Name: Perfil de compatibilidade biológica em biomateriais para regeneração óssea (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Aprenda a avaliar a biocompatibilidade de biomateriais ósseos usando técnicas in vitro e in vivo. Este método multidisciplinar permite prevenir respostas imunes e prever a eficácia de materiais para regeneração óssea em modelos preclínicos.

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Este projeto de pesquisa recebeu financiamento do sétimo programa-quadro da União Europeia (FP7/2007-2013) sob concessão acordo n. º 263363.

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<li>Lo, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+a+critical-sized+calvarial+defect+model+using+adipose-derived+stromal+cells+harvested+from+lipoaspirate%5BTitle%5D)+AND+%22Jove-Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Repair of a critical-sized calvarial defect model using adipose-derived stromal cells harvested from lipoaspirate.</a> Jove-Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).</li>
<li>Gosain, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenesis+in+calvarial+defects%3A+contribution+of+the+dura%2C+the+pericranium%2C+and+the+surrounding+bone+in+adult+versus+infant+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Osteogenesis in calvarial defects: contribution of the dura, the pericranium, and the surrounding bone in adult versus infant animals.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 112 (2), 515-527 (2003).</li>
<li>Levi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dura+mater+stimulates+human+adipose-derived+stromal+cells+to+undergo+bone+formation+in+mouse+calvarial+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Dura mater stimulates human adipose-derived stromal cells to undergo bone formation in mouse calvarial defects.</a> Stem Cells. 29 (8), 1241-1255 (2011).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Aqui, nós mostramos uma abordagem multidisciplinar para a avaliação pré-clínica de biocompatibilidade de biomateriais representativos desenvolvido para regeneração óssea e reparação. Nós testamos as respostas de OBs, OCs, e a resposta de cura em vivo em um defeito ósseo crítica do modelo em ratos, bem como em vitro e em vivo respostas imunes. Objetivo demonstrar como os ensaios funcionam e resumem os dados e as conclusões derivadas do exame dos biomateriais. Mostramos que nossa estratégia gera ...

Reparo ósseo é um processo complexo que começa com a formação de hematoma, inflamação, formação e remodelação em seguida1,2de calos. No entanto, o potencial de regeneração óssea é limitada ao tamanho do osso fratura1,3. Por exemplo, grandes fraturas causadas por trauma, câncer ou osteoporose não podem curar e são chamadas de não-união óssea de fraturas. Estas lesões ósseas, muitas vezes, exigem tratamento para promover a regeneração e reparação óssea fisiológica saudável. Atualmente, o auto-enxerto e aloenxerto transplante ósseo é a abordagem de escolha4 com procedimentos de substituição óssea 2,2 milhões anualmente5. Embora esses procedimentos têm uma elevada taxa de sucesso, pode haver complicações, por exemplo, a limitada disponibilidade de osso, infecção, morbidade do sítio doador e rejeição4. Novas alternativas para a engenharia de tecido ósseo estão a ser procuradas para enfrentar estes desafios.
O design dos biomateriais baseados em polímeros naturais ou sintéticos, biocerâmicas ou metais em combinação com células e moléculas bioativas é sobre a ascensão de6. Nossa compreensão atual do osso fisiológico cura e cura no contexto de biomateriais depende de vários fatores, tais como propriedades mecânicas e múltiplos fatores locais e sistêmicos, incluindo células da circulação e o local da fratura7 ,8,9. Biomateriais para regeneração óssea visam promover osteogenicity e osseointegração10 e são idealmente biocompatível, biodegradável e porosa (promovendo a migração celular, oxigênio e nutrientes). Eles também precisam ser suficientemente fortes para suportar o local da fratura para aliviar a dor. Além disso, fatores inflamatórios são necessários para iniciar o processo de cicatrização. No entanto, se o biomaterial induz inflamação excessiva e respostas alérgicas, isso pode limitar ou inibir11,12de consolidação óssea. Assim, numa abordagem interdisciplinar é necessária avaliar biomateriais desenvolvidos para reparação óssea.
Neste estudo, apresentamos uma avaliação pré-clínica de materiais representativos, 1) Orthovita Vitoss espuma, que é o substituto de enxerto ósseo esponjoso comercialmente disponível, consistindo de fosfato tricálcico composta de nanômetros de tamanho puro β-tricálcio partículas de fosfato (β-TCP) e colágeno bovino tipo 1 (C) (β-TCP/C espuma) e 2) discos de β-TCP. Aqui, ilustramos teste de biocompatibilidade destes biomateriais usando primário osteoblastos (OB) e ensaios de osteoclasto (OC), um modelo in vivo de reparação óssea, avaliação imunológica, compreendendo em vitro proliferação dos linfócitos T e produção de citocinas e na vivo imunogenicidade e alergenicidade, como relatado anteriormente13.

