Name: Transferência de embriões minimamente invasivos e vitrificação embrionária na fase de embrião ideal em modelo de coelho (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Aprenda a técnica de transferência embrionária laparoscópica minimamente invasiva em coelhos, incluindo o protocolo de vitrificação para armazenamento de longo prazo. Este método avança pesquisas em biologia reprodutiva.

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Este trabalho foi apoiado por fundos do Ministério da economia e da competitividade da Espanha (AGL2017-85162-C2-1-R) e do programa de investigação Generalitat Valenciana (PrometeoII 2014/036). Versão de texto em inglês revisada por N. Macowan English Language Service

Todos os procedimentos experimentais utilizados neste estudo foram realizados de acordo com a diretiva 2010/63/UE CEE para experimentos com animais e revisados e aprovados pelo Comitê de ética para experimentação com animais da Universitat Politècnica de València, Espanha (código de investigação: 2015/VSC/PEA/00170). XGD, FMJ, MPVC e JSV detém um certificado de autorização emitido pela administração governamental Valenciana para experimentar em animais. A XGD está autorizada a supervisionar in situ o bem-estar e o cuidado dos animais durante o experimento.
1. transferência de embriões
<ol><li>Preparação de fêmeas receptoras
	<ol>
<li>Use apenas fêmeas sexualmente maduras (&gt; 4,5 meses de idade).</li>
		<li>Uma semana antes do ET, adaptar as fêmeas a um regime de 16 h Light/8 h escuro para iniciar o crescimento folicular e maior receptividade feminina.</li>
		<li>Selecione as fêmeas destinatárias, observando a turgidez e a cor da vulva. Se a vulva é turgid e avermelhada, a fêmea é receptiva.</li>
		<li>Induzir pseudogravidez (ovulação) por uma única injeção intramuscular de 1 μg de acetato de buserelin (análogo sintético do hormônio liberador de gonadotropina), independentemente do peso corporal. Nota: normalmente, 0,8 μg é uma dose adequada para a indução da ovulação em coelhos de tamanho médio (4-5 kg), pelo que 1 μg geralmente garante a ovulação.</li>
		<li>Induzir a ovulação como muitos dias de antemão como a idade dos embriões a serem transferidos (por exemplo, 70-72 h antes de mórula fresca et).</li>
	</ol></li>
	<li>Anestesia e analgesia
	<ol>
<li>Pesar o coelho e carregar os seguintes anestésicos e analgésicos.<ol>
<li>Numa seringa de 1 ml com uma agulha de 30g: xilazina de carga (5mg/kg) e cloridrato de buprenorfina (0, 3 mg/kg). Em outra seringa de 1 mL com uma agulha pericranial 23G, cloridrato de cetamina de carga (35 mg/kg).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Segure o coelho e injete a mistura de xilazina-buprenorfina por via intramuscular.</li>
		<li>Insira a agulha pericranial com cetamina na veia marginal da orelha, introduzindo lentamente todos os conteúdos da seringa intravenosamente.</li>
		<li>Fixe a agulha e deixe-a inserida durante as restantes etapas para administrar mais anestesia, se necessário.</li>
		<li>Deixe o coelho na gaiola (limpo e sem quaisquer outros animais) em um estágio quente.</li>
		<li>Uma vez inconsciente, aplique pomada ocular para evitar a secura do olho e verificar a ausência do freflex palpebral. Nota: Este protocolo fornece um plano de anestesia cirúrgica para um mínimo de 30 min. Se for necessário mais tempo, injete dosagens adicionais com metade da quantidade de cloridrato de cetamina descrita em 1.2.1 após 30 min.</li>
		<li>Monitore a profundidade da anestesia verificando o reflexo do pedal e o movimento respiratório. Mudanças no padrão respiratório para uma taxa irregular e mais rápida indicam a perda do plano adequado de anestesia.</li>
		<li>Monitore a cor das membranas mucosas (olhos, lábios, etc.), a frequência respiratória (30-60 respirações por minuto), a frequência cardíaca (120-325 batimentos por minuto) e a temperatura retal (38-39,6 ° c).</li>
		<li>Oito horas antes da transferência, reter alimentos de animais para evitar o maior tamanho do intestino e atividade até que o processo de ET é terminado. Deixe o acesso livre à água.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação do embrião
	<ol>
<li>Aqueça a mídia de manipulação do embrião a 25 ° c: Medium base (BM), consistindo de soro fisiológico tamponado com fosfato de Dulbecco (DPBS) suplementado com 0,2% (p/v) de albumina sérica bovina.</li>
		<li>Trabalhando um estereomicroscópio, enxague os embriões frescos ou descongelados (passo 2) com a BM.</li>
		<li>Usando luvas estéreis, prenda um cateter epidural 17G apropriadamente configurado a uma seringa de 1 mL.</li>
