Name: Reação em Cadeia da Polimerase Digital de Gota Única para Detecção Abrangente e Simultânea de Mutações em Regiões de Hotspot (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Aprenda a técnica drop-off ddPCR para detecção simultânea de múltiplas mutações em regiões de hotspot do DNA tumoral circulante. Este método sensível e econômico permite quantificação absoluta de alvos genéticos em biopsia líquida.

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Este trabalho foi apoiado pelo Institut Curie SiRIC (grant INCa-DGOS-4654). Os autores também desejam agradecer Caroline Hego por sua contribuição ao vídeo.

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<li>Bidshahri, R., Attali, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Detection+and+Resolution+of+BRAF+V600+Status+in+Colorectal+Cancer+Using+Droplet+Digital+PCR+and+a+Novel+Wild-Type+Negative+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Quantitative Detection and Resolution of BRAF V600 Status in Colorectal Cancer Using Droplet Digital PCR and a Novel Wild-Type Negative Assay.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 190-204 (2016).</li>
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</ol>

Vários autores são nomeados os inventores de duas patentes (EP17305920.5, EP18305277.8) relacionados à detecção de ctDNA.

Para projetar um ensaio de ddPCR de entrega eficiente, otimização é crucial, e o protocolo deve ser seguido cuidadosamente. Cada combinação de primers e sondas tem uma eficiência de reação de PCR exclusiva. Assim, um ensaio individual tem de ser cuidadosamente validado em amostras de controle antes de serem utilizados em amostras de teste valioso. Otimização e validação são importantes para a detecção do sinal de pico de certificar e avaliar a sensibilidade e especificidade. Conforme descrito no protocolo, todas as mutaç...

Milhares de mutações somáticas relacionadas ao desenvolvimento de câncer foram relatados1. Entre estes, alguns são marcadores preditivos da eficácia da terapia-alvo 2,3 e genética triagem destas mutações é agora rotina clínica. Tecnologia digital de PCR (ddPCR) da gota pode ser usada para monitorar a presença ou ausência de mutações com exatidão elevada da deteção e é altamente compatível com não-invasivos biópsias líquido4,5. No entanto, ensaios de ddPCR atual principalmente são projetados para detectar mutações conhecidas a priori. Isto limita severamente o uso de ddPCR como uma ferramenta de descoberta quando a mutação é desconhecida. Com efeito, na concepção convencional ddPCR, uma sonda de hidrólise, reconhecendo o alelo selvagem-tipo (sonda de WT) concorre com uma sonda específica, reconhecendo o alelo mutante (MUT sonda) (figura 1A). A sonda com maior afinidade se para o modelo e libera seu fluoróforo, indicando a natureza do alelo correspondente. Os dados de fluorescência obtidos para cada gota podem ser visualizados em um gráfico de dispersão representando a fluorescência emitida por sondas WT e MUT em dimensões diferentes. Uma representação esquemática de um resultado típico para um ensaio de ddPCR convencional é apresentada na figura 1A. Neste exemplo, a nuvem azul corresponde as gotículas contendo alelos WT identificados pela sonda WT, Considerando que a nuvem vermelha corresponde a gotículas no qual o alelo MUT foi amplificado e identificado pela sonda MUT. Dependendo da quantidade de DNA carregado na reação, duplas positivas gotículas contendo tanto WT e MUT amplicons podem aparecer (nuvem verde). A nuvem de cinza luz corresponde ao vazias gotículas.
Desde que a maioria das plataformas de permitir a detecção de um número limitado de fluorophores (normalmente 2, mas até 5), a taxa de transferência de ddPCR convencional é limitada. Portanto, segmentando regiões com várias mutações adjacentes requer projeto de tecnicamente desafiador multiplex ddPCR ensaios ou o uso de múltiplas reações alvejando cada mutação em paralelo. A estratégia de ddPCR de entrega, supera essa limitação como potencialmente pode detectar qualquer alteração genética dentro de uma região de destino usando um único par de sondas de hidrólise do WT. As tampas de sonda (Probe 1) primeiras que uma sequência não-variável, adjacente à região de destino e a segunda sonda (sonda 2) é complementar à sequência de WT da região de destino, onde as mutações são esperados (figura 1B). Enquanto a primeira sonda quantifica a quantidade total de moléculas ampliáveis na reação, a segunda sonda discrimina WT e MUT alelos por hibridação sub-ótimo para sequências de mutantes. Sonda 2 pode identificar vários tipos de mutações na região (substituições de nucleotídeo único ou múltiplo, exclusão, etc.) alvo6. Como em ddPCR convencional, a nuvem de cinza luz corresponde a gotículas não contendo nenhuma molécula de DNA. É importante recordar que, neste tipo de ensaio, separação ideal de nuvens WT e MUT é dependente da quantidade de DNA carregado na reação, desde que gotículas contendo tanto WT e MUT alelos de destino não podem ser distinguidas gotículas contendo apenas o WT formulário. Portanto, este ensaio requer que a maioria das gotículas contenham não mais de uma cópia do gene alvo.