<table><tbody><tr><td>Biomaterials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&beta;-discos de fosfato tricálcico (&beta;-TCP, 14 mm)</td><td></td><td></td><td>Os discos foram sinterizados em mufla a uma temperatura de 1150 °C. Uma descrição detalhada da produção pode ser encontrada em Zimmer et al (doi: 10.1002/jbm.a.34639). As amostras foram irradiadas com UV (15 min para cada lado) antes de serem usadas em culturas de células.</td></tr><tr><td>Espuma Orthovita Vitoss (espuma &beta;-TCP/C)</td><td>Orthovita</td><td>2102-1405</td><td></td></tr><tr><td>Cultura de osteoblastos de camundongo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alizarin Red S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5533</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de ensaio ALP (2x) pH 10,4</td><td></td><td></td><td>Dissolva 200 mM de glicina, 2 mM de cloreto de magnésio, 2 mM de cloreto de zinco em água ultrapura e ajuste para pH 10.</td></tr><tr><td>Meio de crescimento ósseo (BGM)</td><td></td><td></td><td>&alfa;-MEM + 10% de FBS inativado por calor + 1% de penicilina/estreptomicina</td></tr><tr><td>Tampão de lise celular: Tampão de lise celular CyQuant 20x concentrado</td><td>Thermo Scientific</td><td>C7027</td><td>Dilua o estoque de tampão de lise celular concentrado 20 vezes em água ultrapura.&nbsp;</td></tr><tr><td>Reagente de viabilidade celular: Reagente de viabilidade celular Presto Blue</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>A13261</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase tipo IV de clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensaio de proteína DC II</td> O kit de ensaio de proteína DC <td>Bio Rad</td><td>5000112</td><td>contém reagente A, reagente B, reagente S e BSA para o padrão de referência. Para o reagente A', adicione 20 &micro; L reagente S a 1000 &micro; L reagente A.&nbsp;</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>Filtro estéril DMSO antes do uso.&nbsp;</td></tr><tr><td>Dispase II (protease neutra, grau II)</td><td>Roche</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>EnzCheck Kit de Ensaio de Fosfatase para atividade de fosfatase alcalina&nbsp;</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>E12020</td><td>EnzCheck Phosphatase Assay Kit contém 6,8-difluoro-4-metilumbelliferil fosfato (DiFMUP), N,N-dimetilformamida e 6,8-difluoro-7-hidroxi-4-metilcumarina (DiFMU).&nbsp;</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Solução de formalina tamponada neutra 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de hexadecilpirdínio (cetilpiridínio) monohidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9002</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-ascórbico 2-fosfato sesquimagnésio sal hidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio hexahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>MEM alfa médio (&alpha;-MEM)</td><td>Gibco Life Technologies&nbsp;</td><td>11900-073</td><td></td></tr><tr><td>Meio de mineralização osteogênica (MM)</td><td></td><td></td><td>&alfa;-MEM + 10% de FBS inativado por calor + 1% de penicilina-estreptomicina + 50 &micro; g/mL de ácido ascórbico + 5 mM de &beta;-glicerofosfato</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS) pH 7.4</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>10010023</tr><tr><td>Sigmafast BCIP/NBT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5655</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,5%), sem vermelho de fenol (10x)</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>15400054</td><td>Dilua a solução concentrada em 10 vezes em 1x PBS.</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Água ultrapura: Água de cultura de células livre de pirogênio</td><td>VWR</td><td>L0970-500</td><td></td></tr><tr><td>Tampão</td><td></td><td></td> de lavagem <td>Adicione&nbsp; 0,05% Tween20 a 1x PBS.</td></tr><tr><td>Cloreto de zinco</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.08816</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-glicerofosfato sal dissódico hidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5422</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura em suspensão de 24 poços</td><td>Greiner bio-one</td><td>662102</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos de 24 poços</td><td>Greiner bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cônico de 50 mL</td><td>Greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Placa preta de 96 poços</td><td>Greiner bio-one</td><td>655076</td><td></td></tr><tr><td>Placa transparente de 96 poços</td><td>Greiner bio-one</td><td>655001</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga: VWR Mega Star 600R</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2-Incubadora: HeraCell 240</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryovial 2 mL</td><td>Greiner bio-one</td><td>122263</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de filtro descartável FP30/0.2 CA-S</td><td>GE Healthcare Life Sciences Whatman</td><td>10462200</td><td>Para filtração estéril de solução enzimática.