		<li>Aspirar 1 cm de BM para o cateter, seguido por uma pequena bolha de ar.</li>
		<li>Aspirar 5-7embriões em um volume de 10 μL de BM, seguido por uma outra bolha de ar pequena.</li>
		<li>Termine de carregar o cateter aspirando 1 cm de BM.</li>
	</ol></li>
	<li>Transferência de embriões
	<ol>
<li>Considere o uso de luvas estéreis, vestido e máscara para garantir um ambiente asséptico.</li>
		<li>Esterilize os instrumentos cirúrgicos, limpe as superfícies onde a cirurgia será executada, e limpe-as com o etanol 70%.</li>
		<li>Realize a anestesia como previamente Detalhado (etapa 1,2), verificando a perda de reflexos.</li>
		<li>Raspar a pele do abdômen ventral com uma navalha elétrica.</li>
		<li>Prepare o abdômen ventral assepticamente.<ol>
<li>Limpe a área cirúrgica e remova todo o cabelo restante. Lave a área cirúrgica com um sabão gluconato de clorexidina. Higienizar a área com solução de clorexidina e etanol 96 º (3 vezes).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Coloc o animal em uma tabela cirúrgica morna, na posição de Trendelenburg (cabeça para baixo em 45 °) para assegurar-se de que o estômago e os intestinos sejam situados cranialmente. Considere a evacuação da bexiga se for turgid. Se qualquer vísceras são danificados no processo, o animal pode morrer. Portanto, é importante tê-los adequadamente localizados (Figura 1).</li>
		<li>Cubra a área usando uma toalha estéril, com um furo (fenestração) expondo a área raspada, para separar o local cirúrgico de todas as áreas contaminando potenciais.</li>
		<li>Insira um trocarte endoscópico de 5 cm na cavidade abdominal, 2 cm caudal ao processo xifóide, e insuflar através dele a cavidade peritoneal com um insuflador mecânico regulador de pressão. Nota: a pressão intra-abdominal deve ser de 8-12 mmHg com CO2 (Figura 1a).</li>
		<li>Inserir a câmara do endoscópio através do trocarte endoscópico (Figura 1b). Nota: identifique o trato reprodutivo, determinando o estado e a posição do infundíbulo e da ampola antes do ET para facilitar os próximos passos.</li>
		<li>Insira a agulha peridural 17-G na região inguinal entre 2-3 cm do infundíbulo (Figura 1b).</li>
		<li>Identifique a entrada do infundíbulo (Figura 2a, 2B).</li>
		<li>Insira o cateter carregado (passo 1,3) através da agulha epidural no abdômen (Figura 1C).</li>
		<li>Localize o oviduto e insira 1-2 cm do cateter epidural através do infundíbulo na ampola (Figura 2a-2C). Não progrida muito longe no oviduto para evitar danos e hemorragia.</li>
		<li>Solte os embriões no oviduto pressionando suavemente o êmbolo da seringa acoplado ao cateter (Figura 2D-2F). Ambas as bolhas de ar devem sair do cateter.</li>
		<li>Retire o cateter logo após os embriões terem sido liberados.</li>
		<li>Enxágüe o cateter, aspirando e liberando o meio de manipulação para verific a ausência dos embriões e confirme sua transferência bem sucedida.</li>
		<li>Repita os passos 1.4.11 para 1.4.16 no outro lado do útero, se desejado.</li>
		<li>Retire a agulha epidural e a câmara do endoscópio.</li>
		<li>Liberação CO2 através do trocarte endoscópico. Se o excesso de gás permanece no abdômen do animal, ele terá dor e desconforto.</li>
		<li>Retire o trocarte endoscópico da cavidade abdominal. Retire a toalha cirúrgica.</li>
		<li>Interrompa a anestesia.</li>
		<li>Limpe a incisão feita pelo trocarte com solução de clorexidina. Fechar a incisão feita pelo trocarte com um alumínio micronizado e um curativo de plástico.</li>
	</ol></li>
	<li>Cuidados pós-operatórios
	<ol>
<li>Trate os animais com antibióticos: 10 mgs/quilograma de enrofloxacin, subcutaneously, cada 24-h por 5 dias.</li>
		<li>Administrar analgésicos: cloridrato de buprenorfina (0, 3 mg/kg), intramuscularmente, a cada 12 horas durante 3 dias; Meloxicam (0,2 mg/kg), subcutaneamente, a cada 24-h durante 3 dias.</li>
		<li>Monitorizar os animais durante pelo menos 30 minutos após a cirurgia (dependendo do animal e da dose de anestesia utilizada) certificando-se de que recuperam as suas condições fisiológicas.</li>