<table><tbody><tr><td>Tubo K2EDTA (código de cores: lavanda)</td><td>Os tubos BD</td><td>367863</td><td>EDTA são usados para obter uma amostra de sangue total ou plasma EDTA</td></tr><tr><td>Kit de ácido nucleico circulante QIAamp (protocolo manual)</td><td>Qiagen</td><td>55114</td><td>Para isolamento de DNA circulante de plasma humano</td></tr><tr><td>Kit de DNA circulante QIAsymphony DSP (protocolo automatizado)</td><td>Qiagen</td><td>937556</td><td>Para isolamento de DNA circulante de plasma humano</td></tr><tr><td>Sistema QIAsymphony SP</td><td>Qiagen</td><td>9001297</td><td>sistema totalmente integrado e automatizado para purificação de cfDNA, DNA ou RNA</td></tr><tr><td>QIAvac 24 Plus</td><td>Qiagen</td><td>19413</td><td>Para purificação de até 24 cfDNAs simultaneamente</td></tr><tr><td>Fluorômetro Qubit</td><td>Invitrogen</td><td>Q33226</td><td>O fluorômetro Qubit é um fluorômetro de bancada para a quantificação do leitor de DNA</td></tr><tr><td>QX100 ou QX200</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3003 ou 186-4003, respectivamente</td><td>O leitor mede a intensidade de fluorescência de cada gota e detecta o tamanho e a forma à medida que as gotículas passam pelo detector</td></tr><tr><td>Gerador de gotículas QX100 ou QX200</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3002 ou 186-4002, respectivamente</td><td>Instrumento usado para geração de gotículas</td></tr><tr><td>C1000 termociclador</td><td>Bio-Rad</td><td>1851196</td><td>Plataforma modular de termociclador, inclui chassi de termociclador C1000 Touch, módulo de reação rápida de 96 poços</td></tr><tr><td>Seladora de placas</td><td>Bio-Rad</td><td>181-4000</td><td>PX1&trade; Seladora de placas PCR</td></tr><tr><td>Porta-cartuchos DG8</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3051</td><td>Posiciona e segura o cartucho DG8 no instrumento para geração de gotículas</td></tr><tr><td>Cartuchos e juntas geradoras de gotículas</td><td>Bio-Rad</td><td>186-4007</td><td>Cartucho microfluídico DG8 usado para misturar amostra e óleo para gerar gotículas; As juntas DG8 vedam o cartucho para evitar a evaporação e aplicam a pressão necessária para a formação de gotículas</td></tr><tr><td>Supermix de PCR</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3010</td><td>supermix de PCR ddPCR para sondas (sem dUTP)</td></tr> <tr><td>Placas de PCR de 96 poços</td><td>Eppendorf</td><td>951020362</td><td>Placas semi-contornadas de 96 poços</td></tr><tr><td>Vedação de folha</td><td>Bio-Rad</td><td>181-4040</td><td>Selagem térmica de folha perfurável</td></tr><tr><td>ddPCR Óleo de leitor de gotículas</td><td>Bio-Rad</td><td>Óleo 186-3004</td><td>usado na leitura</td></tr><tr><td>Óleo de geração de gotículas para sondas</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3005</td><td>óleo para geração de gotículas</td></tr><tr><td>DNA loBind Tube 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030 108.051</td><td>Os tubos Eppendorf LoBind maximizam a recuperação da amostra, reduzindo significativamente a ligação da amostra à superfície</td></tr><tr><td>Conjunto padrão de referência Multiplex I cfDNA HORIZON</td><td></td><td>HD780</td><td>Os Padrões de Referência Multiplex I cfDNA são materiais de referência biologicamente relevantes e altamente caracterizados usados para avaliar o desempenho de ensaios de cfDNA que detectam mutações somáticas</td></tr><tr><td>KIT DE ENSAIO QUBIT DSDNA HS, 500</td><td>Life Technologies</td><td>Q32854</td><td>O ensaio HS é altamente seletivo para DNA de fita dupla (dsDNA) sobre RNA e é projetado para ser preciso para concentrações iniciais de amostra de 10 pg/&micro; L a 100 ng/&micro; L</td></tr><tr><td>Tubos de Ensaio Qubit</td><td>Life Technologies</td><td>Q32856</td><td>Os tubos de ensaio Qubit são 500 &micro; L tubos de polipropileno de paredes finas para uso com o fluorômetro Qubit</td></tr></tbody></table>

