Name: Biologia celular quantitativa de neurodegeneração em Drosophila , através de uma análise imparcial das proteínas fluorescente etiquetadas usando o ImageJ (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Aprenda análise de imagem semi-automatizada para quantificar agregados proteicos em modelos de Drosophila de neurodegeneração. Este método minimiza vieses e maximiza a reprodutibilidade em estudos de biologia celular.

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Este trabalho é apoiado pela Sheila e David Fuente neuropática dor programa de pós-graduação bolsa de pesquisa (para J.M.B.), a Lois Pope LIFE Fellows programa (de C.L., Y.Z. e J.M.B.), o Snyder-Robinson Foundation Fellowship Predoctoral (para CL), o Dr. John T . MacDonald Foundation (CL), contratos, subvenções de institutos nacionais de saúde (NIH) HHSN268201300038C, R21GM119018 e R56NS095893 (para R.G.Z.) e pelo projeto de estudioso de Taishan (província de Shandong, República Popular da China) (para R.G.Z.).

1. considerações e preparações para projetar o experimento de análise de imagem
<ol><li>Predeterminar celular anatômico, adequado ou subcellular marcadores para servir como pontos de referência para a padronização de uma região de interesse (ROI) em amostras diferentes, por exemplo 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), marcadores de membrana, fluorescentes localizadas proteína, etc.
</li>
	<li>Selecione um marcador fluorescente que pode delimitar a partitura discreta, além de níveis de plano de fundo para a estrutura de interesse. Nota: Este protocolo é otimizado para estruturas proteicas (por exemplo, agregados de misfolded proteínas) e membrana-limite organelles (por exemplo, repórter de autofagia). Para visualizar a agregação da proteína, um fragmento de RFP-tag N-terminal da proteína de Htt humana com um trato de patogenicidade polyQ de 138 repetições (RFP-hHttQ138) foi usado5. A proteína de Htt mutante forma citoplasmáticos agregados quando expressa sob neuronais drivers específicos, tais como DrosÃ-GAL45,6. Para visualizar o fluxo de autophagosome-lisossoma, Actina-GAL4 foi usado ubiquitously dirigir a expressão do repórter mCherry-GFP-Atg8a em tandem. partitura de GFP e mCherry --positivo indicar autophagosomes, e o fluxo é monitorado como fluorescência GFP é extinto o ambiente ácido do lisossomo, onde a diferenciação de ácido mCherry permanece até que a proteína é degradada7. Para análise de ratiometric, um único canal que é um marcador consistente da estrutura pode ser usado para segmentação, ou se for caso disso, que uma projeção de dois ou mais canais pode ser usada para delinear estruturas, embora não esteja explicitamente descrito neste protocolo. Neste exemplo, mCherry é usado para segmentação de partículas Atg8-positivo, pois é ácido-insensível e permanecerá no compartimento ao longo do fluxo através da via.</li>
	<li>Baixe e instale a plataforma de análise de imagem open source ImageJ ou Fiji — a distribuição preferencial do ImageJ com pacote de plugins2,3.</li>
	<li>Instale o plugin para bacias hidrográficas interativo h-maxima. Nota: Este protocolo usa Fiji; plugins adicionais podem ser necessários para ImageJ. O plug-in desenvolvido por Benoit Lombardot para SCF-MPI-CBG está disponível on-line (https://imagej.net/Interactive_Watershed).</li>
	<li>Navegue até "ajudar | Update", selecione"Gerenciar sites de atualização"do"atualizador do ImageJ", escolha o site de atualização do SCF-MPI-CBG da lista e então feche e reinicie o Fiji.</li>
</ol>2. dissecção e mancha da imunofluorescência no cérebro
<ol><li>
Fazer silicone elastômero-alinhado dissecação pratos.
	<ol>
<li>Despeje silicone componentes de elastômero uma proveta conforme indicado pelo fabricante e misture bem até que bem misturada.</li>
		<li>Usar uma pipeta para preencher 5cm pratos de cultura de tecidos de um terço a metade cheia (cerca de 10 mL da mistura de elastômero). Permitir que quaisquer bolhas subir para a superfície e remova cuidadosamente com papel absorvente. Cobrir os pratos e coloque-os sobre uma superfície plana para curar durante 48-72 h à temperatura ambiente (RT).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Disse o cérebro de Drosophila e sistema visual, se necessário.
	<ol>
<li>Execute Drosophila dissecação cerebral como descrito anteriormente8,9. Faz a dissecação em pratos de dissecação elastômero-alinhado, usando um fundo elastômero para estabilizar o cérebro para evitar danificar tecido ou fórceps.</li>
		<li>Para manter a lâmina intacta durante a dissecção, deslize duas pinças sob a retina e suavemente rasgar no meio do olho para remover a retina. Me afasto qualquer tecido retinal anexado a lâmina com pinças realizadas paralelas à superfície da lâmina. Nota: Pigmento Residual não vai sair nas etapas a seguir e geralmente não interfere com anticorpo imagem e coloração.</li>
		<li>Dilua o formol de 37% em tampão fosfato salino (PBS) para fazer uma concentração final de 3,7% fresco antes de usar em um tubo de microcentrifugadora de 500 µ l. Transferir o cérebro dissecado para tubo de microcentrifugadora com solução de correção e incube por 15 min em RT com balanço suave. Nota: O formol tem uma tendência natural para ser oxidado, produzindo ácido fórmico. Portanto, é sugerida a alíquota a 37% de formaldeído para armazenamento e diluir a 3,7% fresco antes de cada utilização. Fixação excessiva ou insuficiente fixação afetará a integridade do tecido e fluorescência10.</li>
		<li>Lavar 3 vezes com PBTx (PBS com 0,4% Triton X-100) por 15 min cada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Executar a imuno-histoquímica e montar espécimes.
	<ol>
<li>Se houver necessidade de anticorpos, remover PBTx, adicionar anticorpo primário diluído em PBTx com 5% de soro de cabra normal e incubar em um misturador alíquota durante a noite a 4 ° C.</li>
		<li>Remover o anticorpo primário e lavar 3 vezes com PBTx por 15 min cada. Adicione o anticorpo secundário diluído em PBTx com 5% de soro de cabra normal e incubar durante 1 h no RT ou durante a noite a 4 ° C. Lavar 3 vezes com PBTx por 15 min cada.</li>
		<li>Se houver necessidade de coloração de DAPI, remover PBTx, adicionar solução DAPI (solução: 5 mg/mL, diluir para uma concentração de trabalho de 15 µ g/mL em PBTx) e incubar durante 10 minutos a Wash RT. 3 vezes com PBTx por 15 min cada.</li>
		<li>Para limpar o tecido, coloque uma gota de meio de montagem sobre o centro de uma lâmina de microscopia com um espaçador de uma camada de fita transparente em ambos os lados. Transferir o cérebro para a gota de meio de montagem e esperar por 1 – 2 min até que o cérebro se torna transparente. Remova cuidadosamente o meio de montagem com uma pipeta.</li>