		<li>Identifique o receptor (por exemplo, tatuagem de orelha) e os animais da casa individualmente em uma gaiola limpa com a condição ambiental apropriada.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58055/58055fig1.jpg"> Figura 1: transferência de embriões laparoscópicos assistida por laparoscopia (visão externa). A ) inserção do trocarte endoscópico (um porto). B) inserção da câmara endoscópica e da agulha peridural (seta preta). C) inserção do cateter de transferência do embrião (seta branca) através da agulha epidural. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58055/58055fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58055/58055fig2.jpg"> Figura 2: transferência de embriões laparoscópicos assistida por laparoscopia (visão interna). A: Inserção do cateter através da agulha epidural na zona abdominal. Asterisco indica o infundibulum. B, C, D: O cateter carregado com os embriões é introduzido na região de ampulla através do infundibulum. E, F: Liberação dos embriões, confirmado pela visualização de um oviduto inchado. Este número foi adaptado de Marco-Jiménez et al. 38. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58055/58055fig2large.jpg" target="_blank">Please clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
2. vitrificação e aquecimento embrionário
<ol><li>Realize todas as manipulações à temperatura ambiente (cerca de 22 ° c) para reduzir a toxicidade da solução de vitrificação em temperaturas mais quentes. Nota: os embriões podem ser movidos usando 0.1-2 μL de pipeta automática neste protocolo, mas outros dispositivos similares para mover os embriões arrastando o volume mínimo podem ser adequados.</li>
	<li>Vitrificar os embriões em um procedimento de adição em duas etapas:<ol>
<li>Coloque os embriões por 2 minutos em solução equilibrada consistindo de 10% (v/v) etileno glicol e 10% (v/v) dimetil sulfóxido dissolvido em BM.</li>
		<li>Mova os embriões (da etapa 2.2.1) para 1 minuto na solução da vitrificação que consiste em 20% (v/v) etileno glicol e 20% (v/v) dimetil sulfóxido dissolvido em BM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque os embriões em um ministraw plástico de 125 μL (que contenha uma extremidade fechada com um plugue do algodão e um extremo aberto). O processo é esquematizado na Figura 3.<ol>
<li>Acople o fim fechado de 0,125 μl ministraw com o pipetas apropriado (por exemplo captroll III®).</li>
		<li>Aspirar BM até 1/3 do comprimento da palha, seguindo por uma pequena bolha de ar.</li>
		<li>Aspirar os embriões num volume de 40 μL de solução de vitrificação, seguidos por outra pequena bolha de ar.</li>
		<li>Aspirar BM até a primeira fração líquida (etapa 2.3.2) atinge o algodão.</li>
		<li>Feche a extremidade aberta com um plugue de palha.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Execute a etapa 2.2.2 enquanto o passo 2,3 está sendo feito para garantir que não mais de um minuto decorrido, o que seria tóxico para os embriões.</li>
	<li>Mergulhe o ministraw diretamente no nitrogênio líquido para conseguir a vitrificação.</li>
	<li>Armazene o ministraw em um Dewar para o nitrogênio para o tempo desejado.</li>
	<li>Descongelar os embriões em um único passo.<ol>
<li>Coloc o ministraw horizontalmente 10 cm do vapor líquido do nitrogênio para 20-30 s.</li>
		<li>Quando o processo de cristalização começa dentro do ministraw, mergulhe o ministraw em um banho de água a 25 ° c para 10-15 s.</li>
		<li>Retire o plugue ministraw e corte o plugue de algodão.</li>
		<li>Com um microdispenser acoplado, expelir todo o conteúdo ministraw em uma placa contendo 0,33 M de solução de sacarose a 25 ° c em BM por 5 minutos. Nota: esta etapa deve ser feita rapidamente a fim reduzir a exposição do embrião à solução da vitrificação.</li>
		<li>Mova os embriões para uma nova placa contendo a solução BM por mais 5 min.</li>
		<li>Considere apenas embriões não danificados (com revestimento de mucina intacta e zona pellucida) para continuar com o ET. Nota: levar em conta que em embriões descongelados, transferências assíncronas (por exemplo, 60-62 h em transferências de mórula) podem melhorar os resultados, permitindo uma ressincronização entre o embrião e o endométrio materno.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58055/58055fig3.jpg"> Figura 3: esquematização da palha corretamente carregada. A ) BM refere-se ao embrião que manipula a mídia empregada durante a vitrificação. Os embriões devem ser carregados em solução de vitrificação. B) aspecto macroscópico da palha carregada com um detalhe ampliado da posição embrionária. Este dispositivo de grande volume nos permite vitrificar grande número de embriões, ao contrário de dispositivos de volume mínimo. Além disso, o manuseio deste dispositivo é mais fácil em comparação com os dispositivos de volume mínimo, enquanto os resultados são semelhantes em coelhos41. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58055/58055fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Os autores não têm nada a revelar.