reação em cadeia da polimerase digital de gota Única para detecção abrangente e simultânea de mutações em regiões de hotspot

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Reação em cadeia da polimerase digital da gota (ddPCR) é um método de reação em cadeia (PCR) polimerase quantitativos altamente sensível baseado no fracionamento de amostra em milhares de reações individuais nanométricas de água em óleo. Recentemente, ddPCR tornou-se uma das ferramentas mais precisas e sensíveis para a deteção de DNA (ctDNA) tumor de circulação. Uma das principais limitações da técnica padrão ddPCR é o número restrito de mutações que podem ser rastreados por reação, como sondas de hidrólise específica reconhecendo cada possível versão alélico são necessárias. Um método alternativo, o ddPCR de entrega, aumenta a taxa de transferência, pois requer apenas um único par de sondas para detectar e quantificar potencialmente todas as alterações genéticas na região alvo. Entrega ddPCR exibe sensibilidade comparável para ensaios de ddPCR convencional com a vantagem de detectar um maior número de mutações em uma única reação. É cost-effective, conserva o material precioso de amostra e também pode ser usado como uma ferramenta de descoberta quando mutações não são conhecidas a priori.

Em um estudo de prova de conceito, KRAS exon 2 mutações (códons 12 e 13) e EGFR exon 19 exclusões foram investigadas em FFPE tecidos e amostras de plasma de pacientes com câncer usando o declive ddPCR estratégia6.
A sonda de entrega KRAS interrogado uma região bp 16, englobando várias mutações no exon 2 do gene KRAS , que abrigam mais de 95% das mutações conhecidas ...

Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar com precisão a múltiplas alterações genéticas de uma região de destino em uma única reação usando ddPCR de entrega e um único par de testes de hidrólise.

Reação em Cadeia da Polimerase Digital de Gota Única para Detecção Abrangente e Simultânea de Mutações em Regiões de Hotspot

