Name: Cicatrização de feridas abrasão epitelial da córnea com Burr Ocular como um modelo para córnea (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Aprenda a induzir abrasão corneal em camundongos usando uma broca ocular para estudar mecanismos celulares e moleculares de cicatrização. Este método simula situações clínicas de emergência e auxilia na compreensão da regeneração epitelial.

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Gostaríamos de agradecer a Kaisa Ikkala por sua inestimável assistência técnica e perspicaz ajuda quando atualizando este método, bem como mais tarde durante a implementação às nossas perguntas de pesquisa central. Também gostaríamos de agradecer sua ajuda com planejamento as orientações do veterinário trabalho o centro de animais de laboratório e Anna Meller.

Todas as experiências são aprovadas pelo Conselho Nacional de experimento animal.
1. preparações
<ol><li>Preparar todas as soluções e manter em temperatura ambiente, salvo indicação em contrário. Siga os regulamentos de eliminação de resíduos para dispose utilizado materiais e soluções.</li>
	<li>Uso NMRI e ICR consanguíneo ações, entre as idades de 4 a 12 semanas e ambos os sexos. Se usando a linhagem C57BL/6, siga o método de preparação de cetamina-medetomidina na etapa 1.3.2. Para outras etapas, siga as instruções descritas em 1.3.3.-1.3.5.</li>
	<li>Prepare o medicamento veterinário fresco e no tempo, antes de iniciar a operação. Carprofeno será usado mais tarde, assim não é necessário para prepará-lo neste momento.<ol>
<li>Para preparar uma solução de cetamina-medetomidina para anestesia, misturar 0,375 mL (concentração de ações 50mg/mL) da cetamina (Ketaminol Vet) com 0,25 mL (concentração de ações 1 mg/mL) de medetomidina (Cepetor Vet) e adicione 1,25 mL de estéril 0,9% NaCl. Administre 0,15 mL/20 g de peso do rato (7,5 mg/kg, ketamina e 1 mg/kg, medetomidina).</li>
		<li>Para preparar uma solução mais diluída de cetamina-medetomidina anestesia em camundongos C57BL/6, misturar 0,375 mL (concentração de ações 50mg/mL) da cetamina com 0,25 mL (concentração de ações 1 mg/mL) de medetomidina e adicionar 2,5 mL de estéril 0,9% NaCl. Administre 0,15 mL/20 g de peso do rato (3,75 mg/kg, cetamina e 0,5 mg/kg, medetomidina). Nota: Este é um passo alternativo, apenas para adultos camundongos C57BL/6.</li>
		<li>Para preparar o buprenorfin para analgesia, adicionar 0,1 mL (concentração de ações 0,3 mg/mL) de buprenorfin a 1,9 mL de estéril 0,9% NaCl. Administre 0,2 mL/20 g de massa de rato (0,15 mg/kg).</li>
		<li>Para preparar o atipamezole para interromper a anestesia, adicionar 0,1 mL (concentração de ações 5 mg/mL) de atipamezole para 4,9 mL de 0,9% NaCl. Administre 0,15 mL/20 g de massa de rato (0,75 mg/kg).</li>
		<li>Para analgesia durante pós-anestesia use carprofeno. Adicionar 0,1 mL (concentração de ações 50mg/mL) de carprofeno a 4,9 mL de 0,9% NaCl. Administre 0,15 mL/20 g de peso do rato (7,5 mg/kg).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar a solução de coloração fluorescente<ol>
<li>Para visualizar a abrasão sob a luz azul cobalto (Figura 1), use uma solução fluorescente. Preparar uma solução de fluoresceína 0,1% primeira medição 10 mg de sal de fluoresceína com uma escala bem e em seguida, adicioná-lo a 10 mL de solução salina tampão fosfato (PBS).</li>
		<li>Proteger a solução de fluoresceína de luz e agitar durante 5 minutos em uma coqueteleira. Nota: A solução de fluoresceína é sensível à luz; manter a solução coberta de luz. Esta solução pode ser armazenada em + 4 ° C durante 2-3 dias. Para uso, é útil colocar a solução de fluoresceína em um frasco conta-gotas que é usado para colírio. Use um filtro estéril quando se deslocam a solução para o frasco conta-gotas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Limpe a ponta da rebarba ocular antes e após o uso; primeiro com PBS e, em seguida, com 70% EtOH. Se tornando uma abrasão para vários ratos durante a mesma operação, fazer as limpeza etapas entre cada rato.</li>
	<li>Ponha a placa aquecida (37 ° C) e coloque uma toalha de papel nele.</li>
</ol>2. corneal abrasão
Atenção: Utilize protectores (luvas, jaleco) quando lidar com ratos. Pese o mouse para estimar o volume de medicação a administrar.