		<li>Para montar, aplica uma gota de meio de montagem fresco para o cérebro do slide. Cuidadosamente sobreposição de um vidro de tampa evitando bolhas. Selar as bordas com cola de borracha e deixe secar naturalmente em RT de 20 min. proceder à aquisição de imagem para obter melhores resultados.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. aquisição de imagem
<ol><li>Otimizar os parâmetros de aquisição de microscópio, incluindo a resolução espacial, objetivo, zoom, verificação de velocidade, e passo o tamanho, para maximizar a resolução das estruturas de interesse para facilitar a segmentação semi-automática durante a análise de imagem. Nota: Pode ser útil capturar uma imagem de amostra e testar segmentação semi-automática (na etapa 5 do presente protocolo) antes de todas as amostras experimentais de imagem. Desta forma, o usuário pode ajustar as configurações de imagem para que ferramentas analíticas prontamente podem discernir a estrutura biológica de interesse.</li>
	<li>
Ajuste os controles de detector de imagem para capturar a maior relação sinal-ruído e faixa dinâmica maior da amostra.
	<ol>
<li>Use uma LUT (veja tabela) que indica a saturação de pixel (exposição muito alta) ou undersaturation (deslocamento muito baixo) enquanto ajusta configurações (Figura 3B, vermelho indica saturação pixel por uma LUT Hi/Low).</li>
		<li>Verificar configurações de ganho e deslocamento são apropriadas para todos os grupos experimentais, como manipulações experimentais provavelmente alteram a estrutura de interesse. Nota: É imperativo que as mesmas configurações são usadas para todos os grupos para fazer comparações quantitativas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Imagem através do tecido para capturar todos os dados. Nota: É recomendável para capturar todos os dados disponíveis durante uma sessão de imagens e para definir uma área mais precisa durante a seleção do ROI na etapa 4, se necessário.</li>
	<li>Salve a imagem como o tipo de arquivo suportado pelo software de imagem para preservar os metadados como parâmetros de aquisição e calibração espacial. Salve a imagem com um nome de arquivo, incluindo anticorpos data, fundo genético e repórteres fluorescentes, experimentais, ou corantes, correspondente aos canais digitalizados como _Ch1 _ [data de experiência] [nome do Grupo Experimental] _ [nome do espécime]. [fluoróforo-alvo /Dye]_Ch2.[Fluorophore-Target/Dye], etc.
</li>
</ol>4. Fiji/ImageJ imagem importação e seleção de ROI
<ol><li>Abra uma imagem em Fiji. Use a caixa de diálogo "Opções de importação de Bio-formatos", escolha "pilha de exibição com: Hyperstack" e defina "modo de cor: em tons de cinza". Nota: Recomenda-se abrir este tipo de arquivo do microscópio, como metadados, tais como calibração espacial pode ser lido por Fiji.</li>
	<li>
Identifica uma área de um único plano z ou uma projeção baseada o canal (s) marcador que pode ser usado como um ROI padronizado através de amostras (Figura 1, seleção de ROI).
	<ol>
<li>Use a barra de rolagem de "C" para exibir o canal (s) usado para capturar o marker(s) designados no passo 1.1.</li>
		<li>Use a barra de rolagem de "Z" para percorrer os aviões focais. Escolher uma única fatia ou criar uma projeção de várias fatias, clicando em "imagem | Pilhas | Projeto Z"e definir"fatia de início"e"Stop fatia"para englobar o ROI. Nota: Definindo o tipo de "projeção" a "Intensidade de Max" no projeto"Z" caixa de diálogo é muitas vezes mais adequada para enfatizar a estruturas de segmentação na seção 5, embora isto pode não ser apropriado para todas as aplicações. Se outro tipo de projeção é necessário para análise, ter cuidado para salvar e documentar este arquivo como tal para a extração do recurso na seção 6 e/ou 7.</li>
		<li>Gere uma nova imagem que contém o canal (s) e focal ais de interesse para simplificar as etapas a seguir o protocolo de análise de imagem. Selecione "imagem | "Duplicado", definir o desejado "canais" (c) e "Fatias" (z) e alterar o nome de arquivo para refletir a seleção (por exemplo, _ _ [nome do espécime] de [nome do Grupo Experimental] [experiência date]_[Channel(s)]_[z-plane(s)]).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Use uma das ferramentas"seleção" na barra de Fiji para selecionar manualmente um ROI padronizado com base nos critérios de seleção determinados na etapa 4.2.</li>
	<li>Adicione o ROI com o gerente de ROI clicando em "Analyze | Ferramentas | ROI Manager "e clique em"Adicionar"no menu Gerenciador de ROI. Salve o ROI ROI Manager no menu clicando em "mais | Salvar"e nomeie o arquivo para refletir o ROI (por exemplo, [nome do Grupo Experimental] _ [nome do espécime] _ [data de experimento] _ [canal (s)] _ [z-ais] _ [Descrição de ROI]). Nota: Este pode ser reaberto em Fiji para análises posteriores ou pode ser aplicado a outros canais ou imagens como na seção 5.3.</li>
</ol>5. pré-processamento e segmentação com h-maxima Watershedding
<ol><li>
Execute de pré-processamento no canal usado para capturar as estruturas de interesse.
	<ol>
<li>Se o arquivo de imagem consiste em múltiplos canais, separar os canais, clicando em "imagem | Cor | Dividir canais"para isolar o canal de interesse.</li>
		<li>Aplicar um filtro, such as um filtro mediano para reduzir o ruído ou Desfoque Gaussiano para alisamento, clicando em "processo | Filtros | Filtro tipo"(por exemplo,"Filtro de mediana"ou"Gaussian Blur").<ol>
<li>Experimente diferentes filtros e filtrar parâmetros nas imagens de cada grupo experimental. Prossiga pelas passo 6.2 com um exemplo representativo de cada grupo para verificar o desempenho de segmentação. Selecione o filtro e configurações que facilitam a segmentação das estruturas de interesse.</li>
		</ol>
</li>
		<li>O filtro de registro e configurações. Aplica esses parâmetros através de grupos experimentais.</li>
		<li>Salve uma cópia da imagem como um arquivo tiff, incluindo o filtro aplicado para referência. Usar um nome detalhado como [nome do Grupo Experimental] _ [nome do espécime] _ [data de experimento] _ [canal] _ [z-ais] _ [filtro com parâmetros].</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Realize segmentação de estruturas de interesse com a ferramenta de bacias hidrográficas de h-maxima interativo na imagem pré-processado gerado e salvo na etapa 5.1.
	<ol>
<li>Com a imagem pré-processado ativa em Fiji, iniciar a ferramenta de bacias hidrográficas interativo h-maxima clicando "SCF | Rotulagem | H_Watershed interativo". Nota: Este plugin primeiro calcula a bacia hidrográfica e em seguida, permite que o usuário explorar os efeitos de máximos locais e opções de limiar na segmentação através de uma imagem de saída instantaneamente atualizado.</li>
		<li>No painel de controle, ajuste a dinâmica da semente (h), limiar de intensidade (T) e pico de inundações (%) para otimizar a segmentação. Nota: Sempre se referem a imagem raw antes de pré-processamento da seção 4.2 para inspecionar manualmente o desempenho da segmentação das estruturas de interesse.</li>
