Name: A identificação das feromonas de lampreia do mar usando guiada por bioensaio fracionamento (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Aprenda a identificar feromonas em lampreias-do-mar usando extração em fase sólida e cromatografia. Este método vincula compostos novos à função feromonal, auxiliando pesquisas em ecologia química e neuroetologia.

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Agradecemos a US Geological Survey Hammond Bay estação biológica para a utilização das suas instalações de pesquisa e o pessoal dos EUA peixe e serviço de vida selvagem e pesca e oceanos Canadá para fornecer lampreias do mar. Esta pesquisa foi apoiada por subsídios da Comissão da pesca dos grandes lagos para Weiming Li e Ke Li.

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Os autores não têm nada para divulgar.

Peixes vivos num mundo químico cheio de compostos ainda não identificados. Fracionamento de bioensaio guiadas provou essencial para identificar e caracterizar moléculas bioativas que medeiam muitas interações químicas, tais como aqueles observados em masu salmão31elefantes asiáticos32e lampreias do mar33, 34,35. Fracionamento de bioensaio guiada é uma abordagem eficaz para rastrea...

Os Pheromones são sinais químicos específicos lançados por indivíduos que ajudam-los em localizar fontes de alimentos, detecção de predadores e mediando as interações sociais de coespecíficos1. Comunicação de feromônio de insetos tem sido bem estudados2; no entanto, a identificação química e função biológica de feromônios de vertebrados aquáticos não foram estudados como extensivamente. Conhecimento da identidade e função dos feromônios liberados podem ser aplicadas para facilitar a recuperação de espécies ameaçadas,3,4 ou controle de pragas espécie5,6. A aplicação destas técnicas exige o isolamento e caracterização dos componentes bioativos de feromônio.
Identificação de feromônio é um ramo da química de produtos naturais. Progresso na pesquisa de feromônio tem sido parcialmente limitado devido à natureza das moléculas do pheromone próprios. Feromônios são muitas vezes instáveis e lançado em pequenas quantidades, e apenas algumas técnicas de amostragem para detectar quantidades minuciosas de voláteis7,8 ou compostos hidrossolúveis9existirem. Abordagens para identificar os pheromones incluem 1) uma seleção de alvo de compostos conhecidos, 2) metabolómica e fracionamento 3) guiada por bioensaio. Uma seleção de alvo de compostos conhecidos testes disponíveis comercialmente subprodutos metabólicos de processos fisiológicos, a hipótese de funcionar como feromônios. Esta abordagem é limitante porque os investigadores só podem testar compostos conhecidos e disponíveis. No entanto, resultou na identificação bem sucedida dos hormônios sexuais no goldfish que funcionam como pheromones10,11,12. Metabolómica é uma segunda abordagem de identificação de feromônio que distingue os produtos metabólicos de potencial pequena molécula dentro de um sistema biológico13. Uma comparação dos perfis metabólicos de dois grupos (ou seja, um ativo contra um extrato inativo) permite a identificação de um perfil metabólico potencial de que o metabólito é purificado, a estrutura é elucidada e a Bioatividade é confirmada14. Efeitos aditivos ou sinérgicos de complexas formulações de misturas específicas são mais prováveis a serem detectadas com metabolomics porque metabólitos são considerados juntos, ao invés de como uma série de frações13. Ainda, a implementação da metabolómica baseia-se na disponibilidade de referências sintéticas porque os dados resultantes não facilitam a elucidação de estruturas novas.
Fracionamento de bioensaio guiada é uma abordagem integrada, iterativa que se estende por dois campos: Biologia e química. Essa abordagem usa os resultados de bioensaios fisiológicos e comportamentais para guiar o isolamento e a identificação de um composto ativo do pheromone. Um extrato bruto é fracionado por uma propriedade química (i.e., tamanho molecular, polaridade, etc.) e testado com gravações de electro-olfactogram (EOG) e/ou em um bioensaio. Os componentes bioativos são selecionados para fora, repita essas etapas de fracionamento e EOGs e/ou bioensaios. As estruturas de compostos ativos puros são elucidadas por métodos espectroscópicos e espectrometria, que fornecem o peso molecular e informações estruturais para produzir um modelo do composto para ser sintetizado. Fracionamento de bioensaio guiada pode produzir diversos metabólitos e potencialmente romance feromônios com esqueletos químicos únicos que não são susceptíveis de ser prevista a partir as vias biossintéticas.
Aqui, descrevemos o protocolo de fracionamento de bioensaio guiada usado para isolar e caracterizar a bioatividade dos compostos de feromônio sexual masculino lampreia do mar. A lampreia (Petromyzon marinus) é um modelo ideal de vertebrados para estudar comunicação feromônio porque estes peixes dependem fortemente de detecção olfativa de sugestões químicas para mediar sua história de vida anádroma composta por três fases distintas: larvas, juvenis e adultos. Larvas de lampreia escavam os sedimentos dos córregos de água doce, sofrem uma drástica metamorfose e transformam em juvenis que migram para um lago ou oceano, onde eles parasitar peixe grande anfitrião. Após desanexação do peixe hospedeiro, os adultos migram volta em fluxos de desova, guiado pelos feromônios migratórios lançados por larvas de fluxo-residente15,16,17,18,19 . Machos maduros ascender para a desova, liberar um feromônio de multi-componentes sexo atrair companheiros, spawn intermitentemente para aproximadamente uma semana, e depois morrer de15,20. A identificação de feromônios lampreia é importante porque uma modulação do sistema de comunicação de feromônio é entre as opções consideradas para controlar as lampreias do mar invasivas no Laurentian grandes lagos21.