<ol><li>Use o método agarrando com uma mão para manipular o rato23. Administrar a mistura de cetamina-medetomidina intraperitonealmente (i.p.) no abdômen inferior esquerdo. Coloque o mouse para uma gaiola individual e esperar que caia no sono. Isso geralmente leva menos de 5 minutos. Em seguida, administre buprenorfin primeiro e, em seguida, atipamezole via i.p. injeções. Use a mesma técnica de manipulação. Nota: Uma vez que a anestesia é dada, o protocolo deve não ser pausado a qualquer momento.</li>
	<li>Antes de continuar, verifique se a placa aquecida é quente. Coloque o mouse anestesiado na chapa aquecida. O nível da anestesia é bom se o reflexo de cauda está ausente, mas o reflexo do dedo do pé está presente. Estes reflexos por beliscar a cauda e qualquer dedo do pé com os dedos ou uma pinça. Não use força excessiva. Anestesia vai durar 20-25 minutos.</li>
	<li>Para tornar uma abrasão, use a rebarba ocular limpa. Gire a base das rebarbas para ativar a vibração que é essencial para fazer a abrasão. Senti a vibração na mão, quando a rebarba está funcionando corretamente.<ol>
<li>Abra um olho de cada vez, mantendo as pálpebras separadamente com os dedos. Então firmemente tocar as rebarbas para a córnea e deslocar o instrumento e para trás, bem como para os lados da superfície ocular. A vibração de rebarba executará o zero; Não pressione, agitar ou rasgar a córnea. A córnea central, 20 movimentos na superfície de abrasão são suficientes para induzir a ferida. Não levante a rebarba e tentar ficar na região da córnea para ser desgastados. Adquirir uma abrasão tamanho padrão exigirá várias rodadas de prática.</li>
	</ol>
 Nota: Assepsia da córnea pode ser conseguida antes de abrasão usando betadine solução oftálmica.</li>
</ol>3. imagem latente a abrasão
<ol><li>Ilumine a região abradada usando solução de fluoresceína e luz de caneta azul cobalto (Figura 1). A superfície ocular parece incolor em luz ambiente. Após a aplicação de fluoresceína, região abradada fluoresce a verde quando iluminando o olho com a caneta de luz.<ol>
<li>Se necessário, abra o olho abradado da mesma forma como no 2.3 e administrar uma gota de solução de fluoresceína do frasco conta-gotas. Lavar o olho uma vez com PBS ou 0,9% NaCl para reduzir fundo da fluoresceína. Use um frasco conta-gotas ou uma pipeta para lavagem. Aspirar o líquido fora com uma limpeza suave e limpar os cílios, se necessário. O excesso de líquido geralmente coleta à fronteira nasal do olho, perto da abertura do canal lacrimal. Atenção: Evite tocar a córnea enquanto cleaining como escoriações menores podem ser induzidas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fotografa a abrasão da córnea.<ol>
<li>Para obter imagens semelhantes durante cada sessão de imagens, use ferramentas de fixação constante para a luz de caneta azul cobalto e a câmera de SLR (Figura 2). Este protocolo fornece uma configuração fácil de repetir (Figura 2).<ol>
<li>Para anexar a luz caneta e a câmera, use um candeeiro de mesa com um braço flexível e braçadeira e um braço de câmera ajustável com uma pinça, respectivamente. Cabo-tie a caneta de luz ao candeeiro de mesa e posição logo acima do olho do rato. A luz de posicionamento diferente pode alterar a visualização da abrasão. Uma sugestão para o posicionamento dessas ferramentas é descrita na Figura 2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Use a câmera SLR para tirar fotos do olho. Coloque o animal em uma distância desejada e a posição e o foco da câmera (01:12) na luz do quarto. Depois disso, feche todas as outras luzes, exceto a luz de caneta azul cobalto. Nota: O manípulo de luz caneta de fita para baixo ou use um elástico para manter a luz acesa o tempo todo durante a imagem latente. Isto pode ajudar se a imagem se torna embaçada. É mais fácil de executar a etapa de imagem com um colega.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. acordar após abrasão Corneal
<ol><li>Administre buprenorfin primeiro e, em seguida, atipamezole via i.p. injeções. Use a mesma técnica de manipulação, como em 2.1.</li>
	<li>Coloque uma gota de antibacteriano, fucidin ácido pomada (Isathal) para olhos desgastados e não-desgastada para hidratar e manter a superfície ocular limpo de bactérias após a anestesia.</li>