		<li>Quando estiver satisfeito com os resultados da segmentação, selecione "Exportar máscara regiões" e escolha "Exportar". Isso irá gerar uma imagem binária dos resultados bacia hidrográfica (Figura 1, segmentação).</li>
		<li>Gravar os parâmetros de segmentação; esses parâmetros devem ser aplicados através de grupos experimentais para comparações quantitativas. Salvar a máscara binária resultados se desejado para consultas com parâmetros de segmentação detalhados no nome como [nome do Grupo Experimental] _ [nome do espécime] _ [data de experimento] _ [Canais] _ [z-ais] _ [filtro com parâmetros] _ [parâmetros de H_Watershed].</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Extrai as estruturas de interesse dos resultados da bacia hidrográfica.
	<ol>
<li>Abra o ROI salvo de passo 4.4, no Gerenciador de ROI. Com a máscara de regiões binário da etapa 5.2.4 ativo, selecione o ROI do gerente do ROI para aplicar a imagem para limitar a extração de características para o ROI padronizada.</li>
		<li>Com o ROI ativo a máscara binária de bacias hidrográficas, escolher "Analyze | Analisar as partículas"com"Adicionar ao Gerenciador"selecionado na caixa de diálogo extrair características. Nota: Isto irá adicionar um identificador de partículas para cada estrutura delineado durante a segmentação para o Gerenciador de ROI. As opções estão disponíveis nesse menu para excluir recursos com base no tamanho ou forma circular se necessário para refinar estruturas incluídas na análise.</li>
		<li>Guarde as partículas clicando em "mais | Save"do menu do Gerenciador de ROI. Certifique-se que os identificadores serão desmarcados e todas as partículas serão todos salvos em um arquivo zip. Usar um nome detalhado como [nome do Grupo Experimental] _ [nome do espécime] _ [data de experimento] _ [Canais] _ [z-ais] _ [filtro com parâmetros] _ [parâmetros H_Watershed] _ [estruturas].</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. quantidade, área e intensidade de quantificação e análise
<ol><li>Abra a imagem raw gerado e salvo na etapa 4.2. Role para o canal usado para capturar as estruturas de interesse. Nota: É essencial para tirar medidas de intensidade de imagem raw (antes de pré-processamento) como a aplicação de filtros em mudanças de passo 5.1 os valores de pixel.</li>
	<li>Abra as partículas obtidas na etapa 5.3 extração e selecione "Mostrar tudo" do Gerenciador de ROI. Nota: Esta acção overlay um esboço de cada partícula no "ROI Manager" na imagem e deve coincidir com as bordas das estruturas de interesse (Figura 1, extração de características).</li>
	<li>Definir as medições desejadas clicando em "Analyze | Conjunto de medições". Nota: A área, intensidade e densidade de partículas podem ser medidos, escolhendo "área" e "densidade integrada". Quando é selecionada a densidade integrada, Fiji produzirá dois valores: 'Integrado densidade' calculada como o produto da área e valor de cinza médio e 'Raw integrado densidade' medido como a soma dos valores de pixel. Densidade da proteína fluorescente em partículas é calculada como a soma dos valores de pixel, dividida pela área. O número de partículas geradas na etapa 5.3 indica a quantidade de partículas dentro do tecido que ROI definido na etapa 4.4.</li>
	<li>ROI Manager no menu escolha "Medida". Os resultados são expressos em unidades calibradas, enquanto as medições de arquivos derivados do software da imagem latente em Fiji. Copiar os resultados da janela de resultados e cole no software de planilha para compilação e mais cálculos.</li>
</ol>7. Ratiometric quantificação e análise de dados
<ol><li>Siga as etapas 6.1 e 6.2 para abrir identificadores de partícula no primeiro canal cru de interesse.</li>
	<li>Definir as medições desejadas clicando em "Analyze | Conjunto de medições". Nota: A intensidade média por partícula pode ser medida, escolhendo "Significa o valor de cinza".</li>
	<li>Do Gerenciador de ROI selecione "Medida". Copiar os dados da janela de resultados e colar no software de planilha eletrônica.</li>
	<li>Mover a barra de rolagem de "C" para o segundo canal cru de interesse, neste exemplo (Figura 4A), as boas práticas agrícolas e repita as etapas de 7.2. e 7.3. Nota: As partículas que salvou na etapa 5.3 padrão serão o canal e a fatia do qual ele foi gerado. Tome cuidado para garantir que as partículas são aplicadas para o canal correto de interesse.</li>
	<li>Calcule a relação da intensidade de um canal para a intensidade do segundo para cada partícula do software de planilha eletrônica.</li>
	<li>
Use um gráfico de dispersão para visualizar e quantificar dados ratiometric de fluorophores que exibem alterações individuais reflexivas de processos biológicos subjacentes.
	<ol>
<li>Gere um gráfico de dispersão no software gráfico. Nota: Cada ponto de dados representa uma estrutura de interesse onde a intensidade da primeira fluoróforo de interesse é o valor de"x" e a intensidade da segunda fluoróforo é o valor"y", medido a partir de cada partícula.</li>
		<li>Defina limites para cada fluoróforo definir os quadrantes de gating.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Use linha perfil Visualizar fluoróforo intensidade através de uma estrutura de interesse.
	<ol>
<li>Selecione um ROI gerado na etapa 5.3 e usar a ferramenta em linha reta na barra de ferramentas para desenhar uma linha reta através do ROI. Adicione a linha ROI para o Gerenciador de ROI.</li>
		<li>Para cada canal de interesse, com a linha ROI ativo, selecione "Analyze | Traçar o perfil". Nota: A função de perfil de trama irá gerar uma trama de histograma e uma tabela dos valores de intensidade ao longo da linha. Copie os resultados medidos de cada canal e colar no software de planilha para gerar um enredo mostrando ambos os canais ao longo da linha.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Shiber, A., Breuer, W., Ravid, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+quantification+and+characterization+of+intracellular+protein+aggregates+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric quantification and characterization of intracellular protein aggregates in yeast.</a> Prion. 8 (3), 276-284 (2014).</li>
<li>Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. <a target="_blank" href="https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(10)00063-2">Methods in mammalian autophagy research.</a> Cell. 140 (3), 313-326 (2010).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O protocolo descrito aqui pode ser usado de forma robusta e reproducibly dosar processos biológicos de célula visualizados pela geração de imagens baseada em fluorescência. Contexto biológico e limitações técnicas precisam ser cuidadosamente considerados para guiar o projeto experimental. Marcadores fluorescentes de estruturas subcelulares de interesse, se imuno-histoquímica, à base de corantes, ou geneticamente expressa, precisa ser distinguíveis acima fundo pela morfologia e intensidade. O sistema UAS/GAL4 é a...

