Identificação e isolamento de oligopotentes e confirmada por linhagem mieloides progenitores da medula óssea de rato
July 29th, 2018
Demonstramos como identificar e isolar 6 subconjuntos de progenitores mieloides de murino medula óssea usando uma combinação de magnética e fluorescência classificação (MACS e FACS). Este protocolo pode ser usado para ensaios em vitro cultura (culturas metilcelulose ou líquido), na vivo experiências de transferência adotiva e análises de RNA/proteína.
Este método pode ser útil para hematologistas e imunologistas que estudam a produção e função de células mieloides, incluindo neutrófilos, monócitos e células dendríticas. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a identificação mais precisa de subconjuntos de progenitores mieloides do que as estratégias anteriores. Para enriquecer as células da medula óssea para progenitores por classificação de células ativadas por magnetismo, ou MACS, pelete as células por centrifugação e ressuspenda o pellet em 40 microlitros de tampão de coloração MACS por um vezes 10 para as sete células da medula óssea.
Para esgotar as células positivas de linhagem diferenciada, adicione 10 microlitros de coquetel de anticorpos de biotina por um vezes 10 às sete células e misture pipetando por uma incubação de 10 minutos a quatro graus Celsius. No final da incubação, adicione 30 microlitros de tampão de coloração por um vezes 10 às sete células com mistura, seguido por 20 microlitros de microesferas anti-biotina por um vezes 10 às sete células. Após 15 minutos a quatro graus Celsius, lave as células com um mililitro de tampão de coloração por 10 a sete células e ressuspenda o pellet em 500 microlitros de tampão de coloração fresco por até 10 a oito células.
Em seguida, configure o separador magnético automatizado de acordo com as instruções do fabricante e coloque o tubo de células rotuladas no separador. Inicie o programa de seleção negativa para coletar a fração negativa que contém as células negativas da linhagem enriquecida com progenitores. Pulverize as células negativas da linhagem por centrifugação e ressuspenda o pellet, que agora é branco, em dois mililitros de tampão de coloração por camundongo para contagem.
Para isolar as células progenitoras mieloides por FACS, adicione uma vez 10 às células negativas da quinta linhagem a cada um dos oito tubos de microcentrífuga de controle para seleção de voltagem e compensação de cor e adicione o restante da amostra de célula a um nono tubo de microcentrífuga para coloração com todos os sete anticorpos marcadores de superfície de interesse para identificação e classificação do progenitor. Pulverize as células por centrifugação e ressuspenda os pellets de controle em 100 microlitros de tampão de coloração FACS e o pellet de amostra experimental em 100 microlitros de tampão de coloração por cinco vezes 10 para as seis células. Em seguida, adicione anticorpo anti-CD16/CD32 ao tubo de coloração única do receptor gama Fc e ao tubo de amostra.
Vortex suavemente e incubar as amostras por 10 minutos a quatro graus Celsius. No final da incubação, adicionar os outros anticorpos aos tubos de coloração simples correspondentes e ao tubo de amostra e, após um vórtice suave, incubar as amostras durante 15 minutos a quatro graus Celsius. No final da incubação, adicione 900 microlitros de tampão de coloração aos tubos de controle e um mililitro de tampão de coloração por um vezes 10 às sete células ao tubo de amostra para centrifugação.
Ressuspenda os pellets de controle em 200 microlitros de tampão de coloração fresco por tubo e o pellet experimental em 500 microlitros por 2,5 vezes 10 para as sete células e transfira as células marcadas para tubos FACS individuais correspondentes de cinco mililitros. Em seguida, configure o citômetro de fluxo de acordo com os protocolos padrão e use os controles sem coloração e com coloração única para definir as tensões e as compensações de cor. Para identificar e isolar as células progenitoras mieloides, carregue a amostra de célula experimental no citômetro e crie um gráfico de área de dispersão direta versus área de dispersão lateral, bloqueando para excluir os detritos e as células mortas.
Crie um gráfico de altura de dispersão direta versus largura de dispersão direta das células ativas e da porta para excluir os dublês. Repita esse processo com um gráfico de altura de dispersão lateral versus largura de dispersão lateral dos singlets de dispersão direta e da porta para excluir os dublês. Crie um gráfico e um portão Sca-1 versus c-Kit para selecionar os progenitores negativos Sca-1 positivos do c-Kit.
Em seguida, crie um gráfico e uma porta do receptor gama CD-34 versus FC para selecionar as populações mistas de progenitor mielóide comum e progenitor misto de monócitos de granulócitos. É importante bloquear as populações mistas de progenitor mielóide comum e progenitor misto de monócitos de granulócitos com a maior precisão possível. Pode ser útil usar um gráfico de densidade de pseudo-cor ou um gráfico de contorno para um gating mais preciso.