	<li>Como o mouse vai acordar em 5-20 minutos na placa aquecida, observe o mouse durante o período pós-anestésico do despertar. Quando torna-se móvel, coloque-o em uma gaiola individual. Nota: Se acordar leva mais tempo, coloque o rato na gaiola com uma almofada aquecida ou coloque a gaiola inteira sobre a chapa aquecida e monitorar o mouse regularmente. Enquanto o efeito da anestesia, o mouse normalmente sacode e atinge para cima com o corpo anterior. Esse comportamento deve retornar ao normal em 3-4 horas e então você pode colocar o mouse volta para uma jaula compartilhada.</li>
	<li>Administre o carprofeno i.p. para analgesia e olho pomada em dois dias consecutivos após a abrasão, da mesma forma como em passos 2.2. e 4.2.</li>
</ol>5. imagem latente durante a cicatrização de feridas
<ol><li>Neste protocolo, tempo de uso aponta 18 h e 72 h após a abrasão para observar o fechamento da ferida.<ol>
<li>Para tratamento de imagens consecutivo, anestesia os ratos como explicado no ponto 2.2.</li>
		<li>Tire fotos como explicado em 3.</li>
		<li>Acorde os animais com atipamezole i.p. e monitorar o período de despertar, conforme explicado no ponto 4.3. Nota: se não continuar o acompanhamento, eutanásia o mouse logo após 5.1.2. Eutanásia é descrita em 6.1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. córnea coleção e incorporação de parafina
<ol><li>Após o último ponto de tempo, sacrifica o animal. Coloque o mouse em uma câmara que pode ser preenchida com CO2. Encher o ar da câmara com CO2. Quando o animal fica imóvel, deslocar as vértebras cervicais puxando firmemente da base da cauda e pressionando a região do pescoço para baixo, ao mesmo tempo. Cuidado: Siga sempre as orientações do órgão local de bem-estar animal.</li>
	<li>Recolha o globo ocular inteiro cortando uma abertura na pele para o lado do olho com uma tesoura de dissecação. Coloque a tesoura sob o globo ocular e cortar o nervo ocular para estalar o globo ocular fora da órbita. Use a pinça se o olho não sai facilmente.<ol>
<li>Faça um buraco na parte de trás do olho, do lado da retina, com uma agulha 26G para permitir a livre penetração das soluções dentro do olho. Nota: Não deixe o olho tornar-se seca, em vez disso, colocá-lo em PBS até continuando com o protocolo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recolha o globo ocular em um tubo de 2 mL com PBS. Não pausa o experimento neste ponto.</li>
	<li>Remover o PBS e corrigir olhos em paraformaldeído 4% (PFA) em + 4 ° C por 4-5 horas.</li>
	<li>Mova o olho fixo para uma fita de tecido para processamento do tecido. Use um tecido de processamento da máquina e o programa a seguir:<ol>
<li>Enxaguar com PBS.</li>
		<li>Incube 2 x 45 min em etanol a 70% à temperatura ambiente.</li>
		<li>Incube 2 x 1 h em 94% de etanol na temperatura de quarto.</li>
		<li>Incube 3 x 45 min em etanol absoluto à temperatura ambiente.</li>
		<li>Incubar 3 x 1 h em xilol, a temperatura e a último xileno a 37 ° C.</li>
		<li>Incubar 3 x 1 h em cera de parafina a 60 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Após processamento de tecido, incorpore o globo ocular em parafina líquida (+ 60 ° C), usando um bloco de incorporação de tecido. Coloque o olho dentro do bloco é olhar para os lados e a borda periférica é virada para cima. Deixe o bloco solidificar em um prato legal por 5-10 minutos.</li>
</ol>7. parafina seções da córnea
<ol><li>Prepare o micrótomo para corte de acordo com as instruções da instituição ou do fabricante. Cuidado: Tenha cuidado ao manusear a lâmina afiada do micrótomo.</li>
	<li>Banho de água de um lugar com temperatura de água ultrapura ao lado do micrótomo e outro com água ultrapura aquecido a + 50 ° C.</li>
	<li>Fazer 5 µm de espessura seções do globo ocular. Nota: A lente rompe facilmente durante o corte. Para evitar isso, limpe a superfície do corte com um tecido úmido, cada vez que uma nova linha de seções é iniciada. Use água da torneira para umedecer o tecido.</li>
	<li>Colocar as seções ao lado do outro em banho de água a temperatura ambiente e em seguida, movê-los para o banho de água quente com a ajuda de uma lâmina de vidro. Estica o banho de água quente, até que todas as rugas relaxar e o fosco seções tornam-se as seções.</li>
	<li>Secar as lâminas de vidro com seções pernoite em 37 ° C.</li>
	<li>Anexar as seções para os slides, mantendo o slide por 1 minuto em uma placa aquecida em + 60 ° C. Depois disso, as seções podem ser diretamente processadas para coloração, métodos reagidos ou armazenadas em + 4 ° C.</li>
</ol>

