foi observada.
Neste manuscrito, detalhamos a preparação de biodegradáveis poliméricos baseados no cadafalso TEBVs para cultura de quatro semanas. Células de músculo liso vascular humano artérias umbilicais (HUASMCs) são expandidas e semeadas em andaimes de ácido (PGA) um poroso polyglycolic degradável em bioreator. Polímeros biodegradáveis desempenham o papel em um substrato temporário para a engenharia de tecidos e tem uma certa degradação taxa11. Para garantir uma correspondência adequada entre neo-tecido formação e degradação de andaime, andaimes de ECM e PGA são fatores cruciais para a remodelação vascular eficaz. O sistema de perfusão simula o microambiente biomecânico dos vasos nativos e mantém uma consistente deformação sob estimulação de pressão.
O objectivo do protocolo apresentado é para descrever uma estratégia relativamente simples e não-destrutiva para TEBVs de imagens e acompanhamento a longo prazo da cultura. Este protocolo pode ser utilizado para a visualização de alterações morfológicas e medições de espessura de navios projetados sob condições de cultura diferentes. Além disso, as análises de degradação de materiais baseados em polímero no tecido andaimes de engenharia podem ser realizadas para a identificação. Combinando métodos de varredura de elétrons microscopic(SEM) e polarizado microscópio usado neste protocolo, correlação e quantificação de distribuição da matriz extracelular e PGA degradação podem ser feitas, que pode facilitar a avaliação do andaime degradação combinado com imagens de OCT.

<table><tbody>Tubo de silicone <tr><td>Synthecon</td><td></td><td></td> <td>de malha PGA</td></tr><tr><td></td><td>Conector Cole Parmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema OCT intravascular</td><td>St. Jude Medical, Inc</td><td>ILUMIEN&trade; OPTIS&trade; SISTEMA</td><td></td></tr><tr><td>de varredura microscópica eletrônica</td><td>Philips</td><td>FEI Philips XL-30</td><td></td></tr><tr><td>microscópio polarizado</td><td>Olympus</td><td>Olympus BX51</td><td></td></tr><tr><td>suturas</td><td>Johnson & </td> Bomba pulsátil Johnson <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Guangdong Cardiovascular Institute</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LightLab Imaging software</td><td>St. Jude Medical, Inc</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

monitoramento não destrutiva de desenvolvimento degradáveis baseados em andaime engenharia de tecidos dos vasos sanguíneos, usando a tomografia de coerência óptica

Nondestructive Monitoring of Degradable Scaffold-Based Tissue-Engineered Blood Vessel Development Using Optical Coherence Tomography

Enxertos vasculares projetados com propriedades estruturais e mecânicas similares ao natural dos vasos sanguíneos são esperados para atender à crescente demanda para bypass arterial. Caracterização da dinâmica de crescimento e processo de remodelação de polímeros degradáveis baseados em andaime engenharia de tecidos dos vasos sanguíneos (TEBVs) com estimulação pulsátil são cruciais para a engenharia de tecido vascular. Técnicas de imagem ópticas destacam-se como poderosas ferramentas para monitorar a vascularização do tecido projetado, permitindo imagens de alta resolução em cultura em tempo real. Este artigo demonstra um rápido em tempo real e não destrutiva imaging estratégia para monitorar o crescimento e remodelação do TEBVs na cultura a longo prazo usando tomografia de coerência óptica (OCT). Morfologia geométrica é avaliada, incluindo o processo de remodelação vascular, espessura de parede e comparação da espessura TEBV em pontos de cultura diferente tempo e presença de estimulação pulsátil. Finalmente, a OCT fornece possibilidades práticas para observação em tempo real de degradação do polímero nos tecidos reconstrução sob estimulação pulsátil ou não e em cada segmento de navio, por em comparação com a avaliação do uso de degradação do polímero varredura de elétrons microscopic(SEM) e microscópio polarizado.

O sistema de cultura tridimensional consistiu de uma câmara de cultura em bioreator e o sistema de perfusão com um fluido de ciclo fechado10,13 (Figura 1). O cateter de imagem OCT foi inserido na extremidade distal da junção-Y e puxado para trás no tubo do silicone para a imagem latente. Imagem de OCT foi usada primeiramente para delinear a caracterização estrutural de biodegradáveis poliméricos TEBVs...

Um protocolo passo a passo para ensaios não destrutivos e longo período de acompanhamento do processo de remodelação vascular e degradação de andaime na cultura em tempo real de biodegradáveis poliméricos baseados em andaime engenharia de tecidos dos vasos sanguíneos com estimulação pulsátil usando a tomografia de coerência óptica é descrito aqui.