<table><tbody><tr><td>Capilares de borossilicato de parede padrão premium com filamento&nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td>G150F-4</td><td>eletrodo de gravação e referência (OD 1,5 mm, ID 0,86 mm)</td></tr><tr><td>Instrumento extrator de pipetas</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td>puxa eletrodos para EOGs</td></tr><tr><td>Cortador de vidro com ponta de diamante</td><td>Ponta de corte genérica</td><td></td><td>de eletrodos para EOG</td></tr><tr><td>Capilares de vidro borossilicato</td><td>Tubo de entrega de odorante</td> <td>World Precision Instruments</td><td>1B150-4</td> para EOG</tr><tr><td>Suporte de eletrodo de gravação Série E corpo reto com pellet Ag/AgCl para capilar de vidro OD 1.5 mm</td> Suporte <td>de eletrodo de gravação</td><td>ESP-M15N</td><td>da Warner Instruments</td></tr><tr><td>Suporte de eletrodo de referência Série E com alça com&nbsp; Pellet Ag/AgCl&nbsp; para capilar de vidro OD 1,5 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>E45P-F15NH</td><td>suporte de eletrodo de referência</td></tr> pino <tr><td>de 1 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>WC1-10</td><td>para ponte de referência e gravação de suportes de eletrodo</td></tr><tr>de<td>2 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>WC2-5</td><td>para ponte de referência e gravação de eletrodos</td></tr><tr><td>Ágar</td><td>Sigma</td><td>A1296</td><td>ágar fundido para encher eletrodos</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio (KCl)</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td>3M KCl para encher eléctrodos e porta-eléctrodos</td></tr><tr><td>Micropipeta microfil</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF28G-5</td><td>para encher eléctrodos e porta-eléctrodos</td></tr><tr><td>L-Arginina</td><td>Sigma</td><td>A5006</td><td>odorizante de controlo positivo para EOG</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>feito à medida</td> N<td>/A</td><td>contém odores para EOG</td></tr><tr><td>éster etílico de ácido 3-aminobenzóico (MS222)</td><td>Syndel USA</td><td>Tricaine1G</td><td>EOG anestésico</td></tr><tr><td>Trietiodeto de gallamina</td><td>Sigma</td><td>G8134-5G</td><td>EOG seringa paralítica</td></tr><tr><td>de 1 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>301025</td><td>para administrar paralítico</td></tr><tr><td>Agulha subcutânea 26G 5/8</td><td>BD Biosciences</td><td>305115</td><td>para administrar paralítico</td></tr><tr><td>Grampo de rolo</td><td>World Precision Instrumentos</td><td>14043-20</td><td>ajustam a taxa de fluxo de anestésico na boca da lampreia</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl)</td> <td>J.T. Baker</td><td>3624-05</td> para preparação de suporte de plástico em forma <td>de V com solução salina a 0,9%</td></tr><tr><td>como estágio de amostra</td><td>N / A</td><td>feito sob medida</td><td>segura lampreia durante</td></tr><tr><td>a calha de