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<li>Suzuki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-matrix+and+cell-cell+interactions+during+corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Cell-matrix and cell-cell interactions during corneal epithelial wound healing.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 22 (2), 113-133 (2003).</li>
<li>Sato, Y., Seo, N., Kobayashi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+background+differences+between+FVB+and+C57BL%2F6+mice+affect+hypnotic+susceptibility+to+pentobarbital%2C+ketamine+and+nitrous+oxide%2C+but+not+isoflurane%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Anaesthesiologica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Genetic background differences between FVB and C57BL/6 mice affect hypnotic susceptibility to pentobarbital, ketamine and nitrous oxide, but not isoflurane.</a> Acta Anaesthesiologica Scandinavica. 50 (5), 553-556 (2006).</li>
<li>Pajoohesh-Ganji, A., Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((K14+%2B+Compound+niches+are+present+on+the+mouse+cornea+early+after+birth+and+expand+after+debridement+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">K14 + Compound niches are present on the mouse cornea early after birth and expand after debridement wounds.</a> Developmental Dynamics. 245 (2), 132-143 (2016).</li>
<li>Boote, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Assessment+of+Ultrastructure+and+Light+Scatter+in+Mouse+Corneal+Debridement+Wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative Assessment of Ultrastructure and Light Scatter in Mouse Corneal Debridement Wounds.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2786(2012).</li>
<li>Pal-Ghosh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MMP9+cleavage+of+the+%CE%B24+integrin+ectodomain+leads+to+recurrent+epithelial+erosions+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">MMP9 cleavage of the β4 integrin ectodomain leads to recurrent epithelial erosions in mice.</a> Journal of Cell Science. 124 (Pt 15), 2666-2675 (2011).</li>
<li>Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Brown, M., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+the+study+of+recurrent+corneal+epithelial+erosions%3A+alpha9beta1+integrin+implicated+in+progression+of+the+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">A mouse model for the study of recurrent corneal epithelial erosions: alpha9beta1 integrin implicated in progression of the disease.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (6), 1775-1788 (2004).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Ferindo métodos são ferramentas populares para estudar diferentes aspectos da homeostase da córnea e patologias. O modelo de abrasão oferece um método bem controlado para resolver problemas relevantes em oftalmologia. No entanto, determinados pontos críticos no protocolo são vale a pena enfatizar. Notavelmente, os detalhes descritos em matéria de medicina veterinária, ferida cura cronograma e resultado são otimizados para uso com estoques NMRI e ICR outbreds, mas podem variar entre cepas de ratos26</sup...