Desde o primeiro caso de nascimento documentado ao vivo de embriões transferidos9, esta técnica e as espécies de coelhos tornaram-se cruciais em estudos reprodutivos. Além disso, estudos de pesquisa de embriões envolvendo manipulação, produção, criopreservação, etc. exigem como último passo a avaliação da capacidade embrionária para gerar progênies saudáveis a termo. Portanto, a técnica de transferência de embriões é indispensável13,28<...

Com os objetivos de contornar a infertilidade humana ou melhorar a disseminação de gado de alto valor genético e preservar os recursos genéticos animais, um conjunto de técnicas denominadas coletivamente tecnologias de reprodução assistida, como a superovulação, em fertilização in vitro , cultura embrionária ou criopreservação, foram desenvolvidas1,2. Atualmente, tratamentos hormonais são administrados para estimular os ovários e produzir um grande número de folículos ovarianos antrais1. Os oócitos coletados desses folículos podem ser amadurecidos, fertilizados e desenvolvidos in vitro até serem criospreservados ou transferidos para mães substitutas3. Entretanto, durante esses tratamentos, os gâmetas e os zigitos são expostos a uma série de processos não fisiológicos que podem requerer a adaptação embrionária para sobreviver nessas condições4,5. Esta adaptação é possível devido à plasticidade embrionária precoce, que permite alterações embrionária na expressão gênica e programação do desenvolvimento6. No entanto, essas modificações podem influenciar os estágios subsequentes do desenvolvimento embrionário até a idade adulta, e agora é amplamente aceito que métodos, cronometragem, procedimento de criopreservação ou condições de cultura mostram resultados diferentes sobre o destino do embrião7 , 8. Conseqüentemente, para elucidar os efeitos induzidos específicos das artes, o uso de modelos animais well-caracterizados é inevitável.
O primeiro nascimento vivo documentado resultante da transferência de embriões mamíferos ocorreu em 18909. Hoje, a transferência de embriões (ET) para uma fêmea substituta é um passo crucial no estudo dos efeitos induzidos pela arte durante o pré-implante em estágios subsequentes de desenvolvimento embrionário10. As técnicas de ET dependem do tamanho e da estrutura anatômica de cada animal. No caso de modelos animais de grande porte, foi possível realizar ET por técnicas de ET não-cirúrgicas transcervicais, mas no cateterismo de espécies de menor porte do colo do útero é mais complexa e as técnicas cirúrgicas são freqüentemente utilizadas11. No entanto, o ET cirúrgico pode causar hemorragia que pode prejudicar a implantação e o desenvolvimento embrionário, pois o sangue pode invadir o lúmen uterino, causando morte embrionária10. Técnicas transcervicais e não cirúrgicas ainda são aplicadas em humanos, babuínos, bovinos, suínos e camundongos12,13,14,15,16,17, mas cirúrgicas Os ETs ainda estão sendo usados em espécies como caprinos, ovinos ou outros animais que apresentam dificuldades adicionais10,18,19,20,21, como coelhos (dois independentes) ou camundongos (tamanho pequeno). No entanto, os métodos de transferência cirúrgica tendem a ter sido gradualmente substituídos por métodos menos invasivos. A endoscopia foi utilizada para transferir embriões, por exemplo, em coelhos, suínos e pequenos ruminantes18,19,20. Estes métodos de endoscopia minimamente invasivos podem ser utilizados para transferir embriões para a ampola através do infundíbulo, que é essencial em coelhos e demonstrou efeitos benéficos em algumas espécies20. Isto é baseado na importância do diálogo correto entre o embrião e a mãe durante estágios adiantados do embrião no oviduct. Como mencionado acima, o remodelamento embrionário que ocorre em coelhos durante a migração embrionária através do oviduto é essencial para a obtenção de embriões capazes de implantar22,23.