Use as células na porta progenitora mielóide comum mista para criar um gráfico CD115 versus Flt3 e porta para selecionar as células baixas CD115 positivas para progenitor mieloide comum Flt3, as células baixas CD115 negativas para progenitor mieloide comum Flt3 e as progenitores de células dendríticas de monócitos altos CD115 positivos para Flt3. Use as células na porta progenitora de monócitos de granulócitos mistos para criar um gráfico e porta do receptor Ly6C versus FC Gamma para selecionar as células negativas Ly6C e as células positivas Ly6C. Em seguida, crie um gráfico de CD115 versus Flt3 para cada subpopulação de células progenitoras de monócitos de monócitos de granulócitos mistos fechados e bloqueie os progenitores de monócitos de baixo granulócitos Ly6C negativo Flt3 negativo CD115, os progenitores de baixo granulócito Ly6C positivo Flt3 negativo CD115 e os progenitores de monócitos altos de alto teor de Flt3 negativo Ly6C positivo Flt3 negativo
.A depleção máxima da linhagem é eficiente no esgotamento de células diferenciadas e no enriquecimento das células progenitoras positivas do c-Kit. A fração negativa da linhagem ainda contém algumas células negativas do c-Kit, mas essas células serão eliminadas nas etapas subsequentes de controle da citometria de fluxo. Os rendimentos do progenitor após a classificação FACS podem variar dependendo das configurações do classificador usadas, mas deve ser possível obter entre uma a quatro vezes 10 elevado à quarta célula por fração de cada camundongo com uma pureza pós-classificação superior a 95% para cada fração.
Uma boa coloração é fundamental para a separação limpa das populações. Pode ser necessário titular os anticorpos ou escolher fluoróforos diferentes para garantir a separação ideal. Este protocolo pode ser usado para identificar células progenitoras para avaliar diferenças na composição da medula óssea entre amostras, para isolar progenitores para análise molecular ou para avaliar sua capacidade de produzir células mieloides.
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Visão Geral
Este artigo demonstra um método para identificar e isolar seis subconjuntos de progenitores mieloides da medula óssea murina usando técnicas de triagem magnética e por fluorescência. O protocolo é aplicável para vários ensaios, incluindo cultura in vitro e análises de RNA/proteína.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Hematologia
- Imunologia
- Biologia Celular
Fundamentos
- As células mieloides desempenham um papel crucial na resposta imune.
- Compreender os subconjuntos de progenitores mieloides é essencial para estudar suas funções.
- Métodos anteriores careciam de precisão na identificação desses subconjuntos.
- Este estudo introduz uma técnica refinada para melhor identificação.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um método confiável para isolar subconjuntos de progenitores mieloides.
- Aprimoramento da compreensão da produção e função das células mieloides.
- Facilitar pesquisas adicionais em hematologia e imunologia.
Métodos Utilizados
- Triagem de células ativadas por magnetismo (MACS) para enriquecimento celular.
- Triagem de células ativadas por fluorescência (FACS) para identificação precisa.
- Ensaios de cultura in vitro usando metilcelulose ou culturas líquidas.
- Análises de RNA e proteína para estudos funcionais.
Principais Resultados
- Isolamento bem-sucedido de seis subconjuntos distintos de progenitores mieloides.
- Precisão aprimorada na identificação de células progenitoras em comparação com métodos anteriores.
- Protocolo aplicável para várias aplicações posteriores.
- Potencial para avançar pesquisas em biologia celular mieloide.
Conclusões
- O método fornece um avanço significativo na pesquisa de progenitores mieloides.
- Abre novos caminhos para o estudo das funções das células mieloides.
- Os pesquisadores podem utilizar este protocolo para diversas aplicações experimentais.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Precise identification of myeloid progenitor subsets enables mechanistic de-risking in hematology and immunology target validation. Improved resolution of oligopotent and lineage-committed populations supports predictive confidence in differentiation pathways. This approach enhances portfolio triage by reducing biological ambiguity in preclinical models of myeloid disorders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in neutrophil, monocyte, and dendritic cell differentiation pathways.
- Operational Value: Provides biologically de-risked progenitor subsets for functional target validation.
- Predictive Value: Supports lead identification by clarifying lineage commitment and oligopotency in myeloid progenitors.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible progenitor populations for downstream compound screening.
- Quantitative Output: Permits progenitor quantification and isolation for in vitro and in vivo functional assays.
- Platform Reuse: Enables scalable preparation of validated myeloid systems for assay standardization across projects.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Supports study of leukemic transformation mechanisms and immune responses to pathogen exposure.
- Translational Continuity: Bridges discovery through preclinical validation of myeloid progenitor function.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs advancement decisions by linking progenitor subsets to myeloid cell production outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from progenitor enrichment to functional validation, supporting hypothesis testing and pathway clarification in myeloid biology.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and biological de-risking of myeloid differentiation pathways.
- Screening: Delivers assay-ready progenitor subsets with high purity for reliable compound evaluation.
- Analytics: Enables quantitative measurements of progenitor frequency and functional output for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects subset isolation to preclinical continuity in myeloid cell production studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for isolating oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors across hematology and immunology programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in myeloid lineage commitment and reduced mechanistic ambiguity in progenitor function.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of progenitor isolation via MACS and FACS.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions through improved target validation and reduced late-stage biological risk in myeloid-targeted programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on precise progenitor subset identification and functional validation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in multicolor flow cytometry and magnetic-activated cell sorting techniques.
- Dependent on access to FACS instrumentation and analytical infrastructure for high-resolution sorting.
- Necessitates cross-team standardization of antibody panels and gating strategies for consistent progenitor identification.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to different mouse strains or disease models.
- Limited by the need for careful antibody titration and fluorophore selection to ensure optimal population separation.