Doenças neurodegenerativas afectam milhões de pessoas a cada ano e a incidência está aumentando com uma população de envelhecimento1. Enquanto cada doença neurodegenerativa tem uma única etiologia, agregação de misfolded proteínas e desagregação da rede proteostasis são comuns características patológicas muitas destas doenças. Elucidar como interrupção destes processos fundamentais e inter-relacionados dá errado contribuir para a morte neuronal de disfunção e célula é fundamental para o entendimento das doenças neurodegenerativas, bem como orientar intervenções terapêuticas. Geração de imagens baseada em fluorescência permite a investigação destes processos complexos e dinâmicos em neurônios e contribuiu enormemente para a nossa compreensão da biologia celular neuronal. Análise de proteínas fluorescente etiquetadas é um desafio, especialmente quando são realizados experimentos na vivo, devido à heterogeneidade morfológica, tipos de diversas células e tecidos altamente compactos. Quantificação manualmente assistida é acessível e simples, mas muitas vezes é demorado e sujeito a viés humano. Portanto, há uma necessidade de abordagens imparciais, reprodutíveis e acessíveis para extrair dados quantificáveis de estudos de imagem.
Nós esboçamos um fluxo de trabalho simples e adaptável usando Fiji/ImageJ, uma software de2,3, de processamento de imagem poderosa e livremente acessível para extrair dados quantitativos de estudos de imagiologia de fluorescência em modelos experimentais de Neurodegeneração utilizando drosófila. Seguindo este protocolo para quantificar a agregação da proteína e fluxo autophagic — duas células características biológicas que são altamente relevantes para a patologia de doenças neurodegenerativas — temos demonstrado a sensibilidade e a reprodutibilidade desta abordagem. Análise de proteínas fluorescente etiquetado huntingtina mutante (Htt) no lobo óptico Drosophila revelou o número, tamanho e intensidade de agregados de proteínas. Nós visualizado um repórter fluorescentes em tandem de autophagic fluxo dentro do sistema visual de Drosophila , que exibe sinais de emissão diferentes dependendo do ambiente compartimental4. Análise baseada em Ratiometric do repórter em tandem permitiu uma visão quantitativa e abrangente de fluxo de autofagia-lisossoma do autophagosome de formação, maturação e transporte para a degradação do lisossomo e adicionalmente destacou vulneráveis compartimentos interrompidos em condições neurodegenerativas. Importante, em ambas as análises implementamos limiarização semi-automático e passos de segmentação em nosso protocolo para minimizar o preconceito inconsciente, aumentar o poder de amostragem e fornecer um padrão para facilitar comparações entre estudos semelhantes. O fluxo de trabalho simples destina-se a fazer poderosos plugins de Fiji/ImageJ (desenvolvido por cientistas de computador baseados em algoritmos matemáticos) mais acessível a neurobiologia isto e a comunidade de Ciências da vida em geral.