Monitoramento não destrutiva de desenvolvimento degradáveis baseados em andaime engenharia de tecidos dos vasos sanguíneos, usando a tomografia de coerência óptica

Engineered vascular grafts with structural and mechanical properties similar to natural blood vessels are expected to meet the growing demand for arterial ...

Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da engenharia de tecidos vasculares, como monitorar a dinâmica do crescimento vascular do engenheiro e remodelar durante a cultura de longo prazo. A principal vantagem do uso da tomografia de coerência óptica, ou OCT, é que é uma estratégia de imagem prontamente disponível, em tempo real e não destrutiva para caracterizar as características estruturais e o processo de remodelação dos vasos projetados. Demonstrando o procedimento também estarão Shangmin Liu, e Wentao Ma, técnicos do meu laboratório.Para iniciar este procedimento, forja o andaime PGA como descrito no protocolo de texto Dip PGA andaimes em um hidróxido de sódio mol-por litro por um minuto, para ajustar a estrutura espacial da malha. Em seguida, mergulhe os andaimes na água de grau de cultura tecidual três vezes por dois minutos cada. Cada vez, bata suavemente o andaime com um papel de tecido.Em seguida, seque os andaimes em um capô com um soprador por uma hora. Para montar o bioreator e a junção y para imagem OCT, primeiro, mergulhe o bioreator cilíndrico de vidro auto-desenvolvido, andaimes PGA, tubo de silicone, tubos biocompatíveis, conectores, barra de agitação e equipamentos para montagem em um tanque de etanol de 95% por duas horas. Puxe o andaime PGA através dos braços laterais do bioreator conectado a um lado com um conector, bem como para outro lado com a junção y usada para entregar o fio guia OCT.Monte outro andaime PGA no bioreator da mesma forma. Coloque o politetrafluoroetileno nos lábios bioreatores apertando-o com suturas 4-0. Coloque o bioreator no tanque de etanol novamente por uma hora antes de secá-lo durante a noite em um capô com o soprador ligado.Agora, isole as células musculares suaves da artéria umbilical humana das artérias umbilicais humanas por técnicas padrão de explanta Na causa de salvar as células em andaimes PGA, evite qualquer gotejamento de suspensão celular na parte inferior do bioreator. Além disso, cubra o bioreator com tampa de silicone-rolha o mais rápido possível após o assento da célula para evitar contaminação. Expanda e mantenha as células em meio de crescimento muscular suave.Semear as células musculares suaves da artéria umbilical humana a uma concentração de 5 milhões de células por mililitro no meio de cultura acima nos andaimes PGA. Depois de colocar uma barra de senhor no bioreator, cubra-a com a tampa da rolha de silicone que tem um tubo de alimentação e três segmentos de tubulação curto inseridos para troca de gás. Conecte filtros DE 0,22 mícrons PTFE a cada tubo de mudança de ar e conecte uma tampa de heparina ao tubo de alimentação.Ajuste a barra de mexida com uma velocidade de agitação de 13 rodadas por minuto. Em seguida, monte o bioreator de vidro, a tampa da rolha de silicone e o andaime PGA no sistema de cultura. Deixe as células aderirem por 45 minutos inclinando o bioreator a cada 15 minutos com um suporte para a esquerda e para a direita.Agora, conecte a bomba LOO-OH-YEE, saco salino tampão-fosfato e o motorista com os tubos biocompatíveis para criar o sistema de profusão. Abra o motorista para encher os tubos com PBS. Coloque o bioreator geral em uma incubadora umidificada com 5% de CO2 a 37 graus Celsius.Encha a câmara de cultura com 450 mililitros do meio cultural. Cresça os andaimes semeados sob cultura estática por uma semana, mudando o meio cultural a cada três ou quatro dias aspirando metade do antigo meio através do tubo de alimentação e reabastecendo o reator com uma quantidade equivalente de meio de cultura fresca. Para preparar o sistema de profusão para imagens de OCT, bombeie fluidos no saco PBS para circular através dos tubos biocompatíveis e de volta para o saco.Abra a potência do driver e regular a configuração da bomba com uma frequência de 60 batidas por minuto e uma pressão sistólica de saída de 120 milímetros de mercúrio. Ajuste os parâmetros mecânicos de acordo com as necessidades da cultura vascular de engenharia tecidual. Clique no botão executar para fazer o sistema de