Manutenção de culturas biológicas e medição de expressão gênica em Aphis nerii: um sistema Non-modelo de interações inseto-planta

Este método descreve as etapas gerais para a cultura de pulgões e as etapas para a análise genética de pulgões. Esses métodos podem ser aplicados para responder a questões-chave na evolução e ecologia dos pulgões e nos mecanismos moleculares subjacentes à biologia dos pulgões. A principal vantagem dessa técnica é que ela geralmente pode ser aplicada à maioria das espécies de pulgões e realizada a um custo relativamente baixo.

Comece enchendo uma bandeja de mudas padrão com solo de mistura de germinação, tomando cuidado para que o solo atinja o topo dos poços. Quando todos os poços estiverem cheios, faça um buraco de três centímetros de profundidade no solo de cada poço e coloque uma semente em cada buraco. Regue as células até que o solo que cobre as sementes esteja saturado e coloque a bandeja em uma estufa com rega diária a dias alternados, para manter um nível moderado de umidade do solo.

Quando as mudas crescerem, seu primeiro conjunto de folhas cheias encha vasos redondos de dez centímetros com terra para vasos, até cerca de cinco centímetros abaixo de suas bordas. Crie um todo no solo profundo o suficiente para alcançar o fundo do vaso e retire delicadamente as mudas maduras com a mão para colocá-las profundamente nos buracos dos novos vasos. Em seguida, cubra as mudas com terra e regue as mudas diariamente em dias alternados para manter um nível moderado de umidade do solo.

Quando as plantas tiverem crescido pelo menos três a quatro conjuntos de folhas inteiras e tiverem pelo menos dez centímetros de altura, inspecione manualmente as plantas em busca de pragas indesejadas e use uma pipeta de boca para transferir cuidadosamente um único pulgão adulto coletado em campo de reprodução para a folha da primeira planta para criar uma linha isoclonal. Quando todos os pulgões tiverem sido transferidos, cubra as plantas com segurança com uma gaiola de copo feita sob medida e coloque as plantas infestadas de pulgões em uma câmara de ambiente controlado. Para manter as populações de estoque, use uma pipeta bucal para transferir com segurança uma a três ninfas de segundo ou terceiro ínstar e um pulgão adulto para uma nova planta semanalmente.

E cubra cada planta com uma nova gaiola de copo para cultura, conforme demonstrado. Para extração de DNA de um único pulgão adulto, coloque o pulgão perto do fundo de um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitro contendo nitrogênio líquido e triture o pulgão com um pilão. Em seguida, adicione 100 microlitros de tampão de lise ao tubo da microcentrífuga e continue a moer o pulgão esmagado até que a amostra esteja visivelmente desintegrada.

Lave o pilão com mais 100 microlitros de tampão de lise e incube o pulgão a 65 graus Celsius por 30 minutos. No final da incubação, adicione 14 microlitros de acetato de potássio emulor ao tubo e inverta para misturar. Após 30 minutos no gelo, recolher os restos celulares por centrifugação e transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros sem perturbar o sedimento.

Adicione 200 microlitros de etanol frio 100% molecular ao sobrenadante e inverta o tubo para misturar. Após 15 minutos à temperatura ambiente, coletar o DNA precipitado por centrifugação e remover o etanol com pipeta. Ressuspenda o pellet em 200 microlitros de etanol frio de grau molecular a 70% com sacudida para uma segunda lavagem da centrífuga.

E ressuspenda o pellet em 200 microlitros de etanol 100% molecular fresco e frio. Após a terceira centrifugação, coloque o tubo horizontalmente sobre um pedaço de papel de seda para secar ao ar por cinco a dez minutos. E ressuspenda o pellet de DNA em 80 microlitros de baixo tris edta.

Em seguida, quantifique o DNA ressuspenso em um espectrofotômetro e armazene a amostra restante a quatro graus Celsius. Depois de triturar até cinco pulgões adultos em nitrogênio líquido, conforme demonstrado, transfira a amostra para uma capela e adicione 800 microlitros de reagente de extração de tiocianato-fenol-clorofórmio de guanidínio ao tubo de amostra. Homogeneizar a amostra com um pilão e incubar o homogeneizado durante cinco minutos à temperatura ambiente.

Em seguida, adicione 160 microlitros de clorofórmio à amostra, seguidos de 15 segundos de agitação vigorosa com a mão. Em seguida, incube a amostra por dois a três minutos em temperatura ambiente e centrifugue para coletar o RNA extraído. Para precipitar o RNA, transfira a fase aquosa para um novo tubo de microcentrífuga livre de RNS sem perturbar a fase intermediária e adicione 400 microlitros de isopropanol ao RNA.

Após uma incubação de dez minutos a 20 graus Celsius negativos, coletar o RNA precipitado por centrifugação. Em seguida, lave a amostra duas vezes com um mililitro de etanol a 75% em água tratada com dietil pirocarbonato, até a amostra com vórtice lento e centrifugação para remover quaisquer contaminantes de fenol. Após a segunda lavagem, seque o pellet principalmente ao ar por cinco a dez minutos em uma bancada estéril e dissolva o pellet de RNA em 30 microlitros de água ultrapura com pipetagem suave antes de uma incubação de dez a 15 minutos a 55 a 60 graus Celsius.

As sementes levarão aproximadamente duas a quatro semanas, dependendo da estação, para crescer o suficiente para serem replantadas. Mudas replantadas levarão mais duas a quatro semanas para crescer até um tamanho ideal para a cultura de pulgões. Os olhos adultos são distinguidos por uma cauda escurecida e podem ser sem asas ou aladas.

As almofadas das asas em desenvolvimento tornam-se visíveis quando as ninfas atingem o terceiro ínstar. Um único olho adulto próximo renderá aproximadamente 100 a 200 nanogramas por microlitro de DNA e 150 a 300 nanogramas por microlitro de RNA. A expressão relativa de um gene candidato sob diferentes condições de tratamento pode então ser calculada.

Ao tentar este procedimento, é importante não contaminar seus estoques isoclonais. Além disso, lembre-se de que a qualidade de seus pulgões depende muito da qualidade de suas plantas. Após este procedimento, outras extrações e técnicas de sequenciamento podem ser realizadas para responder a perguntas sobre os mecanismos moleculares subjacentes à biologia dos pulgões.