<table><tbody><tr><td>SYLGARD (R) 184 Kit de Elastômero de Silicone</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>PF184250</td><td>Prato de dissecação</td></tr><tr><td>Falcon 35 mm Não tratado com TC Easy-Grip Estilo Bacteriológico Placa de Petri</td><td>Corning</td><td>351008</td><td>Prato de dissecação</td></tr><tr><td>Dumont # 5 Fórceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td>Ferramenta de dissecação</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>PBS solução</td></tr><tr><td>Fosfato de Sódio Dibásico&nbsp;</td><td>Solução Sigma</td><td>S5136</td><td>PBS Fosfato</td></tr><tr><td>de Potássio Monobásico</td><td>Solução Sigma</td><td>P5655</td><td>PBS Triton</td></tr><tr><td>&nbsp; X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>Solução de lavagem e incubação de anticorpos.&nbsp;</td></tr><tr><td>37% Formaldeído</td><td>VWR</td><td>10790-710</td><td></td></tr><tr><td>Fixação Tubos de Microcentrífuga Descartáveis (0.5mL, azul)</td><td>VWR</td><td>89000-022</td><td>Fixação, lavagem e inclusão de anticorpos.&nbsp;</td></tr><tr><td>Micro Slides Simples e Foscos (25&vezes; 75mm)</td><td>VWR</td><td>48312-004</td><td>Slides para imagem confocal</td></tr><tr><td>Micro Cover Glasses, retangulares (22&times; 40mm)</td><td>VWR</td><td>48393-172</td><td>Corrediças para imagem confocal</td></tr><tr><td>Borracha Cimento</td><td>Slime</td><td>1051-A</td><td>Montagem</td></tr><tr><td>VECTASHIELD Antifade Montagem Medium Vector</td><td>Laboratories, Inc.</td><td>Fita</td>Invisível <td>H-1000</td></tr><tr><td>Scotch Magic 810 (19mm&vezes; 25.4m)</td><td>3M Company</td><td>810</td><td>Montagem</td></tr> de <tr><td>Soro de Cabra Normal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PCN5000</td><td>Anticorpo incubaton</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dicloridrato)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td>Coloração de ácido nucleico. Dissolva em água deionizada para fazer uma solução estoque de 5 mg / mL e armazene a -80 ° C. Dilua para uma concentração de trabalho de 10-20 &mu; g/mL em PBTx.</td></tr><tr><td>3.5X-90X Microscópio Industrial de Inspeção de Zoom Estéreo</td><td>AmScope</td><td>SM-1BNZ</td><td>Escopo de dissecação. Equipado com 6W LED Dual Gooseneck Illuminator</td></tr><tr><td>ImageJ/Fiji</td><td>NIH</td><td>v1.51u</td><td>Com plugins SCF_MPI_CBG (versão 1.1.2)</td></tr><tr><td>FV1000-IX81 Microscópio de varredura a laser confocal</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Construct</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>BL37749</td><td></td></tr></tbody></table>