profusão funcionar.Forneça a simulação de pulsatil para os vasos durante três semanas, pressurizando iterativamente os tubos biocompatíveis após uma semana de cultura estática. Use uma fonte de luz para garantir a resolução axial de dez a vinte mícrons e a profundidade de imagem de um a dois milímetros para identificar a estrutura dos vasos sanguíneos projetados por tecido, ou TEVBs, com base no sistema de imagem intravascular oct de domínio de frequência. Ligue o interruptor de alimentação e abra o software de captura de imagem Conecte o cateter de imagem de fibra óptica ao motor de acionamento e ao controlador óptico, com a função de retirada automática do cateter.Defina os parâmetros da taxa de aquisição de imagens para dez quadros por segundo, com uma velocidade de pullback automático de dez milímetros por segundo. Agora, conecte o cateter de imagem à junção y através da tampa de heparina com uma agulha calibre 18. Coloque o cateter no tubo de silicone e identifique o aperto da estrutura da malha PGA antes de carregar o andaime PGA no bioreator.Agora, coloque a ponta do cateter sobre a região de interesse. Ajuste o dispositivo de pullback e verifique se há qualidade de imagem. Adquira imagens em um, quatro, sete, dez, 14, 17, 21 e 28 dias de cultura para cada TEBV individual.Salve essas imagens sequencialmente com uma observação em tempo real da microestrutura do TEBV, incluindo morfologia superficial, estrutura interna e composição. Repita a medição três vezes para obter uma medição confiável dos vasos projetados cada vez. Capture uma série de imagens ao longo dos testes usando o software de captura de imagem.Para usar o software de análise de imagem para medir a espessura da parede do vaso sanguíneo projetado por tecido, selecione primeiro a imagem a ser analisada. Em seguida, clique na ferramenta de rastreamento para identificar automaticamente o lado interno do vaso sanguíneo projetado por tecido com o software e esboce manualmente o lado externo. Um diagrama de espessura aparecerá na tela.Repita a medição por cinco vezes para obter uma medição confiável dos construtos. Considere usar dois investigadores independentes obrigados a obter informações. Abra a tampa da rolha de silicone colocada sobre o bioreator quando a cultura estiver terminada, e descarte o meio de cultura.Solte o politetrafluoroetileno dos lábios bioreatores e corte os tubos de silicone do lado externo do politetrafluoroetileno com uma tesoura. Colher as TEBVs do bioreator, e cortá-las em seções para um exame de microscopia de elétrons de varredura. Retire o tubo de silicone de suporte e conserte as seções com 4% de formaldeído de potência.Realizar coloração histológica de rotina com tricromo de masson e vermelho sirioso para examinar a morfologia do colágeno e da PGA. Para avaliar o conteúdo PGA e o componente de colágeno, observe amostras histólógicas com coloração vermelha siriosa através de um microscópio polarizado. As imagens de OCT são comparadas com achados histopatológicos de TEBVs após quatro semanas de cultura.A imagem de OCT mostra microestrutura compacta e componentes específicos em comparação com a avaliação histológica. O meio de cultura, o tubo de silicone, o TEBV e o fragmento PGA são visíveis. A coloração tricrômica de Masson demonstra fibras de colágeno distribuídas em uma determinada direção, juntamente com os remanescentes de PGA na camada de mídia dos vasos projetados.A coloração vermelha de Sirius revela remanescentes de PGA e um componente de colágeno usando um microscópio polarizado. Micrografias de elétrons de varredura de vasos projetados demonstram uma microestrutura compacta. Enquanto isso, essa modalidade de imagem intraluminal adota o monitoramento não destrutivo e fácil das TEBVs, incluindo o processo de remodelação e morfologia visual in-situ em cultura de longa duração.Como mostrado aqui, a remodelagem ocorre anteriormente e as alterações morfológicas se manifestam mais obviamente no grupo dinâmico através da comparação da espessura do TEBV. Essa técnica abre caminho para pesquisadores da área de engenharia de tecidos vasculares explorarem características estruturais e o processo de remodelação a longo prazo de embarcações projetadas. A exibição clara de remanescentes poliméricos por microscopia polarizada combinada com imagens OCT pode ser útil para avaliar a degradação do andaime.