Epitelial de inúmeros órgãos está expostos a lesões. No entanto, eles também contêm a capacidade de compensar a perda de tecido através da cicatrização da ferida. A córnea oferece um excelente modelo para estudar a cicatrização de feridas. Forma a superfície externa do olho e fornece uma camada protetora para a maquinaria ocular sensível. Assim, a córnea funciona como uma barreira física para patógenos e perda de água. É composto de três camadas; epitélio, estroma e endotélio. O epitélio da córnea torna-se a camada mais externa da córnea. Células epiteliais mantêm a função de barreira da córnea aderindo estritamente ao outro através de junções apertadas1,2,3. Uma membrana basal acelular da córnea, membrana de Bowman, separa o epitélio do estroma extensivo, que contém keratocytes refratário. Sob o estroma, células endoteliais canal nutrientes, água e oxigênio para a camada superior.
Abrasões da córnea são muito comuns na clínica4. Lesões de córnea são diversos, mas em grande parte são causados por pequenas partículas, como poeira ou areia, arranhões ou outros objectos estranhos. O protocolo descrito aqui visa reproduzir um tipo clinicamente relevante de abrasão epitelial da córnea. Ao fazê-lo, este protocolo fornece um método controlável e seminal para clínicos e cientistas da córnea implementar em seus próprios estudos. Efetuamos um ensaio de reparo de lesões no vivo na córnea murino por abrasão o tecido com uma rebarba ocular entorpecida, o II Algerbrush. Aqui, temos como alvo a abrasão para o epitélio corneano central e deixar as outras partes do órgão sem danos. Assim, o protocolo é ideal para estudo célula epitelial da córnea dinâmica ou a membrana basal durante a re-epitelização, célula de migração, proliferação e diferenciação em vivo5. Recentemente, este modelo foi usado para analisar a dinâmica de células progenitoras na córnea murino, bem como para desvendar a capacidade das células epiteliais da córnea diferenciadas em re-estabelecer o nicho de células-tronco da córnea após lesão6,7. Após abrasão, a córnea retorna ao seu normal transparência e resistência à tração. Curiosamente, um estudo em vitro indicou que re-epitelização ocorre sem célula maior proliferação8. Este protocolo descreve a linha do tempo de cicatrização ininterrupta na córnea murino. O método é, portanto, aplicável para testar o efeito das drogas sobre a cura de padrões e velocidade.
A córnea tem sido extensivamente usada para estudos de cicatrização de feridas. No entanto, muitos estudos têm contado com outros modelos de lesão. Um modelo bem estabelecido de lesão da córnea é a queimadura alcalina é executada através da aplicação de hidróxido de sódio (NaOH) com ou sem papel de filtro sobre a superfície da córnea9. Alcalina exposição resulta em uma lesão grande e difusa que afeta não só o epitélio corneano, mas também a conjuntiva e estroma9,10. Soluções alcalinas fortes foram mostradas para induzir úlceras da córnea, opacificação e neovascularização9. Células inflamatórias invadem o estroma geralmente dentro de 6 h e permanecem lá até 24 h11. Assim, a lesão alcalina é um método aconselhável em estudos relacionados à ativação do estroma. Um outro tipo de lesão química pode ser infligido aplicando dimetilsulfóxido (DMSO) na córnea9,10. Outros modelos de lesões comumente usados incluem feridas incisional que penetram através do estroma e fotorrefrativa feridas, que são limitadas a porção superior do estroma14,15. Esses métodos também são úteis para responder perguntas sobre a cicatrização de feridas do estroma. Lesão de diferentes modelos têm suas próprias vantagens e desvantagens. Abrasão, ou desbridamento, do epitélio corneano foi desenvolvida usando bisturis entorpecidas ou lâminas em ex vivo córneas16. Este método foi mais tarde usado na vivo no rato, rato e coelho17,18,19,20,21,22. Usando a rebarba ocular (Figura 1), removemos apenas uma região selecionada do epitélio, deixando o resto do epitélio afetado. Desta forma, é possível segmentar com precisão a remoção epitelial para diferentes partes do cornea. Além disso, o tamanho de abrasão pode ser avaliado com coloração de fluoresceína. Além disso, aqui seguimos encerramento abrasão durante o período de cicatrização.
Esse método apresenta diversas vantagens, i) incluindo a localização precisa do local de abrasão, que não é possível com lesão química, ii) a abrasão é rápida a executar e iii) é não-invasivo. Aqui, descrevemos o método usando o mouse NMRI outbred como modelo, no entanto, isso poderia ser aplicado para a vasta gama de modelos genéticos de rato, bem como para o rato e o coelho, que são modelos comuns usados para estudar a ruptura da córnea humana.