biologia celular quantitativa de neurodegeneração em drosophila , através de uma análise imparcial das proteínas fluorescente etiquetadas usando o imagej

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

Com a crescente prevalência de doenças neurodegenerativas, é cada vez mais importante entender a fisiopatologia subjacente que leva à perda e disfunção neuronal. Tecnologias e ferramentas de imagem baseada em fluorescência permitem uma análise sem precedentes dos processos neurobiológicos subcellular, no entanto, há ainda a necessidade de abordagens imparciais, reprodutíveis e acessíveis para extrair dados quantificáveis de estudos de imagem . Nós desenvolvemos um fluxo de trabalho simples e adaptável para extrair dados quantitativos de estudos de imagens baseada em fluorescência usando modelos da drosófila de neurodegeneração. Especificamente, nós descrevemos uma abordagem fácil de seguir, semi automatizada usando Fiji/ImageJ para analisar dois processos celulares: em primeiro lugar, podemos quantificar agregar conteúdo de proteína e perfil no lobo óptico drosófila usando fluorescente-tag mutante huntingtina proteínas; e em segundo lugar, avaliamos o fluxo de autofagia-lisossoma no sistema visual de drosófila com quantificação baseada em ratiometric de um repórter fluorescentes em tandem de autofagia. Importante, o protocolo descrito aqui inclui uma etapa de segmentação semi-automática para garantir que todas as estruturas fluorescentes são analisadas para minimizar o viés de seleção e aumentar a resolução de comparações sutis. Esta abordagem pode ser estendida para a análise de outras estruturas biológicas celulares e processos implicados na neurodegeneração, tais como partitura proteicas (grânulos de stress e complexos sinápticos), compartimentos, bem como membrana-limite (mitocôndrias e vesículas de tráfico de membrana). Este método oferece uma forma padronizada, ainda referência adaptável aponte para análise de imagens e quantificação e poderia facilitar a confiabilidade e reprodutibilidade através do campo e, finalmente, melhorar a compreensão mecanicista da neurodegeneração.

Quantificação do número, área e intensidade de mutante fluorescente etiquetado Htt agrega no lobo óptico drosófila
Para investigar a agregação de misfolded proteínas no sistema nervoso central de um modelo de Drosophila da doença de Huntington, RFP-tag mutante Htt humana com uma expansão patológica ( ou não-patológica (UAS-RFP-hHttQ15) UAS-RFP-hHttQ138) e membrana GFP (UAS-mCD8::GFP)<sup...

Nós desenvolvemos um fluxo de trabalho simples e adaptável para extrair dados quantitativos de estudos biológicos fluorescência-imagem latente-à base de célula de agregação de proteínas e autophagic fluxo no sistema nervoso central de Drosophila modelos de Neurodegeneração.

Biologia celular quantitativa de neurodegeneração em Drosophila , através de uma análise imparcial das proteínas fluorescente etiquetadas usando o ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...