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Este método pode ser usado como uma ferramenta de diagnóstico para o câncer para analisar o DNA tumoral circulante. Esta técnica interroga múltiplas alterações genéticas em regiões de mutações de cluster em uma única reação. Isso ajuda a salvar amostras preciosas de pacientes.Este método pode fornecer insights sobre a carga tumoral em seu perfil mutacional. Agora também pode ser aplicado a uma análise molecular como uma alternativa ao qPCR para obter uma quantificação absoluta das sequências de alvo de ácido nucleico. Coletar amostras de sangue em tubos EDTA de sete mililitros.Dois tubos são recomendados para coletar cerca de quatro mililitros de plasma. Centrifugar as amostras de sangue por 10 minutos a 820 vezes a gravidade dentro de três horas do sangue se rifar para separar glóbulos vermelhos, glóbulos brancos e plasma. O tempo entre a amostragem e a centrifugação é fundamental para obter DNA livre de células T de alto grau não contaminado com DNA liberado de glóbulos brancos.Após a centrifugação, use uma pipeta sorológica para coletar o supernatante sem tocar na camada de glóbulos brancos. Cerca de dois mililitros de plasma são geralmente recuperados por tubo EDTA. Depois de transferir os plasmos para dois tubos mililitros, centrifufique as alíquotas a 16.000 vezes a gravidade por 10 minutos a 15 graus Celsius para remover detritos celulares.Colete cuidadosamente o plasma sem perturbar a pelota e transfira para dois tubos criogênicos mililitros. Armazene a 80 graus Celsius negativos até que seja necessário. Comece adicionando 400 microliters de proteinase K a um tubo de 50 mililitros.Em seguida, adicione quatro mililitros de plasma e 3,2 mililitros de tampão de lise ACL contendo um micrograma de RNA portador do kit de extração. Feche o tubo e misture por vórtice por 30 segundos para obter uma solução homogênea. Em seguida, incubar a 60 graus Celsius por 30 minutos.Após a incubação, adicione 7,2 mililitros de ACB tampão ao lisato para otimizar a ligação dos ácidos nucleicos circulantes à membrana de sílica. Misture por vórtice por 15 a 30 segundos. Em seguida, incubar o tubo no gelo por cinco minutos.Coloque a coluna e o extensor de 20 mililitros na bomba de vácuo. Feche as porções não utilizadas para permitir aspiração de vácuo. Depois de centrifugar brevemente o tubo, introduza cuidadosamente a mistura no extensor do tubo.Em seguida, ligue a bomba de vácuo e deixe que o lisato seja desenhado completamente através das colunas. Remova e descarte o extensor do tubo. Em seguida, aplique 600 microliters de buffer ACW1 na coluna.Quando o buffer ACW1 tiver desenhado através da coluna, adicione 750 microliters de buffer ACW2 e, finalmente, 750 microliters de 96 a 100% etanol. Em seguida, coloque a coluna em um tubo de coleta limpo de dois mililitros e centrífuga a toda velocidade por três minutos para eliminar o etanol. Depois de colocar a coluna em um novo tubo de coleta de dois mililitros, abra a tampa e, em seguida, incubar a 56 graus Celsius por 10 minutos para secar completamente a membrana.Após a incubação, coloque a coluna em um tubo limpo de 1,5 mililitro de baixa ligação. Aplique cuidadosamente 36 microliters de água livre de RNase com azida de 0,04%. Em seguida, feche a tampa e incubar em temperatura ambiente por três minutos.Centrífuga a toda velocidade novamente por um minuto para elutar os ácidos nucleicos. Em seguida, armazene a 20 graus Celsius negativos até que seja necessário. Comece descongelando e equilibrando os componentes de reação à temperatura ambiente em um capô PCR limpo.Em seguida, prepare uma mistura de 20 vezes de primers e sondas em RNase e água destilada sem Dnase com cada primer a 18 concentrações de micromolar e cada sonda em cinco concentrações de micromolar. Para todas as reações individuais do PCR, prepare uma mistura de amostras combinando 10 microlitros de duas vezes ddPCR Supermix, um microliter de 20 vezes primers e sondas misturam, e até 10 nanogramas da amostra de DNA em 20 microlitros de água destilada. Vórtice a mistura de reação completamente para garantir a homogeneidade.E brevemente centrífuga para coletar conteúdo na parte inferior do tubo antes de dispensar. Insira o cartucho ddPCR no suporte e carregue 20 microliters de mistura de reação amostral nos poços médios do cartucho para geração de gotículas. Adicione 70 microliters de óleo gerador de gotícula nos poços inferiores.Insira o cartucho com uma junta no gerador de gotículas. As gotículas serão produzidas nos poços superiores do cartucho. A aspire lentamente e suavemente 40 microliters das gotículas dos cartuchos e dispense em uma placa PCR de 96 poços.Sele a placa PCR final com papel alumínio usando um selador de placa imediatamente após a transferência de gotículas para evitar a evaporação. Centrifufique brevemente a placa para coletar conteúdo na parte inferior dos poços. Execute uma amplificação convencional do PCR em um cicloviário térmico.Quando a corrida estiver concluída, centrifufique brevemente a placa para coletar conteúdo na parte inferior dos poços. Após a amplificação do PCR, use o leitor de gotículas para contar as gotículas negativas do PCR e pcr seguindo as instruções do fabricante. A seguir, os resultados representativos obtidos durante as etapas de otimização do ensaio ddPCR de entrega.Esta imagem mostra a detecção de DNA mutante e DNA selvagem em uma reação contendo DNA 100% mutante, DNA 5% mutante e DNA 100% selvagem. Esta imagem mostra exemplos de amostras de plasma analisadas com os ensaios de ddPCR de queda do KRAS e EGFR mostrando a detecção de nucleotídeos únicos e múltiplas substituições em exon dois de KRAS e uma exclusão em exon EGFR 19. Ao tentar este procedimento, é importante proceder cuidadosamente a cada passo com uma atenção especial na geração de gotículas, que é um passo crítico deste método.Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores e clínicos no campo da pesquisa sobre câncer otimizar a análise de mutação tumoral por meio de biópsia líquida.