</td></tr><tr><td>Scanner de mesa: Epson Perfection 1200 Photo</td><td>Epson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Infinite M200 Pro leitor de microplacas</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga: Eppendorf tube safe-lock 0,5 mL</td><td>VWR</td><td>20901-505</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga: Eppendorf tube safe-lock 1,5 mL</td><td>VWR</td><td>21008-959</td><td></td></tr><tr><td>Shaker Swip (orbital e horizontal)&nbsp;</td><td>Edmund Buehler&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubadora agitada GFL3032</td><td>GFL&nbsp;</td><td>3032</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta descartável: pipeta de soro</td><td>Greiner bio-one</td><td>612301</td><td></td></tr><tr><td>Instrumentos estéreis (tesoura, pinça, pinça curva)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos (10 cm)</td><td>Greiner bio-one</td><td>664960</td><td></td></tr><tr><td>Co-cultura de osteoblastos-osteoclastos de camundongo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1&alpha;,25- Dihidroxivitamina D3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>17936</td><td>1000x estoque concentrado (10 &micro; M em etanol 100%)</td></tr><tr><td>Acetona</td><td>VWR Chemicals</td><td>22065.327</td><td></td></tr><tr><td>Meio de crescimento ósseo (BGM)</td><td></td><td></td><td>&alpha;-MEM + 10% FBS inativado por calor + 1% penicilina-estreptomicina</td></tr><tr><td>Água destilada</td><td>Carl Roth</td><td>3478.4</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (100% vol/vol)</td><td>VWR Chemicals</td><td>20821.365</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (70% vol/vol)</td><td>VWR Chemicals</td><td>93003.1006</td><td></td></tr><tr><td>Sal LB violeta vermelho rápido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3381</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Solução de formalina tamponada neutra 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>MEM alfa Medium (&alpha;-MEM)</td><td>Gibco Life Technologies&nbsp;</td><td>11900-073</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Dimetilformamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>Naftol AS-MX fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4875</td><td></td></tr><tr><td>Meio de diferenciação de osteoclastos (DM)</td><td></td><td></td><td>&alfa;-MEM + 10% FBS inativado por calor + 1% penicilina-estreptomicina + 1 nM 1,25-(OH)2-vitamina D3 + 1 &micro; M prostaglandina E2&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS) pH 7.4</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>10010023</tr><tr><td>Prostaglandina E2 (PGE2)</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>9003016</td><td>estoque concentrado 1000x (1 mM em etanol 100%)</td></tr><tr><td>Acetato de sódio trihidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7670</td><td></td></tr><tr><td>Tartarato de sódio dibásico di-hidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8640</td><td></td></tr><tr><td>Instrumentos estéreis (tesouras, pinças, bisturi)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRAP tampão pH 5,0</td><td></td><td></td><td>Dissolver 40 mM de acetato de sódio, 10 mM de tartarato de sódio em água ultrapura e ajustar a pH 5.</td></tr><tr><td>Água ultrapura: Água de cultura de células sem pirogénio</td><td>VWR</td><td>L0970-500</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura em suspensão de 24 poços</td><td>Greiner bio-one</td><td>662102</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos de 24 poços</td><td>Greiner bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cónico de 50 mL</td> Centrífuga <td>de 227261</td><td></td><td>Greiner bio-one</td></tr><tr><td>: VWR Mega Star 600R</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de CO2: HeraCell 240</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de wafering de diamante (10,2 cm x 0,3 cm)</td>Serra de baixa velocidade <td>Buehler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isomet Placa de</td> Petri <td>Buehler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(6 cm)</td><td>Greiner bio-one</td><td>628.161</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de vidro com tampa de rosca 20 mL</td><td>Carl Roth</td><td>EXY4.1</td><td></td></tr><tr><td>Seringa estéril de uso único 1 mL</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>9003016</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta descartável: pipeta de soro</td><td>Greiner bio-one</td><td>612301</td><td></td></tr><tr><td>Agulha estéril: Agulha hipodérmica RW 27 G x 3/4''Henry</td> <td>Schein Animal Health</td><td>9003340</td><td></td></tr><tr><td>Modelo de defeito calvarial de camundongo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analgesia: Buprenorfina (Bupaq)</td><td>Richter Pharma AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anestesia: Cetamina (Ketamidor), Xilazina (Rompun)</td><td>Richter Pharma AG/Bayer HealthCare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Esterilizante a frio: SafeSept Max</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>9882765</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (70% vol/vol)</td><td>VWR Chemicals</td><td>93003.1006</td><td></td></tr><tr><td>Pomada