Desenvolvemos este método para extrair dados quantitativos de estudos de imagem baseados em fluorescência para extrair processos biológicos celulares complexos e dinâmicos em modelos de neurodegeneração de Drosophila. A principal vantagem dessa técnica é seu fluxo de trabalho de análise de imagem adaptável e semiautomatizado para minimizar o viés de seleção, maximizar o poder de amostragem e obter reprodutibilidade em todo o campo. Essa abordagem pode ser estendida para a análise de outros pontos proteicos e compartimentos ligados à membrana implicados na neurodegeneração que, em última análise, aumentarão nossa compreensão mecanicista das doenças neurodegenerativas.Para manter a lâmina intacta durante a dissecção sob um microscópio estéreo, deslize duas pinças sob a retina e rasgue suavemente o meio do olho para remover a retina. Mantendo a pinça paralela à superfície da lâmina, retire qualquer tecido retiniano remanescente preso à lâmina. Dissecar três a cinco cérebros para cada grupo e transferir os cérebros para um tubo de microcentrífuga contendo um fixador apropriado por 15 minutos em temperatura ambiente com balanço suave.Após três lavagens de 15 minutos com PBS mais Triton X-100, ou PBTx, substitua a última lavagem pelo anticorpo primário de interesse diluído em PBTx com 5% de soro de cabra normal para uma incubação noturna em um misturador de alíquotas a quatro graus Celsius. Na manhã seguinte, remova o excesso de anticorpo com três lavagens de 15 minutos em PBTx e incube os cérebros em um anticorpo secundário apropriado diluído em PBTx com 5% de soro de cabra normal por uma hora em temperatura ambiente. No final da incubação, lave os cérebros três vezes, conforme demonstrado, e coloque uma gota de meio de montagem entre dois pedaços de fita transparente no centro de uma lâmina de microscopia por amostra de tecido.Coloque os cérebros na mídia de montagem por um a dois minutos. Quando os tecidos ficarem transparentes, use uma pipeta para remover cuidadosamente o meio de montagem de cada lado. Para obter imagens dos tecidos corados, aplique uma gota de meio de montagem fresco no cérebro e cubra cuidadosamente as amostras com uma tampa de vidro.Sele as bordas da lamínula com cimento de borracha e seque as lâminas ao ar por 20 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, visualize a amostra no microscópio e ajuste os controles do detector de imagem no microscópio de fluorescência para capturar a maior relação sinal-ruído na faixa dinâmica mais alta da amostra. Depois que as configurações forem otimizadas, visualize uma amostra de outro grupo para confirmar se as configurações serão apropriadas em todo o experimento.A primeira amostra pode então ser fotografada, tendo o cuidado de salvar a imagem como um tipo de arquivo que pode preservar metadados, como parâmetros de aquisição e calibração espacial. Para analisar as imagens, abra uma imagem em Fiji, selecione Exibir pilha com Hyperstack na caixa de diálogo Opções de importação de bioformatos e defina o modo de cor como Tons de cinza. Identifique uma área com base nos canais de marcadores que podem ser usados como uma região de interesse padronizada entre espécimes usando a barra de rolagem C para visualizar os canais e a barra de rolagem Z para se mover pelos planos focais.Para simplificar a análise de imagem, gere uma nova imagem contendo os canais e planos focais e selecione Imagem e Duplicar. Defina os canais e fatias desejados e altere o nome do arquivo para refletir a seleção. Selecione manualmente uma região de interesse padronizada usando uma Ferramenta de Seleção com base nos critérios de seleção previamente determinados.Clique em Analisar, Ferramentas, Gerente de Região de Interesse e Adicionar para adicionar a região de interesse ao Gerenciador de Região de Interesse. Em seguida, clique em Mais e em Salvar e nomeie o arquivo para refletir a região de interesse. Para pré-processar as imagens, clique em Processar em Filtros e selecione um filtro apropriado.Aqui, selecione as configurações de filtro que reduzem o ruído enquanto preservam as bordas para ajudar na detecção das estruturas de interesse durante a segmentação. Com a imagem pré-processada ativa em Fiji, clique em SCF, Rotulagem e H_Watershed interativa. No painel de controle, ajuste a dinâmica de semente, o limite de intensidade e a inundação de pico para otimizar a segmentação.Quando os resultados da segmentação tiverem sido otimizados, selecione Exportar Regiões, Mascarar e Exportar para gerar uma imagem binária dos resultados da bacia hidrográfica. Abra a região padronizada de interesse salva. No Gerenciador de Região de Interesse, selecione o identificador de região de interesse para limitar a extração de recursos à região de interesse padronizada na imagem.Com a região de interesse ativa na máscara binária da bacia hidrográfica, selecione Analisar, Analisar partículas e Adicionar ao gerenciador para extrair as feições e adicionar um identificador de partículas para cada estrutura delineada durante a segmentação para o Gerenciador de região de interesse. Em seguida, salve as partículas adicionadas, cuidando para que os identificadores sejam desmarcados e que todas as partículas sejam salvas em um arquivo zip. Agora abra a imagem raw pré-processada e role até o canal usado para capturar as estruturas de interesse.Abra as partículas obtidas da extração de recursos e selecione Mostrar tudo no Gerenciador de região de interesse para sobrepor um contorno de cada partícula na imagem. Clique em Analisar e definir medidas e defina as medições experimentais apropriadas. Em seguida, no Gerenciador de Região de Interesse, selecione Medir e copie e cole os resultados em um programa de planilha apropriado para compilação e cálculos adicionais.A quantificação do número de agregados de huntingtina RFP segmentados semiautomaticamente a partir de planos focais padronizados através do lobo óptico de Drosophila revela uma expressão difusa da expansão não patogênica de Huntington Q15 no acúmulo de agregados de proteínas pela expansão de Huntington Q138 causadora de doenças. Os perfis de tamanho e intensidade de todos os agregados de um plano focal padronizado de cinco lobos ópticos diferentes expressando Huntington Q138 ilustram a robustez e reprodutibilidade desse fluxo de trabalho. Quando os agregados são superexpostos durante a aquisição da imagem, a quantificação do tamanho e do número de agregados é comparável aos agregados capturados com a exposição ideal.No entanto, a intensidade dos agregados superexpostos torna-se uma função do tamanho, pois os pixels saturados exibem o valor máximo de intensidade. A visualização da intensidade de mCherry e GFP em várias estruturas positivas relacionadas à autofagia ou Atg8 revela diferenças no repórter, onde a alta intensidade de ambos os fluoróforos indica autofagossomos. Alta mCherry e baixa GFP indicam fusão com lisossomo, pois a GFP é extinta neste compartimento ácido.E, finalmente, o baixo mCherry reflete a degradação dentro do lisossomo. Um gráfico de dispersão gerado a partir da intensidade média do fluoróforo de cada partícula positiva mCherry Atg8 segmentada semiautomaticamente ilustra o fluxo através da via do lisossomo da autofagia que pode ser separada em etapas discretas pela análise do quadrante. Ao tentar esse procedimento, é importante lembrar que os parâmetros definidos pelo usuário nas etapas de análise de imagem são altamente dependentes do aplicativo.Portanto, tenha cuidado ao documentar o fluxo de trabalho para garantir consistência e comparabilidade entre as amostras.

