A identificação das feromonas de lampreia do mar usando guiada por bioensaio fracionamento

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da ecologia química, como a identificação de feromônios. A principal vantagem dessa técnica é que ela liga novos compostos à função do feromônio. Para iniciar este procedimento, coloque 15-30 lampreias marinhas machos sexualmente maduros em um tanque abastecido com 250 litros de água aerada do Lago Huron, mantida a 16-18 graus Celsius.

Para extrair a água condicionada por extração em fase sólida, passe-a do tanque através do sistema de bombeamento para o topo da coluna. A água passa por um leito de dois quilos de resina polimérica de troca iônica moderadamente polar, contida em uma série de quatro colunas de vidro com capacidade de um litro. Em seguida, remova o solvente orgânico e colha o extrato por evaporação rotativa por cinco horas sob pressão reduzida a 40 graus Celsius.

Para isolar as reservas de frações, mergulhe o gel de sílica na fase móvel inicial por 30 minutos. Transfira o gel com o solvente para uma coluna de vidro e abra sua válvula para permitir a passagem da fase móvel. Em seguida, misture bem os extratos com sílica gel e coloque-os na coluna de cromatografia líquida sobre o leito de sílica gel.

Eluva-os com um gradiente de 95% de clorofórmio para metanol a 100% de metanol, resultando em um total de 2,5 litros e, em seguida, colete o eluente em frascos individuais de 10 mililitros. Em seguida, realizar o experimento TLC em placas de sílica gel pré-revestidas, aplicando a amostra na linha de partida e imergindo a linha de partida da placa no solvente revelador em um tanque de vidro selado. Depois que o solvente revelador atingir a linha final, retire a placa do tanque e aguarde 10 minutos para que o solvente evapore.

Visualize as manchas, primeiro sob luz ultravioleta a 254 nanômetros, depois manche a placa borrifando-a com uma solução ácida de metanol de 5% de anisaldeído usando um pulverizador de cromatografia e aquecendo-a a 85 graus Celsius por três minutos. Em seguida, concentrar a fracção num resíduo por evaporação rotativa sob pressão reduzida a 40 graus Celsius durante cerca de 30 minutos. Para realizar o registro EOG, encha os eletrodos capilares polares e os suportes de eletrodos de estado sólido, pré-fabricados com pastilhas de cloreto de prata-prata, com cloreto de potássio de três molares usando uma micropipeta.

Em seguida, insira os eletrodos polarizados nos suportes dos eletrodos. Em seguida, prepare 100 mililitros de L-arginina de 10 a cinco molares negativos em água filtrada com carvão de uma solução estoque de L-arginina de 10 a dois molares negativos em água deionizada em um balão volumétrico. Para a curva de resposta à concentração, preparar 10 mililitros de diluições de 10 vezes dos conjuntos de frações.

Agora, oriente uma lampreia anestesiada em um suporte em forma de V e envolva-a com uma toalha de papel molhada para evitar a dessecação. Insira um tubo de água aerada recirculante contendo 50 miligramas por litro de MS222 na cavidade bucal. Ajuste a taxa de fluxo e certifique-se de que a água esteja saindo pelas aberturas branquiais para irrigar continuamente as brânquias.

Lave o tubo de fornecimento de odor com água filtrada e conecte-o à válvula montada em um micromanipulador. Em seguida, coloque o tubo capilar de entrega de odor na cavidade do epitélio olfatório para fornecer água filtrada ao epitélio olfatório para evitar a dessecação quando não estiver administrando odorantes. Em seguida, monte os eletrodos de registro e referência nos micromanipuladores.

Abaixe o eletrodo de referência na pele externa perto das narinas. Usando o microscópio estereoscópico, abaixe o eletrodo de registro para mal tocar a superfície do epitélio olfatório. Em seguida, transferir a absorção do tubo de libertação de odor da água filtrada de fundo para a solução de L-arginina de 10 para menos cinco molares.

Ligue o computador, amplificador, filtro e digitalizador. Usando o software do driver da válvula, programe o procedimento para administrar um único pulso de odorante de quatro segundos marcando a caixa de T1, ajustando T para quatro segundos e marcando a caixa de T2.In o software de aquisição de dados, defina o modo de aquisição para um osciloscópio de alta velocidade. Clique no ícone Reproduzir e, em seguida, clique em Iniciar no driver da válvula para acionar o pulso odorante.

Comece a registrar o controle em branco, L-arginina e, em seguida, os odores de baixas a altas concentrações com uma lavagem de dois minutos de água filtrada entre as aplicações. Para identificar frações comportamentalmente ativas, aclimate a lampreia marinha fêmea sexualmente madura na gaiola de liberação no labirinto por cinco minutos. Solte a lampreia marinha e registre a quantidade cumulativa de tempo que a lampreia passa no canal experimental e de controle, cada um contendo água do rio, por 10 minutos.

Em seguida, aplique o estímulo de teste ao canal experimental atribuído aleatoriamente no veículo ao canal de controle usando bombas peristálticas a taxas constantes de 200 mililitros por minuto por cinco minutos, depois aplique o estímulo de teste no veículo por mais 10 minutos e registre a quantidade cumulativa de tempo que a lampreia passa nos canais experimentais e de controle. Neste procedimento, purifique ainda mais as frações ativas em compostos com cromatografia de exclusão de tamanho usando uma coluna sephadex LH-20. Prepare a amostra em 0,5 mililitros da fase móvel inicial, carregando-a na coluna de clorofórmio para metanol e, em seguida, na coluna de metanol, e elua as frações ativas para produzir o composto.

Dissolver e diluir o composto purificado na fase móvel inicial da HPLC para formar uma solução de 10 microlitros de aproximadamente um micrograma por mililitro. Em seguida, transfira a solução de amostra para os frascos de HPLC e coloque-os no amostrador automático de HPLC. Injete a amostra na espectrometria de massa de ionização por eletrospray e registre os espectros de espectrometria de massa de ionização por eletrospray de alta resolução usando um espectrômetro de massa por cromatografia.

Dissolva completamente a amostra nos solventes deuterados selecionados para formar uma solução com uma concentração variando aproximadamente de 0,1 a 10 miligramas por mililitro. Transfira a solução da amostra para um tubo de RMN para registrar os espectros de RMN 1D e 2D em um espectrômetro de RMN de 900 megahertz. Aqui é mostrado um espectrômetro de RMN de 600 megahertz.

Cinco novos feromônios putativos de lampreia marinha foram identificados e suas estruturas foram elucidadas com métodos espectrométricos e espectroscópicos. Esses feromônios putativos foram estimuladores do epitélio olfatório da lampreia marinha adulta e tiveram baixos limiares de detecção em registros de eletro-olfatograma. Nos ensaios comportamentais do labirinto de duas escolhas, lampreias marinhas fêmeas ovuladas foram atraídas para Petromyzone A, Petromyzene A e Petromyzene B, e repelidas de Petromyzone C. Ao tentar este procedimento interdisciplinar, é importante lembrar de coordenar os experimentos químicos e biológicos para realizar este protocolo iterativo.

Após este procedimento, outros métodos como cristalografia de raios-X e reações de derivatização podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a estereoquímica dos compostos. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de produtos naturais e neuroetologia explorarem a biossíntese plausível e a função biológica dos feromônios em organismos aquáticos como a lampreia marinha. Não se esqueça de que trabalhar com clorofórmio pode ser extremamente perigoso e precauções, como trabalhar com capuz químico, usar luvas e óculos de segurança, devem sempre ser tomadas ao manusear este reagente.