plástico</td> EOG <td>N / A</td><td>feito sob medida</td><td>segura suporte de plástico em forma de V durante EOG</td></tr><tr><td>Lâminas de bisturi - # 11</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>10011-00</td><td>para dissecção EOG</td></tr><tr><td>Cabo de bisturi - #3</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>10003-12</td><td>para dissecção EOG</td></tr><tr><td>Pinça ultrafina reta</td> Ferramentas de <td>Ciência Fina</td><td>11252-00</td><td>para dissecção EOG, Pinça de #5SF Dumont</td></tr><tr><td>Pinça ultrafina curva</td> Ferramentas de <td>Ciência Fina</td><td>11370-42</td><td>para dissecção EOG, Tesoura</td></tr> <tr><td></td><td>de Pesca Reta Moria MC40BFerramentas de Ciência Fina</td><td>15003-08</td><td>para dissecção EOG</td></tr><tr><td>Estereomicroscópio</td><td>Zeiss</td><td>Discovery V8</td><td>para dissecção EOG</td></tr><tr><td>Luz iluminadora</td><td>Zeiss</td><td>CL 1500 ECO</td><td>para dissecção EOG</td></tr><tr><td>Tubulação plástica</td><td>Genérico</td><td></td><td>para conectar a configuração EOG de recirculação e banhos-maria</td></tr><tr><td>Tubulação de entrega de odorante</td><td>Personalizado</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>In linha filtro e conjunto de juntas</td><td>Lee Company</td><td>TCFA1201035A</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipuladores</td><td>Narishige</td><td>MM-3</td><td>para posicionar eletrodos e tubo capilar de entrega de odor</td></tr><tr><td>Dispositivos de retenção magnética</td><td>Kanetec</td><td>MB-K</td><td></td></tr><tr><td>Driver de válvula</td><td>Arduino</td><td>feito sob medida</td><td>para controlar a abertura da válvula para estimulação de odor</td></tr><tr><td>Válvula eletromagnética</td><td>Lee Empresa</td><td>LFAA1201618H</td><td>válvula para estimulação de odores</td></tr><tr><td>NeuroLog Amplificador AC/DC</td><td>Digitimer Ltd.</td><td>NL106</td><td>para aumentar a amplitude do pré-amplificador NeuroLog DC de sinal elictrical</td></tr><tr><td>com headstage</td><td>Digitimer Ltd.</td><td>NL102G</td><td>para aumentar a amplitude do sinal elictrical</td></tr><tr><td>Filtro passa-baixa de 60 Hz</td><td>Digitimer Ltd.</td><td>NL125</td><td></td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>Molecular Devices LLC</td><td>Axon Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Computador Dell (OptiPlex 745) executando o software de aquisição de dados Axoscope</td><td>Molecular Devices LLC</td><td>AxoScope versão 10.4</td><td></td></tr><tr><td>Gaiola de Faraday</td><td>personalizada N</td><td>/A</td><td>Blindagem contra ruído eletromagnético</td></tr><tr><td>Labirinto de duas opções</td><td>Personalizado</td> N<td>/A</td><td>madeira compensada de grau marinho impermeabilizada coberta com forro de plástico</td></tr><tr><td>Bomba de lixo</td><td>Honda</td><td>WT30XK4A</td><td>enche labirinto com água do rio próximo</td></tr><tr><td>Bomba peristáltica com