para os olhos: VitA POS 5 g</td><td>Ursapharm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução salina normal (solução de cloreto de sódio a 0,9%)</td><td>Fresenius Kabi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS) pH 7.4</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>10010023</tr><tr><td>Solução de iodopovidona: Braunol 1000 mL</td><td>B. Braun</td><td>3864154</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Histofix 4,5% de formalina tamponada</td><td>Carl Roth</td><td>2213.6</td><td></td></tr><tr><td>Adesivo tecidual: Histoacryl 5 x 0,5 mL&nbsp;</td><td>B. Braun Surgical</td><td>1050060</td><td></td></tr><tr><td>Equipamento de proteção individual: luvas cirúrgicas, touca e máscara, bata</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>1045073, 1026614, 9009062, 370406</td><td></td></tr><tr><td>Instrumentos estéreis (bisturi, tesoura, fórceps, porta-agulhas)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agulhas estéreis: Agulhas hipodérmicas RW 27 G x 3/4'' e 30 G x 1/2''&nbsp;</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>9003340, 9003630</td><td></td></tr><tr><td>Seringa estéril descartável de uso único 1 mL</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>9003016</td><td></td></tr><tr><td>Placa de aquecimento: Physitemp</td><td>Rothacher Medical</td><td>TCAT-2LV</td><td></td></tr><tr><td>Cotonetes de gaze estéreis</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>220192</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi descartável estéril (Figura 20)</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>9008957</td><td></td></tr><tr><td>Broca cirúrgica/odontológica: Implantmed SI-923</td><td>W& H Dentalwerk B&uuml; rmoos GmbH</td><td>16929000</td><td></td></tr><tr><td>Peça de mão tipo S-II</td><td>W& H Dentalwerk B&uuml; rmoos GmbH</td><td>30056000</td><td></td></tr><tr><td>Trefina, diâmetro 4 mm</td><td>Hager& Meisinger GmbH</td><td>229040</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de tubos de irrigação 2,2 m</td><td>W& H Dentalwerk B&uuml; rmoos GmbH</td><td>4363600</td><td></td></tr><tr><td>Elevador periosteal 2 mm / 3 mm</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>472683</td><td></td></tr><tr><td>Sutura não reabsorvível: Verde poliéster, DS19, met. 1.5, USP 4/0 75 cm</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>300715</td><td></td></tr><tr><td>In vitro respostas imunes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anestesia para eutanásia: Cetamina (Ketamidor), Xilazina (Rompun)</td><td>Richter Pharma AG/Bayer HealthCare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proliferação Celular ELISA, Kit de Ensaio BrdU (colorimétrico)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11647229001</td><td>O kit contém solução de marcação BrdU, solução de fixação (FixDenat), solução de anticorpo Anti-BrdU, tampão de lavagem e solução de substrato.&nbsp;</td></tr><tr><td>Concanavalina A ()</td><td>MP Biomedicals</td><td>150710</td><td></td></tr><tr><td>Meio de cultura esplenócitos</td><td></td><td></td><td>RPMI médio + 10% FBS inativado por calor + 1% solução de penicilina-estreptomicina + 0,1% gentamicina + 0,2% -mercaptoetanol + 1% aminoácidos não essenciais</td></tr><tr><td>Etanol (70% vol/vol)</td><td>VWR Chemicals</td><td>93003.1006</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific& nbsp;</td><td></td><td></td>10500064</tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>15750037</tr><tr><td>Mouse IL-1&beta; ELISA Ready-SET-Go!</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>88-7013-88</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IL-2 ELISA MAX Padrão</td><td>BioLegend</td><td>431001</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IL-4 ELISA MAX Padrão</td><td>BioLegend</td><td>431101</td><td></td></tr><tr><td>Mouse INF-&gama; ELISA MAX Standard</td><td>BioLegend</td><td>430801</td><td></td></tr><tr><td>Solução de aminoácidos não essenciais</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>11140050</tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina&nbsp;</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>15140122</tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS) pH 7.4</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>10010023</tr><tr><td>Tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC): BD Pharm Lyse</td><td>BD Bioscience</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>meio RPMI 1640, HEPES</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>52400025</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoetanol</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>31350010</tr><tr><td>Tubo cônico de 50 mL</td><td>Greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultura de tecidos de 96 poços</td><td>Greiner bio-one</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga: VWR Mega Star 600R</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células 40 &micro; m</td><td>BD Bioscience</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Infinite M200 Pro leitor de microplacas</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringa estéril de uso único 