Determinação espectrofotométrica de Phycobiliprotein conteúdo em associação Synechocystis

O objetivo geral deste protocolo é determinar quantitativamente o conteúdo de ficobiliproteínas no modelo de cianobactéria Synechocystis usando um método espectrofotométrico. Ficobiliproteínas são complexos pigmento-proteína solúveis em água que representam os principais componentes das antenas coletoras de luz em cianobactérias procarióticas e vários grupos de algas eucarióticas. Por serem os principais complexos coletores de luz, as ficobiliproteínas representam um dos fatores cruciais que determinam a produtividade de algas e cianobactérias.

Synechocystis é um modelo de cianobactéria usado em centenas de laboratórios em todo o mundo. Synechocystis contém duas ficobiliproteínas, ficocianina e aloficocianina. Este protocolo descreve um método simples, eficiente e confiável para determinação quantitativa de ambas as ficobiliproteínas nesta linhagem de fungos.

Comparamos vários métodos, extração de ficobiliproteínas e quantificação espectrofotométrica. O método de quantificação precisa ser testado para cada cepa, uma vez que os espectros de absorção de ficobiliproteínas podem variar entre diferentes cepas. No início da extração das ficobiliproteínas, transfira um mililitro de cultura de cianobactérias para um tubo com trava de segurança.

Se você decidir determinar o peso seco das amostras, pese os tubos vazios antes da amostragem da cultura. Certifique-se de que a cultura não esteja sedimentada. Centrifugar as células a 15 000 G à temperatura de laboratório durante cinco minutos.

Descarte cuidadosamente o sobrenadante. Certifique-se de não mexer no pellet. Coloque as amostras no freezer.

Para armazenamento de longo prazo, mantenha as amostras a 80 graus Celsius. Isso é necessário para evitar a degradação das ficobiliproteínas. Assim que as amostras estiverem congeladas, insira-as no liofilizador.

Uma vez iniciada a liofilização, verifique a temperatura e a pressão no liofilizador. A temperatura deve estar abaixo de 60 graus Celsius e a pressão deve estar em torno de um hectare Pascal. Liofilize as amostras durante a noite.

Depois de terminar o ciclo de liofilização, feche os tubos o mais rápido possível para evitar a reabsorção de água do ar. Adicione quatro PCs de duas contas de vidro de mililitro a cada tubo de amostra. Homogeneizar as amostras com as esferas de vidro durante 15 segundos.

A amostra devidamente homogeneizada é espalhada por toda a superfície interna dos tubos de trava de segurança. Após a homogeneização das células, adicionar um mililitro de solução salina tamponada com fosfato às amostras para extrair as ficobiliproteínas. O pH ideal do PBS é de cerca de 7,4.

Misturar as células com o PBS durante cinco segundos no homogeneizador. Isso garantirá a mistura ideal de amostras para extração eficiente de ficobiliproteínas. Após a mistura, as amostras ficam esverdeadas.

Manter as amostras no gelo durante 60 minutos para uma extracção ficobiliproteica mais eficiente. Após a extracção, centrifugar as amostras a 15 000 g e a quatro graus Celsius durante cinco minutos. Após a centrifugação, o sobrenadante tem a cor azul ciano.

Antes da medição espectrofotométrica, calibrar o espectrofotómetro utilizando o PBS como branco. Uma vez calibrado o espectrofotómetro, descartar o PBS de uma cubeta de espectrofotómetro e pipetar o sobrenadante com ficobiliproteínas extraídas em vez do tampão descartado. Para a quantificação de ficocianina e aloficocianina, o sobrenadante com ficobiliproteínas extraídas é medido em 615, 652 e 720 nanômetros.

Conforme descrito no texto, existem várias equações para a quantificação dos ficobilissomos conhecidas na literatura. A equação utilizada neste protocolo foi encontrada como a que melhor correlaciona as concentrações de ficocianina e aloficocianina como os pigmentos e pontos. As etapas críticas do protocolo são a homogeneização e extração de células, que devem fornecer alto rendimento e alta especificidade.

Testamos vários procedimentos de extração, como ruptura de células por sonicação, homogeneização com grânulos de zircônia ou ligação celular congelada. O método deste protocolo proporcionou o maior rendimento de ficobilissomos. Uma vez que mesmo uma pequena contaminação do extrato proteico pela clorofila pode levar à superestimação do conteúdo de ficobiliproteínas, é necessário evitar qualquer extração de clorofila das células.

Detectamos clorofila no extrato bruto e, em seguida, usamos sonicação para ruptura celular. Com a repetição dos ciclos de sonicação, a concentração de clorofila aumentou. O tempo de homogeneização foi otimizado em 15 segundos.

A homogeneização por cinco segundos e 20 segundos proporcionou rendimentos ligeiramente menores. A adição de cloreto de sódio ou potássio ao tampão PBS ou à água não aumentou a eficiência de extração das ficobiliproteínas, assim como a extração em tampão acetato de sódio. O tempo de extração das ficobiliproteínas foi otimizado para 60 minutos, pois após 120 e até 240 minutos, a concentração de ficobiliproteínas não se alterou significativamente.

Certifique-se de que a absorbância em 615, 652 e 720 nanômetros se encaixa na faixa de absorbância próxima do espectrofotômetro. O espectrofotômetro usado neste protocolo mostra a faixa de absorbância próxima entre 0,1 e três. Comparamos várias equações de quantificação de ficobiliproteínas espectrofotométricas conhecidas da literatura.

A equação de Bennett e Bogorad proporcionou a melhor reconstrução do conteúdo de ficocianina e aloficocianina nos padrões de pigmento com concentrações proteicas conhecidas. As diferenças entre as equações individuais estão relacionadas com variações nos coeficientes de extinção de ficobiliproteínas do organismo específico. O uso de sulfato de estreptomicina não levou à redução da clorofila A nas amostras em que a sonicação foi aplicada ou evitada.

Como dados representativos, determinamos o conteúdo de ficobiliproteínas em células de Synechocystis. O teor de ficobiliproteínas diminuiu com o aumento da luz. O protocolo foi estabelecido para minimizar os requisitos de tempo e equipamento para a análise escrita de pigmentos que pode ser realizada em qualquer laboratório padrão de ciências vivas.

Além disso, o protocolo contém duas outras etapas, como liofilização do pellet celular e extração de proteínas. O tempo total de trabalho de parto para a quantificação dos ficobilissomos não é superior a duas horas.