tubulação</td><td>Cole Parmer</td><td>Masterflex 07557-00</td><td>para administrar odores no labirinto</td></tr><tr><td>Gerador inversor</td><td>Honda</td><td>EU1000i</td><td>alimenta bomba perstálgica</td></tr><tr><td>Gaiola de liberação</td> N <td>/ A</td><td></td> <td>feito sob medidausado para aclimatar lampreia no labirinto</td></tr><tr><td>Malha</td><td>Genérico</td><td></td><td>usado para conter as dimensões do labirinto e minimizar a turbulência da água com rolos de malha</td></tr><tr><td>Baldes (5 galões)</td><td>Genérico</td><td></td><td>para misturar odores</td></tr><tr><td>Medidor de vazão</td><td>Marsh-McBirney</td><td>Flo-Mate 2000</td><td>para medir a descarga</td></tr><tr><td>Resina XAD 7 HP Dow</td><td>chemical</td><td>37380-43-1</td><td>para extração de água condicionada&nbsp;</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td>para extração de água condicionada&nbsp;</td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>Yamato</td><td>BM 200</td><td>para extração de água condicionada&nbsp;</td></tr><tr><td>Liofilizador</td><td>Labconco</td><td>CentriVap Concentrador</td><td>para extração de clorofórmio de água condicionada</td></tr><tr><td>Sigma</td><td></td><td>CX1050</td><td>para isolamento de piscinas de frações</td></tr><tr><td>Sílica gel 70-230 mesh</td><td>Sigma</td><td>112926-00-8</td><td>para isolamento de piscinas de frações</td></tr><tr><td>Sílica gel 230-400 mesh</td><td>Sigma</td><td>112926-00-8</td><td>para isolamento de piscinas de frações</td></tr><tr><td>Sílica pré-revestida placas de gel TLC</td><td>Sigma</td><td>99571</td><td>para isolamento de piscinas de frações</td></tr><tr><td>anisaldeído</td><td>Sigma</td><td>A88107</td><td>para isolamento de piscinas de frações</td></tr><tr><td>Sephadex LH-20</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0090-01</td><td>para isolamento de piscinas de frações</td></tr><tr><td>Amberlite XAD 7 HP resina</td><td>Sigma</td><td>XAD7HP</td><td>para extração de água condicionada&nbsp;</td></tr><tr><td>4, colunas de vidro da capacidade 2.5L</td><td>Ace Glass Inc.</td><td>5820</td><td>para extração de água condicionada&nbsp;</td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Sigma</td><td>650501</td><td>para extração de água condicionada&nbsp;</td></tr><tr><td>Espectrômetro de massa TQ-S TOF LC (ou equivalente)</td><td>Waters Co.</td><td>N/A</td><td>para elucidação da estrutura</td></tr><tr><td>Bomba de HPLC binária</td><td>Waters Co.</td><td>1525</td><td>para isolamento de reservas/compostos de frações</td></tr><tr><td>Espectrômetro de RMN Agilent, 900MHz (ou equivalente)</td><td>Agilent</td><td>N/A</td><td>para elucidação da estrutura</td></tr><tr><td>Sistema de secagem Rotovap</td><td>Buchi</td><td>RII</td><td>para extração de água condicionada&nbsp;</td></tr><tr><td>Lâmpada UV (254 nm)</td><td>Spectronics Co.</td><td>ENF-240C</td><td>para cromatografia em camada fina&nbsp;</td></tr></tbody></table>