<table><tbody><tr><td>Camundongo NMRI</td><td>Envigo</td><td>275</td><td></td></tr><tr><td>0,9% NaCl</td><td></td><td></td><td>usa</td></tr><tr><td>medetomidina</td> estéril <td>Vetmedic</td><td>Vnr087896</td><td>Nome do mercado: Cepetor Vet</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Intervet</td><td>Vnr511485</td><td>Nome do mercado: Ketaminol Vet</td></tr><tr><td>Buprenorfin</td><td>Invidior</td><td>3015248</td><td>Nome do mercado: Temgesic</td></tr><tr><td>Atipamezol</td><td>Orion Pharma</td><td>Vnr471953</td><td>Nome do mercado: Antisedan Vet</td></tr><tr><td>Carprofeno</td><td>Norbrook</td><td>Vnr027579</td><td>Nome do mercado: Norocarp Vet</td></tr><tr><td>1% fucidin pomada ocular ácida</td><td>Dechra</td><td>Vnr080899</td><td>Nome do mercado: Isathal</td></tr><tr><td>Fluoresceína sal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6377</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina</td><td></td><td></td> tamponada com fosfato <td>PBS</td></tr><tr><td>Algerbrush ii rebarba ocular ( Ponta de 0,5 mm)</td><td>Algerbrush</td><td>6.39768E+11</td><td></td></tr><tr><td>Caneta azul cobalto SP</td><td>Services</td><td>DE/003</td><td></td></tr><tr><td>Placa quente</td><td>Kunz Instruments</td><td>2007-0217</td><td></td></tr><tr><td>Câmera digital SLR</td><td>Nikon</td><td>D80</td><td></td></tr><tr><td>Braço de câmera ajustável e braçadeira</td><td>Neewer</td><td>10086132</td><td>Altura 28 cm</td></tr><tr><td>Candeeiro de mesa com um braço flexível e uma braçadeira</td><td>Prisma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Limpeza macia</td><td>KimtechScience</td><td>7552</td><td></td></tr><tr><td>Câmara</td><td></td><td></td><td></td>de CO2</tr><tr><td>Conjunto de ferramentas de dissecação</td><td>Seringas Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringas</td><td>Beckton Dickinson</td><td>303172</td><td></td></tr><tr><td>agulhas 26G</td><td>Beckton Dickinson</td><td>303800</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Eppendorf tubo</td><td>Sarstedt</td><td>689</td><td></td></tr><tr><td>de tecido</td><td>Sakura Finetech</td><td>4118F</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de processamento de tecidos ASP200S</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>VWR</td><td>UN1307</td><td></td></tr><tr><td>Cera de parafina</td><td>Millipore</td><td>K95523361</td><td></td></tr><tr><td>Molde de incorporação de tecido 32 x 25 x 6 mm</td><td>Sakura Finetech</td><td>4123</td><td></td></tr><tr><td>Micrótomo</td><td>Microm</td><td>HM355</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria para seccionamento</td><td>Orthex</td><td>60591</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria para seccionamento</td><td>Leica</td><td>HI1210</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de micrótomo</td><td>Feather</td><td>S35</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de vidro</td><td>Th.Geyer GmbH & Co.</td><td>7.695.019</td><td></td></tr><tr><td>Água ultrapura</td><td>Millipore</td><td>MPGP04001</td><td>MilliQ</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td>PFA</td></tr></tbody></table>