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Genetics

Genética

Neste vídeo, apresentamos um procedimento passo a passo para gerar nanogotículas emulsionadas para detectar ácidos nucléicos alvo por reação em cadeia da polimerase digital ou dPCR.

Reação em cadeia da polimerase digital de gotículas: um método para gerar reações de PCR de nanogotículas para detectar mutações tumorais raras

Este vídeo demonstra o papel da reação em cadeia da polimerase de gotículas digitais na identificação da mutação indel em uma amostra de DNA. A alta precisão e sensibilidade do ddPCR permitem a detecção precisa e consistente de mutações raras presentes em uma amostra, mesmo em níveis baixos. Ele pode identificar e quantificar mutações indel em diferentes regiões do genoma, fornecendo informações valiosas sobre os mecanismos de mutação e as consequências funcionais dessas mutações.

Reação em cadeia da polimerase de gotículas digitais para detecção de mutação Indel em genes-alvo

Neste vídeo, demonstramos a técnica de PCR digital duplex (ddPCR) - uma modificação da técnica tradicional de PCR que é útil na detecção de dois marcadores genéticos diferentes simultaneamente. Uma única reação de PCR é particionada em gotículas emulsionadas do tamanho de nanolitros que são amplificadas independentemente, e a detecção de sinais de amplificação de fluorescência de cores diferentes da fração de gotículas é usada para calcular a concentração inicial das sequências alvo.

PCR digital duplex para quantificação simultânea de marcadores genéticos duplos

Este vídeo demonstra a técnica de reação em cadeia da polimerase por gotículas multiplex para a quantificação simultânea de regiões de DNA metilado em diferentes populações de glóbulos brancos como um biomarcador precoce para diagnóstico clínico e prognóstico.

Reação em cadeia da polimerase de gotículas multiplex para detectar metilação do DNA em leucócitos

Este vídeo demonstra a utilidade da PCR digital em um formato chip-in-a-tube para a detecção de variações de nucleotídeo único em amostras de DNA. Uma única reação de PCR é particionada em câmaras que atuam como reações de PCR independentes, e a detecção de sinais de fluorescência dos alvos amplificados nas câmaras é usada para calcular a frequência do alelo variante na amostra.

PCR digital baseado em chip em tubo para quantificação de variantes de nucleotídeo único

A PCR de bloqueio do tipo selvagem seguida de sequenciamento direto oferece um método altamente sensível de detecção de mutações somáticas de baixa frequência em uma variedade de tipos de amostra.

De tipo selvagem Bloqueio de PCR combinada com sequenciação directa como um método altamente sensível para a detecção de Baixa Frequência mutações somáticas

Digital cadeia da polimerase (PCR) é uma ferramenta útil para a detecção de alta sensibilidade de variantes de nucleotídeo único e as variantes números de cópia do DNA. Aqui, demonstramos considerações-chave para variantes raras no genoma humano usando PCR digital com o formato de microplaqueta-em-um-tubo de medição.

Ensaio de reação em cadeia de polimerase digital para a variação genética em paciente esporádicos polipose adenomatosa familiar usando o formato de microplaqueta-em-um-tubo

Aqui, nós apresentamos um protocolo para detectar mutações somáticas do tumor no ADN de circulação atual nos líquidos biológicos pacientes (biofluids). Nosso método baseado da reacção em cadeia digital do polymerase da gota (dpcr)-permite a quantificação da freqüência alélicas da mutação de tumor (MAF), facilitando um complemento minimamente invasor ao diagnóstico e à monitoração temporal da resposta do tumor.

Deteção e monitoração do ADN de circulação associado do tumor em Biofluids pacientes

Este artigo apresenta a aplicação de um método de detecção de baixa frequência baseado no sequenciamento de Sanger no linfoma angioimunoblástico. Forneça uma base para aplicar este método a outras doenças.

PCR de bloqueio de tipo selvagem combinado com sequenciamento de Sanger para detecção de mutação somática de baixa frequência

Um método de polimorfismo de fragmentos de reacção em cadeia da polimerase restrição melhorado para genotipagem espécies pufferfish por cromatografia / espectrometria de massa líquida é descrito. Uma coluna de sílica de fase inversa monólito é empregue para a separação de fragmentos amplificados digeridos. Este método pode elucidar as massas monoisotópico de oligonucleótidos, que é útil para identificar a composição de base.

Melhoria Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism Genotipagem de Pufferfish Tóxico por Cromatografia Líquida / Espectrometria de Massa

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