a identificação das feromonas de lampreia do mar usando guiada por bioensaio fracionamento

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

Fracionamento de bioensaio guiada é uma abordagem iterativa que usa os resultados de bioensaios fisiológicos e comportamentais para guiar o isolamento e a identificação de um composto ativo do pheromone. Esse método resultou na caracterização bem sucedida dos sinais químicos que funcionam como pheromones em uma grande variedade de espécies animais. Lampreias do mar dependem de olfato para detectar feromônios que medeiam respostas comportamentais ou fisiológicas. Nós usamos este conhecimento da biologia de peixes para postular funções de feromônios putativos e guiar o isolamento e a identificação dos componentes do feromônio ativo. Cromatografia é usada para extrair, concentrar e separar compostos da água condicionada. Electro-olfactogram (EOG) gravações são conduzidas para determinar quais frações eliciam respostas olfativas. Ensaios comportamentais labirinto 2-escolha são usados para determinar se qualquer uma das frações odoríferas também são comportamentalmente ativo e induzir uma preferência. Métodos de espectroscopia e espectrometria fornecem a informações estruturais para ajudar com a elucidação da estrutura e peso molecular. A bioatividade dos compostos puros é confirmada com EOG e ensaios comportamentais. As respostas comportamentais observadas no labirinto, em última análise devem ser validadas em um cenário de campo para confirmar sua função em um cenário de fluxo natural. Estes bioensaios desempenham um papel duplo para 1) orientar o processo de fracionamento e 2) confirmar e definir mais a bioatividade dos componentes isolados. Aqui, nós relatamos os resultados representativos de uma identificação de feromônio de lampreia do mar que exemplificam a utilidade da abordagem orientada por bioensaio de fracionamento. A identificação das feromonas de lampreia do mar é particularmente importante porque uma modulação do seu sistema de comunicação de feromônio está entre as opções consideradas para controlar a lampreia invasiva em grandes lagos Laurentian. Esse método pode ser facilmente adaptado para caracterizar a comunicação química em uma ampla gama de táxons e lançar luz sobre ecologia química transmitidas pela água.

Um diagrama Resumindo as etapas descritas no protocolo do fracionamento de bioensaio guiadas é mostrado na Figura 1. O protocolo envolve etapas para isolar e caracterizar a estrutura, a potência olfativa e a atividade comportamental de 5 putativo lampreia feromônios (Figura 2). Utilizando a espectrometria de massa e dados NMR (Figura 3 e Figura 4), as estruturas do petro...

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar e caracterizar a estrutura, potência olfativa e resposta comportamental de compostos putativos feromônio de lampreias do mar.

A identificação das feromonas de lampreia do mar usando guiada por bioensaio fracionamento

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da ecologia química, como a identificação de feromônios. A principal vantagem dessa técnica é que ela liga novos compostos à função do feromônio. Para iniciar este procedimento, coloque 15-30 lampreias marinhas machos sexualmente maduros em um tanque abastecido com 250 litros de água aerada do Lago Huron, mantida a 16-18 graus Celsius.Para extrair a água condicionada por extração em fase sólida, passe-a do tanque através do sistema de bombeamento para o topo da coluna. A água passa por um leito de dois quilos de resina polimérica de troca iônica moderadamente polar, contida em uma série de quatro colunas de vidro com capacidade de um litro. Em seguida, remova o solvente orgânico e colha o extrato por evaporação rotativa por cinco horas sob pressão reduzida a 40 graus Celsius.Para isolar as reservas de frações, mergulhe o gel de sílica na fase móvel inicial por 30 minutos. Transfira o gel com o solvente para uma coluna de vidro e abra sua válvula para permitir a passagem da fase móvel. Em seguida, misture bem os extratos com sílica gel e coloque-os na coluna de cromatografia líquida sobre o leito de sílica gel.Eluva-os co

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Um método para rapidamente tela voláteis de plantas hospedeiras por medição da resposta electrofisiológica de orangeworm umbigo do adulto...

Bioensaio eletroantenográfica como uma ferramenta de triagem para voláteis da planta hospedeira

Neste vídeo, demonstramos um ensaio para estabelecer a presença de fosfolipase no extrato bruto de veneno de Anthopleura dowii - uma anêmona marinha. O ensaio utiliza uma técnica de difusão em gel de agarose, na qual a enzima fosfolipase se difunde e decompõe os fosfolipídios incorporados no meio sólido de maneira radial.