Modelos animais de maior tamanho, como bovinos, são interessantes porque as características bioquímicas e pré-implante são semelhantes às da espécie humana24. No entanto, grandes animais são muito caros para uso em ensaios preliminares, e roedores são considerados um modelo ideal (76% organismos modelo são roedores) para pesquisa laboratorial25. No entanto, o modelo do coelho fornece algumas vantagens sobre roedores em estudos reprodutivos, como alguns processos biológicos reprodutivos expostos por seres humanos são mais semelhantes em coelhos do que aqueles em camundongos. Humanos e coelhos apresentam uma ativação do genoma embrionário cronológico semelhante, gastrulação e estrutura da placenta hemocorial. Além disso, usando coelhos é possível saber o momento exato da fertilização e estágios de gravidez devido à sua ovulação induzida25. Os ciclos de vida do coelho são curtos, completando a gestação em 31 dias e atingindo a puberdade em cerca de 4-5 meses; o animal é fácil de manusear devido ao seu comportamento dócil e não agressivo, e sua manutenção é muito econômica em comparação com a despesa de animais maiores. Além disso, é crucial mencionar que os coelhos têm um útero duplex com dois Cervixes independentes11,12. Isso coloca o coelho em uma posição preferencial, como os embriões dos diferentes grupos experimentais podem ser transferidos para o mesmo animal, mas em um chifre uterino diferente. Isso nos permite comparar ambos os efeitos experimentais, reduzindo o fator materno dos resultados.
Hoje, os métodos de ET não cirúrgicos não estão em uso no coelho. Alguns estudos realizados no final dos anos 90 utilizando uma técnica de et transcervical resultaram em baixas taxas de entrega variando de 5,5% a 20,0%11,12 versus 50-65% por métodos cirúrgicos, entre eles o procedimento de laparoscopia descrito por Besenfelder e Brem18. As baixas taxas de sucesso desses métodos de ET não cirúrgicos em coelhos coincidem com a falta de remodelação embrionária necessária no oviduto, o que é evitado em ET transcervical. Aqui, nós descrevemos um procedimento Laparoscopic minimamente invasor eficaz do ET usando coelhos como um organismo modelo. Esta técnica fornece um modelo para a pesquisa reprodutiva mais adicional em animais e em seres humanos grandes.
Como os coelhos têm uma janela de tempo particularmente estreita para a implantação de embriões, a ET nesta espécie requer um alto grau de sincronia entre o estágio de desenvolvimento do embrião no ET e o estado fisiológico do receptor27. Em alguns casos, após um tratamento reprodutivo que retarda o desenvolvimento embrionário (como a cultura in vitro ) ou altera a receptividade endometrial (como os tratamentos de superovulação), não há sincronia entre o embrião e o útero materno. Essas situações podem afetar negativamente o desfecho. Para responder nesses contextos, descrevemos um protocolo de vitrificação de mórula de coelho eficaz que nos permite pausar, organizar e retomar os experimentos. Este processo é logisticamente desejável para estudos reprodutivos e nos dá a capacidade de armazenamento a longo prazo de embriões, permitindo o seu transporte. O procedimento laparoscópico e as estratégias de criopreservação permitem melhor planejamento de estudos com menos animais. Assim, nossa metodologia oferece vantagens higiênicas e econômicas e está em conformidade com o conceito de 3Rs (substituição, redução e refinamento) da pesquisa animal com o objetivo declarado de melhorar o tratamento humano de animais experimentais. Assim, com estes métodos, os coelhos constituem um organismo modelo ideal para ensaios in vivo reprodutivos.

