Reação em Cadeia da Polimerase Digital de Gota Única para Detecção Abrangente e Simultânea de Mutações em Regiões de Hotspot
25 de setembro de 2018
Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar com precisão a múltiplas alterações genéticas de uma região de destino em uma única reação usando ddPCR de entrega e um único par de testes de hidrólise.
Este método pode ser usado como uma ferramenta de diagnóstico para o câncer para analisar o DNA tumoral circulante. Esta técnica interroga múltiplas alterações genéticas em regiões de mutações de cluster em uma única reação. Isso ajuda a salvar amostras preciosas de pacientes.
Este método pode fornecer insights sobre a carga tumoral em seu perfil mutacional. Agora também pode ser aplicado a uma análise molecular como uma alternativa ao qPCR para obter uma quantificação absoluta das sequências de alvo de ácido nucleico. Coletar amostras de sangue em tubos EDTA de sete mililitros.
Dois tubos são recomendados para coletar cerca de quatro mililitros de plasma. Centrifugar as amostras de sangue por 10 minutos a 820 vezes a gravidade dentro de três horas do sangue se rifar para separar glóbulos vermelhos, glóbulos brancos e plasma. O tempo entre a amostragem e a centrifugação é fundamental para obter DNA livre de células T de alto grau não contaminado com DNA liberado de glóbulos brancos.
Após a centrifugação, use uma pipeta sorológica para coletar o supernatante sem tocar na camada de glóbulos brancos. Cerca de dois mililitros de plasma são geralmente recuperados por tubo EDTA. Depois de transferir os plasmos para dois tubos mililitros, centrifufique as alíquotas a 16.000 vezes a gravidade por 10 minutos a 15 graus Celsius para remover detritos celulares.
Colete cuidadosamente o plasma sem perturbar a pelota e transfira para dois tubos criogênicos mililitros. Armazene a 80 graus Celsius negativos até que seja necessário. Comece adicionando 400 microliters de proteinase K a um tubo de 50 mililitros.
Em seguida, adicione quatro mililitros de plasma e 3,2 mililitros de tampão de lise ACL contendo um micrograma de RNA portador do kit de extração. Feche o tubo e misture por vórtice por 30 segundos para obter uma solução homogênea. Em seguida, incubar a 60 graus Celsius por 30 minutos.
Após a incubação, adicione 7,2 mililitros de ACB tampão ao lisato para otimizar a ligação dos ácidos nucleicos circulantes à membrana de sílica. Misture por vórtice por 15 a 30 segundos. Em seguida, incubar o tubo no gelo por cinco minutos.
Coloque a coluna e o extensor de 20 mililitros na bomba de vácuo. Feche as porções não utilizadas para permitir aspiração de vácuo. Depois de centrifugar brevemente o tubo, introduza cuidadosamente a mistura no extensor do tubo.
Em seguida, ligue a bomba de vácuo e deixe que o lisato seja desenhado completamente através das colunas. Remova e descarte o extensor do tubo. Em seguida, aplique 600 microliters de buffer ACW1 na coluna.
Quando o buffer ACW1 tiver desenhado através da coluna, adicione 750 microliters de buffer ACW2 e, finalmente, 750 microliters de 96 a 100% etanol. Em seguida, coloque a coluna em um tubo de coleta limpo de dois mililitros e centrífuga a toda velocidade por três minutos para eliminar o etanol. Depois de colocar a coluna em um novo tubo de coleta de dois mililitros, abra a tampa e, em seguida, incubar a 56 graus Celsius por 10 minutos para secar completamente a membrana.
Após a incubação, coloque a coluna em um tubo limpo de 1,5 mililitro de baixa ligação. Aplique cuidadosamente 36 microliters de água livre de RNase com azida de 0,04%. Em seguida, feche a tampa e incubar em temperatura ambiente por três minutos.
Centrífuga a toda velocidade novamente por um minuto para elutar os ácidos nucleicos. Em seguida, armazene a 20 graus Celsius negativos até que seja necessário. Comece descongelando e equilibrando os componentes de reação à temperatura ambiente em um capô PCR limpo.