cicatrização de feridas abrasão epitelial da córnea com burr ocular como um modelo para córnea

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

A córnea murino fornece um excelente modelo para estudar a cicatrização de feridas. A córnea é a camada mais externa do olho e, portanto, é a primeira defesa de lesão. Na verdade, o tipo mais comum de lesão ocular encontrado na clínica é uma abrasão da córnea. Aqui, nós utilizamos uma rebarba ocular para induzir uma abrasão, resultando na remoção do epitélio corneano na vivo em ratos anestesiados. Este método permite a interrupção epitelial visada e reprodutível, deixando outras áreas intactas. Além disso, descrevemos a visualização do epitélio com fluoresceína mancha abradado e fornecer aconselhamento concreto sobre como visualizar a abrasão da córnea. Então, seguimos a linha do tempo da ferida cura 0, 18 e 72 h após a abrasão, até que a ferida é re-epithelialized. O modelo de abrasão epitelial de lesão corneana é ideal para estudos sobre a proliferação de células epiteliais, migração e re-epitelização das camadas da córnea. No entanto, esse método não é ideal para estudar a ativação do estroma durante a cicatrização de feridas, porque a rebarba ocular não penetra nas camadas de células do estroma. Esse método também é apropriado para aplicações clínicas, por exemplo, pré-clínicos teste de eficácia de drogas.

Este protocolo descreve um modelo para infligir um dano de abrasão ao cornea de rato e sugere como seguir e visualizar o processo de cicatrização após a abrasão. Recentemente, utilizamos este método para estudar o papel das células progenitoras epiteliais da córnea durante6de cicatrização de feridas. O uso de ferramentas estabelecidas é a chave para uma experiência bem sucedida de abrasão. Nós e outros, têm usado as rebarbas ocular Algerbrush II (<strong class="xfi...

Este protocolo descreve um método para infligir uma abrasão na superfície ocular do mouse e a seguir a ferida que daí em diante o processo de cura. O protocolo se aproveita de uma rebarba ocular para remover parcialmente o epitélio superficial do olho em camundongos anestesiados.

Cicatrização de feridas abrasão epitelial da córnea com Burr Ocular como um modelo para córnea

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave relacionadas aos mecanismos celulares e moleculares envolvidos durante a cicatrização da ferida na córnea. Uma vantagem dessa técnica é que ela reflete as situações no pronto-socorro em caso de inserção da córnea, ou seja, abrasão ou arranhão na superfície do olho. Tive a ideia desse método pela primeira vez quando estava estudando as células progenitoras epiteliais da córnea e seu comportamento em uma situação que desafia a manutenção homeostática da córnea.A demonstração visual desse método é fundamental, pois a realização da abrasão da córnea é difícil e requer prática. Primeiro, prepare uma solução de Florecine a 0,1% para visualizar a abrasão sob luz azul cobalto, medindo 10 miligramas de sal Florecine com uma escala fina. Em seguida, adicione o sal a 10 mililitros de solução salina tamponada com Fosfate.Proteja a solução de Florecine da luz e agite por cinco minutos. Filtre a solução estéril em um frasco conta-gotas e proteja da luz. A solução de Florecine pode ser armazenada a quatro graus Celsius por dois a três dias.Limpe a ponta da rebarba ocular antes e depois do uso. Primeiro, com PBS e, depois, com 70% de etanol. Com

corneal-epithelial-abrasion-with-ocular-burr-as-model-for-cornea

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Descrito aqui é o estabelecimento de um modelo de cirurgia de catarata simulada ex vivo clinicamente relevante que pode ser usado para investigar mecanismos de resposta à lesão de tecidos epiteliais dentro de seu microambiente nativo.