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Bioengineering

Bioengenharia

Nosso grupo desenvolveu um sistema de cultura biorreator que imita as tensões pulsátil fisiológica do sistema cardiovascular para regenerar implantáveis ​​de pequeno diâmetro enxertos vasculares.

Engenharia Biológica Baseado em enxertos vasculares Usando um biorreator pulsátil

Source: &lt;a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove.com/v/59020/longitudinal-morphological-physiological-monitoring-three-dimensional'&gt;Huang, Y. et. al., Monitoramento morfológico e fisiológico longitudinal de esferoides tumorais tridimensionais usando tomografia de coerência óptica. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra o uso da tomografia de coerência óptica (OCT) para monitorar esferoides tumorais em uma placa de vários poços, capturando imagens transversais de alta...

Monitoramento morfológico e fisiológico de esferoides tumorais por meio de tomografia de coerência óptica 

A vascularização é essencial para abordagens de engenharia de tecidos bem sucedida. Portanto, tecnologias confiáveis ​​são necessários para avaliar o desenvolvimento de redes vasculares em tecido construções. Aqui apresentamos um método simples e de baixo custo para visualizar e quantificar a vascularização in vivo.

A pele completa Defeito Modelo Estudar a vascularização de Biomateriais<em&gt; In Vivo</em

Implantação de enxertos ósseos autólogos e alogênicos constituem aceite abordagens para tratar a maior perda óssea craniofacial. No entanto, o efeito da composição do enxerto sobre a interacção entre a neovascularização, a diferenciação celular e a formação de osso não é clara. Nós apresentamos um protocolo de imagiologia multimodal objetivou elucidar a interdependência angiogênese-osteogênese na proximidade do enxerto.

Tomografia Computadorizada e imageamento óptico de acoplamento Osteogenesis-angiogênese para avaliar a integração do osso craniano Autoenxertos e Aloenxertos

Aqui, apresentamos um protocolo para visualizar vasos sanguíneos formação em vivo e em tempo real em 3D andaimes por microscopia do multiphoton. Angiogênese em andaimes geneticamente modificados foi estudado em modelo murino raspagem de osso crítico defeito. Mais novos vasos sanguíneos foram detectados no grupo de tratamento do que em controles.

Visualizando a angiogênese por Multiphoton microscopia In Vivo no andaime de 3D-PLGA/nhập geneticamente modificado para raspagem crítico reparo de defeito ósseo

Descrevemos o uso da microscopia de coerência óptica de campo total como método para avaliação de alta qualidade do estroma doador de córnea. Esse protocolo pode ser utilizado para identificar características indicativas de saúde ou doença, e visa melhorar a triagem e seleção de tecidos doados e, consequentemente, os resultados da ceratoplastia.

Microscopia de coerência óptica de campo total para análise histológica de características estromais em enxertos de córnea

Tomografia de coerência óptica (OCT), uma tecnologia de imagem tridimensional, foi usada para monitorar e caracterizar a cinética de crescimento de esferoides tumor multicelulares. Precisa quantificação volumétrica de esferoides tumor usando um voxel contando a abordagem e deteção de tecido livre de rótulo morto nos esferoides baseado no contraste intrínseco atenuação óptica, foram demonstradas.

Longitudinal de morfológicas e fisiológicas, monitoramento de esferoides Tumor tridimensional usando a tomografia de coerência óptica

Os biofilmes microbianos formam arquiteturas complexas em interfases e se desenvolvem em padrões espaciais altamente dependentes de escala. Aqui, apresentamos um sistema experimental (Hard-e software) para a aquisição automatizada de conjuntos de dados de tomografia de coerência óptica 3D (OCT). Este conjunto de ferramentas permite a caracterização não invasiva e em várias escalas da morfogênese do biofilme no espaço e no tempo.

Tomografia de coerência óptica 3D automatizada para elucidar a morfogênese do biofilme sobre grandes escalas espaciais

Este artigo descreve um método para medir a reatividade da vasculatura da retina in vivo com indivíduos humanos usando uma técnica de provocação respiratória a gás para fornecer estímulos vasoativos ao adquirir imagens de retina.

Reatividade Vascular da Retina avaliada pela Angiografia de Tomografia de Coerência Óptica

Os tecidos projetados dependem fortemente de redes vasculares adequadas para fornecer nutrientes e gases vitais e remover resíduos metabólicos. Neste trabalho, um protocolo de semeadura passo a passo de células endoteliais e células de suporte cria redes vasculares altamente organizadas em uma plataforma de alta produtividade para estudar o desenvolvimento do comportamento da embarcação em um ambiente 3D controlado.

Semeadura de células stepwise em andaimes tesavendados para estudar vasos sanguíneos brotando

Aprenda a usar tomografia de coerência óptica para monitorar não destrutivamente a remodelação vascular e degradação de andaimes de PGA em engenharia de tecidos sanguíneos.

Monitoramento não destrutiva de desenvolvimento degradáveis baseados em andaime engenharia de tecidos dos vasos sanguíneos, usando a tomografia de coerência óptica (Vídeo) | JoVE Journal

Monitoramento não destrutiva de desenvolvimento degradáveis baseados em andaime engenharia de tecidos dos vasos sanguíneos, usando a tomografia de coerência óptica

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