Em seguida, prepare uma mistura de 20 vezes de primers e sondas em RNase e água destilada sem Dnase com cada primer a 18 concentrações de micromolar e cada sonda em cinco concentrações de micromolar. Para todas as reações individuais do PCR, prepare uma mistura de amostras combinando 10 microlitros de duas vezes ddPCR Supermix, um microliter de 20 vezes primers e sondas misturam, e até 10 nanogramas da amostra de DNA em 20 microlitros de água destilada. Vórtice a mistura de reação completamente para garantir a homogeneidade.
E brevemente centrífuga para coletar conteúdo na parte inferior do tubo antes de dispensar. Insira o cartucho ddPCR no suporte e carregue 20 microliters de mistura de reação amostral nos poços médios do cartucho para geração de gotículas. Adicione 70 microliters de óleo gerador de gotícula nos poços inferiores.
Insira o cartucho com uma junta no gerador de gotículas. As gotículas serão produzidas nos poços superiores do cartucho. A aspire lentamente e suavemente 40 microliters das gotículas dos cartuchos e dispense em uma placa PCR de 96 poços.
Sele a placa PCR final com papel alumínio usando um selador de placa imediatamente após a transferência de gotículas para evitar a evaporação. Centrifufique brevemente a placa para coletar conteúdo na parte inferior dos poços. Execute uma amplificação convencional do PCR em um cicloviário térmico.
Quando a corrida estiver concluída, centrifufique brevemente a placa para coletar conteúdo na parte inferior dos poços. Após a amplificação do PCR, use o leitor de gotículas para contar as gotículas negativas do PCR e pcr seguindo as instruções do fabricante. A seguir, os resultados representativos obtidos durante as etapas de otimização do ensaio ddPCR de entrega.
Esta imagem mostra a detecção de DNA mutante e DNA selvagem em uma reação contendo DNA 100% mutante, DNA 5% mutante e DNA 100% selvagem. Esta imagem mostra exemplos de amostras de plasma analisadas com os ensaios de ddPCR de queda do KRAS e EGFR mostrando a detecção de nucleotídeos únicos e múltiplas substituições em exon dois de KRAS e uma exclusão em exon EGFR 19. Ao tentar este procedimento, é importante proceder cuidadosamente a cada passo com uma atenção especial na geração de gotículas, que é um passo crítico deste método.
Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores e clínicos no campo da pesquisa sobre câncer otimizar a análise de mutação tumoral por meio de biópsia líquida.
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Visão Geral
Este artigo descreve o método de PCR digital por gotas de rejeição (ddPCR), uma técnica altamente sensível para detecção e quantificação de DNA tumoral circulante (ctDNA) no diagnóstico do câncer. A abordagem de ddPCR de rejeição permite a investigação simultânea de múltiplas alterações genéticas em regiões de mutações agrupadas, conservando amostras preciosas de pacientes e aumentando o rendimento em comparação com a ddPCR padrão.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Diagnóstico molecular
- Genômica do câncer
- Biópsia líquida
Contexto
- A ddPCR padrão é um método sensível de PCR quantitativa que particiona amostras em milhares de gotículas nanoestruturadas de água em óleo.
- É amplamente utilizada na detecção de ctDNA, mas é limitada pelo número de mutações que podem ser analisadas por reação, devido à necessidade de sondas específicas.
- O método ddPCR drop-off utiliza um único par de sondas para detectar uma ampla variedade de alterações genéticas em uma região específica.
- Essa abordagem é economicamente eficiente, conserva o material da amostra e pode ser usada na descoberta de mutações quando estas não são conhecidas previamente.
Objetivo do Estudo
- Apresentar um protocolo para a técnica de drop-off ddPCR para análise de ctDNA.
- Demonstrar sua aplicação na detecção de múltiplas mutações em uma única reação.
- Destacar suas vantagens em comparação com os métodos convencionais de ddPCR e qPCR.
Métodos Utilizados
- Coleta de amostras de sangue em tubos com EDTA e separação do plasma por centrifugação.
- Extração de ácidos nucleicos circulantes utilizando proteinase K, tampão de lise e colunas com membrana de sílica.
- Preparação das reações de ddPCR com primers e sondas específicas.
- Geração de gotas, amplificação por PCR e leitura de gotas para quantificação do DNA mutante e do tipo selvagem.
Principais Resultados
- O ensaio ddPCR de drop-off detecta com sucesso substituições únicas e múltiplas de nucleotídeos, bem como deleções em genes-alvo (por exemplo, KRAS e EGFR).
- Resultados representativos mostram clara discriminação entre DNA mutante e do tipo selvagem em amostras de plasma.