Estabelecimento de um clinicamente relevantes<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mock Cataract Surgery Modelo para investigar Epithelial Wound Repair em um microambiente Native

Um protocolo para uma ex modelo de cultura da córnea órgão vivo, útil para estudos de cicatrização de feridas é descrita. Este sistema de modelo pode ser usado para avaliar os efeitos de agentes para promover a cicatrização regenerativa ou toxicidade de drogas em ambiente 3D multicelular organizada.

Ex Vivo modelo de cultura órgão da córnea para cicatrização de feridas estudos

Aqui, um protocolo para criar uma ferida de abrasão epitelial córnea central no rato usando uma trefina e um taco de golfe sem corte é descrito. Este modelo de cura de feridas na córnea é altamente reprodutível e agora está sendo usado para avaliar a cicatrização comprometida da ferida córnea no contexto das doenças.

Um modelo de abrasão epitelial para estudar a cicatrização da ferida córnea

Aqui, modelos animais baseados em camundongos e coelhos são desenvolvidos para lesão mecânica e química do epitélio corneano para triagem de novas terapêuticas e do mecanismo subjacente.

Modelos Animais Ex Vivo e In Vivo para Lesões Mecânicas e Químicas do Epitélio da Córnea

Este artigo descreve um novo modelo animal desenvolvido para estudar a anatomia e histologia da córnea e seus processos de cicatrização. Este novo modelo animal usa o gerbil mongol, que tem uma córnea com muitas semelhanças com a córnea humana.

Gerbils mongóis como um modelo animal de cicatrização de feridas

O presente protocolo demonstra as diferentes etapas envolvidas na ferida da córnea de um filhote embrionário em ovo. As córneas regeneradoras ou totalmente restauradas podem ser analisadas para potencial regenerativo usando várias técnicas celulares e moleculares após o procedimento de ferir.

Investigando regeneração de tecido sem cicatrizes em córneas de filhotes feridos embrionários

Este protocolo se concentra em danificar a superfície ocular do zebrafish através da abrasão para avaliar o subsequente fechamento da ferida no nível celular. Esta abordagem explora uma rebarba ocular para remover parcialmente o epitélio corneo e usa microscopia eletrônica de varredura para rastrear mudanças na morfologia celular durante o fechamento da ferida.

Cura da ferida corneal de zebrafish: da abrasão à análise de imagem de fechamento da ferida

Aqui, propomos três métodos diferentes de danificar as fibras sensoriais que inervam a córnea. Estes métodos facilitam o estudo da regeneração axonal em camundongos. Estes três métodos, adaptáveis a outros modelos animais, são ideais para o estudo da fisiologia e regeneração da inervação corneana.

Três estratégias para induzir ceratite neurotrófica e regeneração nervosa na córnea murina

Desenvolvemos um modelo de rato de inflamação grave da córnea por meio de curetagem do epitélio da córnea combinada com suturas da córnea. O estudo avaliou os padrões de inflamação da córnea, proliferação epitelial e alterações nas células-tronco límbicas sob condições inflamatórias.

Estabelecendo um modelo de inflamação grave da córnea em ratos com base na curetagem do epitélio da córnea combinada com suturas da córnea

A cultura de órgãos ex vivo da córnea suína e a cicatrização de feridas epiteliais fornecem um meio econômico, ético, reprodutível e quantitativo para testar a toxicidade ocular de produtos químicos. Eles também ajudam a elucidar os mecanismos subjacentes à regulação da epitelização e reparo tecidual e na avaliação terapêutica para o tratamento de ceratopatia diabética e cicatrização retardada de feridas.

Avaliação da toxicidade terapêutica e química usando córneas suínas cultivadas em órgãos e cicatrização de feridas epiteliais

Aprenda a induzir abrasão corneal em camundongos usando uma broca ocular para estudar mecanismos celulares e moleculares de cicatrização. Este método simula situações clínicas de emergência e auxilia na compreensão da regeneração epitelial.

Cicatrização de feridas abrasão epitelial da córnea com Burr Ocular como um modelo para córnea

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