<table><tbody><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>VWR</td><td>332</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de buprenorfina</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>626</td><td>A encomendar por um veterinário autorizado.</td></tr><tr><td>Acetato de Buserelina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B3303</td><td></td></tr><tr><td>Sabonete de digluconato de clorexidina</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>0265DCCJ500B</td><td></td></tr><tr><td>Solução de digluconato de clorexidina</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>0265DCCA500B</td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>Air Liquide</td><td>99921</td><td>CO2 N48.</td></tr><tr><td>Incubadora de CO2</td><td>Fisher scientific</td><td>15385194</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido Sigma</td><td>Aldrich</td><td>W387509</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s solução salina tamponada com fosfato (DPBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5773</td><td>Sem cloreto de cálcio.</td></tr><tr><td>Barbeador elétrico</td><td>Oster Golden A5</td><td>078005-140-002</td><td></td></tr><tr><td>Câmera endoscópica</td><td>Optomic Spain S.A</td><td>OP-714</td><td></td></tr><tr><td>Endoscópio trocarte com válvula de folheto de silicone</td><td>Karl Storz Endoscopia Ib&eacute; rica S.A.</td><td>30114GK</td><td>Modelo de trocarte leve.</td></tr><tr><td>Enrofloxacina</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>9993046</td><td>A encomendar por um veterinário licenciado.</td></tr><tr><td>Agulha epicraneal 23G</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>514056353</td><td>Agulhas menores também podem ser usadas.</td></tr><tr><td>Cateter epidural</td><td>Vygon corporate</td><td>187.10</td><td></td></tr><tr><td>Agulha epidural</td><td>Vygon corporate</td><td>187.10</td><td></td></tr><tr><td>Etilenoglicol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>102466-M</td><td></td></tr><tr><td>Pomada para os olhos</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>5273</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de cetamina</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>184</td><td>A encomendar por um veterinário licenciado.</td></tr><tr><td>Equipamento de laparoscopia</td><td>Karl Storz Endoscopia Ib&eacute; rica S.A.</td><td>26003 AA</td><td>Hopkins&reg; Laparoscópio, laparoscópio de 0 mm de visão reta, 30 cm de comprimento, canal de trabalho de 5 mm.</td></tr><tr><td>Fonte de luz</td><td>Optomic Spain S.A</td><td>Fibrolux 250</td><td></td></tr><tr><td>Nitrogênio Líquido</td><td>Air Liquide</td><td>P1505XXX</td><td></td></tr><tr><td>Insuflador Mecânico de CO2</td><td>Karl Storz Endoscopia Ib&eacute; rica S.A.</td><td>Endoflator&reg;</td><td></td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>9993501</td><td>A encomendar por um veterinário licenciado.</td></tr><tr><td>Placas de Petri, 35-mm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS430165-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Curativo de plástico (Nobecutan)</td> <td>IBOR medica</td><td>7140028</td><td></td></tr><tr><td>Canudo de plástico 0,25 mL</td><td>IMV - tecnologias</td><td>6431</td><td></td></tr><tr><td>Solução de iodeto de povidona</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>02656DPYS500S</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5880</td><td>Qualquer tesoura reta de aço de grau cirúrgico regular funcionará.</td></tr><tr><td>Tubo de silicone para insuflador</td><td>Karl Storz Endoscopia Ib&eacute; rica S.A.</td><td></td><td></td>20400040</tr><tr><td>Estereomicroscópio</td><td>Leica</td><td>MZ16F</td><td>Existem opções mais baratas, como Leica MZ8 ou Nikon SMZ-10 ou SMZ-2B, para citar algumas.</td></tr><tr><td>Luvas Estéreis</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>087GL010075</td><td></td></tr><tr><td>Bata estéril</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td></td><td></td>12261501</tr><tr><td>Máscara estéril</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>058B15924B</td><td></td></tr><tr><td>Straw Plug</td><td>IMV - technologies</td><td>6431</td><td></td></tr> Seringa de <tr><td>sacarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr>, seringa <tr><td>de 11750425</td><td></td><td>científica</td><td>Fisher de 1 mL</td></tr>, sonda vesical <tr><td>de 11773313</td><td></td><td>científica Fisher</td><td>de 5 mL</td></tr><tr><td></td><td>IMV - technologies</td><td>17722</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>RAYPA</td><td>BAE-4</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina</td><td>Alvet Escart&iacute;</td><td>525225</td><td>A ser encomendado por um veterinário licenciado.</td></tr><tr><td>Coelhos</td><td>Universitat Polit&egrave; cnica de Val&egrave; </td><td>ncia Linha A</td><td>Outras linhas maternas, como Linha V ou Linha HP, podem ser usadas.</td></tr></tbody></table>