quantitative-cell-biology-neurodegeneration-drosophila-through

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Único Drosophila Dissection omatídeo e Imagem

Este vídeo demonstra imagens e quantificação de agregados de proteínas em cérebros de Drosophila geneticamente modificados. Os cérebros são fixados, lavados e tratados com um agente antidesbotamento antes da montagem. As imagens são capturadas usando um microscópio confocal e quantificadas para observar a transmissão de agregados de proteínas mutantes.

Imagem e quantificação de agregados de proteínas em cérebros de drosófilas geneticamente modificadas

Drosophila é amplamente usado como um sistema modelo para estudar a neurodegeneração. Este protocolo descreve um método pelo qual a degeneração, como determinado pela formação de vacúolo no cérebro, podem ser quantificados. Ela também minimiza os efeitos devido ao procedimento experimental por meio de processamento e controlo de moscas e de seccionamento experimentais como uma amostra.

Mass Histologia para quantificar neurodegeneração em<em&gt; Drosophila</em

Aqui nós mostramos como quantificar o número ea distribuição espacial das zonas ativas sinápticas em fotorreceptores de Drosophila melanogaster, destacou com um marcador molecular geneticamente codificado, e sua modulação após a exposição prolongada à luz.

Analisando Synaptic Modulação da<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Fotorreceptores após exposição à luz prolongada

Este protocolo descreve a dissecção e imunocoloração de adultos Drosophila melanogaster tecidos do cérebro. Especificamente, este protocolo destaca o uso da Drosophila cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios como subconjuntos neuronal de exemplo que podem ser usados com precisão para descobrir princípios gerais subjacentes a muitos aspectos do desenvolvimento neuronal.

Dissecção e imunofluorescência coloração de cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios em cérebros adultos Drosophila melanogaster

Acumular evidências suporta a ideia que agregados de proteínas patogênicas associam com doenças neurodegenerativas espalhados entre as células com o prião-como propriedades. Aqui, descrevemos um método que permite a visualização de propagação de célula para célula de príon como agregados no organismo modelo, Drosophila melanogaster.

Monitoramento de transmissão de celular para celular da proteína príon como agregados em Drosophila Melanogaster.

Este protocolo centra-se na análise quantitativa de complexidade arborização dendrítica neuronal (NDAC) em Drosophila, que pode ser usado para estudos da morfogênese dendrítica.

Análise quantitativa da arborização dendrítica Neuronal complexidade em Drosophila

O objetivo deste procedimento é dissecar o tecido do músculo longitudinal dorsal (DLM) para avaliar a integridade estrutural das junções neuromusculares DLM (NMJs) em modelos de doenças neurodegenerativas utilizando Drosophila melanogaster.

Visualização da Degeneração Sináptica em Drosophila Adulta em Associação com Neurodegeneração

Aqui, métodos não invasivos são descritos para localização de proteínas de membrana fotorreceptora e avaliação da degeneração da retina no olho composto de Drosophila usando fluorescência eGFP.

Estudando o tráfico de proteínas de membrana em células fotorreceptoras de Drosophila usando proteínas marcadas pelo eGFP

Este estudo apresenta um protocolo simplificado para processamento de tecidos envolvendo decapitação, fixação, criosecção, coloração de fluorescência, imunocoloração e imagem, que pode ser estendido para imagens confocais e multifotônicas. O método mantém uma eficácia comparável a dissecções complexas, ignorando a necessidade de habilidades motoras avançadas. A análise quantitativa de imagens fornece amplo potencial investigativo.

Crioseccionamento direto de cabeças de Drosophila para coloração e imunocoloração aprimoradas de fluorescência cerebral

Aprenda análise de imagem semi-automatizada para quantificar agregados proteicos em modelos de Drosophila de neurodegeneração. Este método minimiza vieses e maximiza a reprodutibilidade em estudos de biologia celular.

Biologia celular quantitativa de neurodegeneração em Drosophila , através de uma análise imparcial das proteínas fluorescente etiquetadas usando o ImageJ (Vídeo) | JoVE Journal

Biologia celular quantitativa de neurodegeneração em Drosophila , através de uma análise imparcial das proteínas fluorescente etiquetadas usando o ImageJ

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