- O método permite a quantificação absoluta de alvos de ácidos nucleicos e fornece informações sobre a carga tumoral e perfis mutacionais.
- Passos críticos incluem a geração e manipulação cuidadosas das gotículas para garantir a sensibilidade e a precisão do ensaio.
Conclusões
- A ddPCR de rejeição é um método robusto, sensível e economicamente eficaz para análise de ctDNA em diagnósticos de câncer.
- Permite a detecção multiplexada de mutações em uma única reação, conservando o material da amostra.
- Essa técnica apoia aplicações clínicas e de pesquisa no perfilamento de mutações tumorais utilizando biópsia líquida.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A PCR digital com gotas (ddPCR) permite a detecção abrangente e simultânea de múltiplas mutações em regiões de ponto quente a partir de amostras limitadas de biópsia líquida, abordando diretamente os desafios de sensibilidade e produtividade na descoberta precoce de biomarcadores oncológicos. Esta abordagem possibilita a quantificação absoluta do DNA tumoral circulante (ctDNA), facilitando um perfil robusto de mutações tumorais e aumentando a confiança preditiva em pontos críticos de descoberta e translação. Sua eficiência amostral e capacidade de multiplexação posicionam-na como um ativo estratégico para triagem de portfólios e avanço ajustado ao risco em pesquisa e desenvolvimento oncológicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação de regiões com mutações agrupadas para esclarecer vias oncogênicas e validar alvos acionáveis.
- Auxilia na redução de riscos biológicos ao fornecer perfis quantitativos de mutações a partir de amostras mínimas de pacientes.
- Facilita a confiança preditiva na seleção de alvos e nas decisões iniciais de prosseguimento ou interrupção de programas oncológicos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prepara sistemas validados de detecção de ctDNA para fluxos de trabalho downstream de triagem e biomarcadores.
- Fornece saídas padronizadas, reprodutíveis e quantitativas para detecção de mutações em múltiplos alelos.
- Permite triagem escalonável e multiplexada com entrada mínima de amostra, apoiando o desenvolvimento eficiente de ensaios.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se com estratégias de biomarcadores relevantes para doenças ao permitir o rastreamento de mutações baseado em biópsia líquida.
- Proporciona continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica, apoiando a quantificação absoluta de ctDNA.
- Reduz o risco translacional ao possibilitar a detecção precoce de heterogeneidade mutacional em amostras derivadas de pacientes.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
A ddPCR de perda integra-se desde as primeiras fases de descoberta até a identificação de candidatos e pesquisa translacional, apoiando a verificação de hipóteses, a elucidação de vias e a tomada de decisões baseada em biomarcadores em pipelines oncológicos.
- Biologia da Descoberta: Apoia testes robustos de hipótese nula e redução de riscos mecanicistas ao permitir a detecção multiplexada de mutações em ctDNA.
- Triagem: Garante prontidão e reprodutibilidade do ensaio para análise de mutações em alto rendimento em amostras de biópsia líquida.
- Análise: Fornece quantificação absoluta e clara discriminação entre alelos mutantes e selvagens para análises comparativas.
- Pesquisa Translacional: Facilita o alinhamento de biomarcadores e a continuidade pré-clínica mediante o monitoramento da carga tumoral e de perfis mutacionais.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma reutilizável e escalável para descoberta e monitoramento de mutações em diversos programas de oncologia.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na pesquisa oncológica orientada por mutações.
- Valor Operacional: Padroniza a análise de ctDNA com alta sensibilidade, reprodutibilidade e requisitos mínimos de amostra.
- Valor Estratégico: Permite decisões informadas de prosseguir/interromper e uma gestão eficiente do portfólio com base em dados multiplexados de mutações obtidos precocemente.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização e o avanço ajustados ao risco de ativos oncológicos com base em evidências robustas de biomarcadores.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em diagnóstico molecular e instrumentação de PCR digital em gotas.
- Exige geração e manipulação precisas de gotas para manter a sensibilidade e a exatidão do ensaio.
- Necessita de protocolos padronizados para coleta, processamento e armazenamento de amostras para garantir a reprodutibilidade.
- Adaptável a diversos alvos de mutação, mas dependente do desenho da sonda para regiões específicas.
- As limitações na quantidade de amostra e a geração de gotas são fatores críticos para resultados confiáveis.