transferência de embriões minimamente invasivos e vitrificação embrionária na fase de embrião ideal em modelo de coelho

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Técnicas reprodutivas assistidas (ARTs), como cultura embrionária in vitro ou criopreservação embrionária, afetam os padrões de desenvolvimento natural com conseqüências perinatais e pós-natais. Para garantir a inocuidade das aplicações de arte, são necessários estudos em modelos animais. Além disso, como último passo, estudos de desenvolvimento embrionário necessitam de avaliação de sua capacidade de desenvolver progênies saudáveis a termo. Aqui, a transferência de embriões para o útero é indispensável para realizar qualquer experimento relacionado a artes.
O coelho tem sido usado como um organismo modelo para estudar a reprodução de mamíferos há mais de um século. Além de sua proximidade filogenética com a espécie humana e seu pequeno tamanho e baixo custo de manutenção, tem características reprodutivas importantes, como a ovulação induzida, uma cronologia do desenvolvimento embrionário precoce semelhante aos humanos e uma curta gestação que nos permitem estudar facilmente as conseqüências da aplicação ART. Além disso, as artes (tais como a injeção intracytoplasmic do esperma, a cultura do embrião, ou a criopreservação) são aplicadas com eficiência apropriada nesta espécie.
Usando a técnica de transferência de embriões laparoscópica e o protocolo de criopreservação apresentado neste artigo, descrevemos 1) como transferir embriões através de uma técnica fácil, minimamente invasiva e 2) um protocolo eficaz para armazenamento a longo prazo de coelhos embriões para proporcionar capacidades logísticas flexíveis no tempo e a capacidade de transportar a amostra. Os desfechos obtidos após a transferência de embriões de coelhos em diferentes estágios de desenvolvimento indicam que a mórula é o estágio ideal para recuperação e transferência de embriões de coelhos. Assim, é necessária uma transferência de embriões oviductais, justificando o procedimento cirúrgico. Além disso, as mórulas do coelho são vitrificadas com sucesso e transferidas laparoscopically, provando a eficácia das técnicas descritas.

A transferência laparoscópica minimamente invasiva de embriões frescos ou vitrificados coloca o coelho entre os melhores animais modelo para estudos reprodutivos. A tabela 1 mostra os resultados do et fresco em diferentes estágios de desenvolvimento (Figura 4) dos embriões transferidos. A taxa de sobrevida ao nascimento (percentual de embriões resultando em um filhote) provou a eficácia da técnica laparoscópica descrita neste trabalho. Os val...

As técnicas reprodutivas assistidas (ARTs) estão em avaliação contínua para melhorar os resultados e reduzir os riscos associados. Este manuscrito descreve um procedimento de transferência de embriões minimamente invasivo com um protocolo de criopreservação eficiente que permite o uso de coelhos como um modelo animal ideal de reprodução humana.

Transferência de embriões minimamente invasivos e vitrificação embrionária na fase de embrião ideal em modelo de coelho

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

O principal objetivo deste experimento é descrever um procedimento de transferência de embrião laparoscópico em coelho como modelo. A principal vantagem dessa técnica é que esta trabalha para transferir embriões usando uma técnica fácil e minimamente invasiva. Além disso, o protocolo eficaz de criopreservação de embriões aqui descrito também funciona para armazenar a longo prazo os embriões de coelho, fornecendo capacidades logísticas flexíveis de tempo e a capacidade de transportar a amostra.Como sabemos, as tecnologias de reprodução assistida estão em avaliação contínua para melhorar os resultados e reduzir os riscos associados. Portanto, utilizando ambas as técnicas, o coelho pode ser usado como um modelo animal ideal de reprodução humana para responder a questões-chave neste campo, como os efeitos da manipulação in vitro de embriões na prole. A demonstração visual dessas questões é fundamental, pois as etapas de transferência de embriões são difíceis de aprender, pois devem ser feitas com grande precisão para garantir o sucesso da técnica.Para vitrificação embrionária, mergulhe os embriões em solução de equilíbrio por dois minutos, seguido de uma incubação de um minuto na soluç

minimally-invasive-embryo-transfer-embryo-vitrification-at-optimal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Uma etileno glicol baseado em método de vitrificação para embriões de camundongos é descrito. É vantajoso para outros métodos, em sua simplicidade e toxicidade embrionária baixo e, portanto, pode ser amplamente aplicável a muitas cepas de camundongos, incluindo camundongos isogênicos e gene modificado.