Ensaio de Atividade de Fosfolipase: Um Ensaio de Difusão em Gel para Determinar a Atividade da Fosfolipase em Extrato Bruto de Veneno de Anthopleura dowii

Mar lampreia perder a vesícula e canais biliares durante a metamorfose, um processo semelhante à atresia biliar humano. Um novo método de fixação e esclarecimento (clareza) foi modificado para visualizar toda a árvore biliar através de microscopia confocal de varredura a laser. Este método fornece uma ferramenta poderosa para o estudo degeneração biliar.

Um Método de Esclarecimento Novo para Visualize biliar Degeneração Durante fígado metamorfose em lampreia de mar ( Petromyzon marinus)

Este bioassay emprega um modelo de peixes predadores para avaliar a presença de metabólitos alimentação-de dissuasão a partir de extratos orgânicos de tecidos de organismos marinhos em concentrações naturais utilizando uma matriz alimentar comparável nutricionalmente.

A Laboratory Bioassay alimentando-Fish para avaliar a actividade anti-predação de metabolitos secundários a partir de tecidos de organismos marinhos

Um método de polimorfismo de fragmentos de reacção em cadeia da polimerase restrição melhorado para genotipagem espécies pufferfish por cromatografia / espectrometria de massa líquida é descrito. Uma coluna de sílica de fase inversa monólito é empregue para a separação de fragmentos amplificados digeridos. Este método pode elucidar as massas monoisotópico de oligonucleótidos, que é útil para identificar a composição de base.

Melhoria Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism Genotipagem de Pufferfish Tóxico por Cromatografia Líquida / Espectrometria de Massa

Nos répteis, pele lipídios de coespecíficos são cruciais para sinalização sexual, com potencial de uso na gestão de espécies invasoras. Aqui, descrevemos os protocolos para extração de lipídios da pele da pele de galpão ou animais inteiros, determinar e analisar a massa total de lipídios e separando os lipídios usando fracionamento através de cromatografia em coluna.

Químico isolamento, quantificação e separação dos lipídios da pele dos répteis

O registro multi-unitular extracelular do nervo olfativo é um método sensível, robusto e reprodutível para avaliar a sensibilidade olfativa em peixes marinhos. Registra entrada sensorial primária e é independente da salinidade externa.

Gravação multi-unitular extracelular do nervo olfativo dos teleóstos

A caracterização espectrométrica em massa dos neuropeptídeos fornece informações de sequência, quantitação e localização. Este fluxo de trabalho otimizado não é apenas útil para estudos de neuropeptídeos, mas também para outros peptídeos endógenos. Os protocolos aqui fornecidos descrevem a preparação da amostra, aquisição de MS, análise de MS e geração de neuropeptídeos de banco de dados usando LC-ESI-MS, spotting MALDI-MS e imagens MALDI-MS.

Investigação espectrométrica de massa multifacetada de neuropeptídeos em Callinectes sapidus

Aqui, descrevemos um protocolo para obter extrato de veneno bruto da anêmona do mar e detectar sua atividade hemolítica e fosfolipase.

Identificação da Atividade Hemolítica e Fosfolipase em Extratos Brutos de Anêmonas do Mar por Bioensaões Simples

Este protocolo estabelece métodos para extrair e quantificar as respostas ao feromônio sexual volátil em C. elegans, fornecendo ferramentas para estudar a comunicação química e a trajetória de navegação.

Extração de feromônios sexuais voláteis e ensaio de quimioatração em Caenorhabditis elegans

Este protocolo apresenta um fluxo de trabalho totalmente automatizado para a extração de geosmina e 2-metilisoborneol de tecidos de peixes ricos em água e lipídios. O método permite a detecção precoce dessas moléculas antes que atinjam os limiares de odor. São fornecidos dados representativos de um ambiente de aquicultura.

Extração e Detecção de Geosmina e 2-Metilisoborneol em Água e Peixes usando Sondas de Extração Sortiva de Alta Capacidade e GC-MS

Aprenda a identificar feromonas em lampreias-do-mar usando extração em fase sólida e cromatografia. Este método vincula compostos novos à função feromonal, auxiliando pesquisas em ecologia química e neuroetologia.

A identificação das feromonas de lampreia do mar usando guiada por bioensaio fracionamento

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