Criopreservação de embriões de camundongos por Vitrificação Etileno Glicol-Based

Neste vídeo, descrevemos o procedimento de vitrificação de embriões de coelho colhidos no estágio de desenvolvimento desejado usando etilenoglicol e dimetilsulfóxido como crioprotetores e palha criogênica como sistema de transporte. Os embriões vitrificados têm alta taxa de sobrevivência e podem ser armazenados por um longo período até o uso.

Vitrificação de embriões de coelho usando palha criogênica: uma técnica de resfriamento ultrarrápido para preservar embriões de coelho para armazenamento a longo prazo

Este vídeo demonstra o procedimento para descongelar embriões de coelho vitrificados e as etapas de medição preventiva para a recuperação ideal do embrião.

Descongelamento de embriões de coelho: um procedimento de aquecimento para recuperar embriões de coelho criopreservados para transferência de embriões

Este vídeo descreve a técnica de transferência de embriões para o oviduto de uma coelha receptora por meio de laparoscopia. Permite a remodelação embrionária em coelhos durante sua migração através do oviduto, eventualmente ajudando na implantação bem-sucedida. Esta técnica também pode ser usada para embriões armazenados com boa eficiência.

Transferência de embriões para coelhos: um procedimento para transferência de embriões guiada por laparoscopia para oviduto de modelo de coelho fêmea receptora ovulante

Desenvolvimento recente no gene ferramentas que visam torna a produção de knockout (KO) coelhos possível. No presente trabalho, geramos cinco coelhos apolipoproteína (Apo) C-III KO usando Nucleases dedo de zinco (ZFN). Este trabalho demonstrou que ZFN é um método altamente eficiente para a produção de coelhos KO.

Produção de Coelhos Knockout apolipoproteína C-III, utilizando zinco Nucleases dedo

Transferência de embrião tubário utero-usa a junção útero-tubária como uma barreira para impedir a saída de embriões que podem ocorrer quando se realiza a transferência uterina. Machos vasectomizados são obrigados a obter destinatários pseudográvidas para transferência de embriões. Ambas as técnicas são discutidas.

Transferência de Embrião Utero-tubária e vasectomia no Rato Modelo

MicroSecure Vitrification foi desenvolvido como um sistema de dispositivo de vitrificação fechado asséptico não comercial que está em conformidade com as boas práticas de fabricação e manuseio de tecidos da FDA. Devido à retirada de canudos de embriões com tamponamento hidrofóbico da indústria, o procedimento de vitrificação foi modificado para incluir uma vedação interna antes do tampão de algodão interno padrão.

Modificada Vitrificação MicroSecure: Um Altamente procedimento seguro, simples e eficaz para Criopreservação blastócitos humanos

A biópsia e a vitrificação do Blastocyst são exigidas para conduzir eficientemente o teste genético do pré-implante. Uma aproximação que implica a abertura seqüencial da zona pelúcida e a recuperação de 7-8 pilhas do trofectoderma no dia 5-7 pós-inseminação limita o número de manipulações exigidas e a exposição do embrião às condições ambientais suboptimal.

Biópsia e vitrificação humana do Blastocyst

Este protocolo descreve metodologias para estabelecer um modelo simples e eficiente de implantação embrionária in vitro para avaliar as moléculas relevantes que afetam o processo de implantação embrionária.

Estabelecimento de um Modelo de Implantação Embrionária In Vitro

Este protocolo descreve uma técnica de gerenciamento de gravidez e alimentação para coelhos transferidos por embriões e geneticamente modificados, com o objetivo de reduzir a mortalidade de coelhos recém-nascidos e aumentar a eficiência de preparação de coelhos editados por genes.

Manejo da Gravidez e Amamentação para Coelhos Transferidos com Embriões e Geneticamente Modificados

Aqui, apresentamos o protocolo Spatula Montevideo para vitrificação de embriões pré-implantacionais de camundongos e ovelhas, consistindo em uma espátula caseira e utilizando soluções caseiras. Os embriões são rapidamente equilibrados em duas soluções crioprotetoras de concentração crescente, carregadas na espátula, imersas em nitrogênio líquido e, finalmente, seladas com um canudo de 0,5 mL.

Espátula Montevidéu Dispositivo para vitrificação de embriões de mamíferos

Aprenda a técnica de transferência embrionária laparoscópica minimamente invasiva em coelhos, incluindo o protocolo de vitrificação para armazenamento de longo prazo. Este método avança pesquisas em biologia reprodutiva.

Transferência de embriões minimamente invasivos e vitrificação embrionária na fase de embrião ideal em modelo de coelho

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