1 mL</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>9003016</td><td></td></tr><tr><td>Instrumentos cirúrgicos estéreis (fórceps, lâminas de vidro)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>Modelo intraperitoneal de alto rendimento</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anestesia: Cetamina (Ketamidor), Xilazina (Rompun)</td><td>Richter Pharma AG/Bayer HealthCare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Esterilizante a frio: SafeSept Max</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>9882765</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (70% vol/vol)</td><td>VWR Chemicals</td><td>93003.1006</td><td></td></tr><tr><td>Pomada para os olhos: VitA POS 5 g</td><td>Ursapharm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse IL-1&beta; ELISA Ready-SET-Go!</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>88-7013-88</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IL-2 ELISA MAX Padrão</td><td>BioLegend</td><td>431001</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IL-4 ELISA MAX Padrão</td><td>BioLegend</td><td>431101</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS) pH 7.4</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>10010023</tr><tr><td>Solução de iodopovidona: Braunol 1000 mL</td><td>B. Braun</td><td>3864154</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Rapid-Chrome Kwik-Diff Staining Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>9990700</td><td>Para contagem diferencial de células.</td></tr><tr><td>Placa de aquecimento: Physitemp</td><td>Rothacher Medical</td><td>TCAT-2LV</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitômetro: Câmara Neubauer</td><td>Carl Roth</td><td>PC72.1</td><td></td></tr><tr><td>Sutura não reabsorvível: Ethibond Excel 4-0</td><td>Ethicon</td><td>6683H</td><td></td></tr><tr><td>Sutura reabsorvível: Polysorb</td><td>Covidien</td><td>SL-5628</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Shandon para citopsina</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringa estéril de uso único 1 mL</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>9003016</td><td></td></tr><tr><td>Cotonetes de gaze estéreis</td><td>Henry Schein Animal</td><td>Health 220192</td><td></td></tr><tr><td>Agulhas estéreis: Agulhas hipodérmicas RW 27 G x 3/4'' e 25 G</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>9003340, 420939</td><td></td></tr><tr><td>Instrumentos cirúrgicos estéreis (bisturi, tesoura, fórceps, porta-agulhas)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução azul de tripano 0,4%</td> <td>Gibco, Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Modelo subcutâneo subcrónico</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anestesia: Cetamina (Ketamidor), Xilazina (Rompun)</td><td>Richter Pharma AG/Bayer HealthCare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Esterilizante a frio: SafeSept Max</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>9882765</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (70% vol/vol)</td><td>VWR Chemicals</td><td>93003.1006</td><td></td></tr><tr><td>Pomada para os olhos: VitA POS 5 g</td><td>Ursapharm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS) pH 7.4</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>10010023</tr><tr><td>Solução de iodopovidona: Braunol 1000 mL</td><td>B. Braun</td><td>3864154</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Histofix 4,5% tamponado formalina</td><td>Carl Roth</td><td>2213.6</td><td></td></tr><tr><td>Placa de aquecimento: Physitemp</td><td>Rothacher Medical</td><td>TCAT-2LV</td><td></td></tr><tr><td>Sutura não reabsorvível: Ethibond Excel 4-0</td><td>Ethicon</td><td>6683H</td><td></td></tr><tr><td>Equipamento de proteção individual: cirúrgico luvas, touca e máscara, bata</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>1045073, 1026614, 9009062, 370406</td><td></td></tr><tr><td>Seringa estéril descartável 1 mL</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>9003016</td><td></td></tr><tr><td>Cotonetes de gaze estéreis</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>220192</td><td></td></tr><tr><td>Instrumentos estéreis (bisturi, tesoura, fórceps, porta-agulhas)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agulha estéril: Agulhas hipodérmicas RW 27 G x 3/4''&nbsp;</td><td>9003340 de Saúde Animal Henry Schein</td><td>, 420939</td><td></td></tr></tbody></table>

perfil de compatibilidade biológica em biomateriais para regeneração óssea

Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration

Fraturas de grandes não-união óssea são um desafio significativo em cirurgia ortopédica. Embora autoe enxertos ósseos alogênico são excelentes para a cura dessas lesões, existem complicações potenciais com a sua utilização. Assim, materiais cientistas estão desenvolvendo biomateriais sintéticos, biocompatíveis para superar esses problemas. Neste estudo, apresentamos uma plataforma multidisciplinar de avaliação de biomateriais para reparo ósseo. Nós combinamos conhecimentos de biologia óssea e Imunologia para desenvolver uma plataforma incluindo em vitro osteoclast (OC) e ensaios de osteoblastos (OB) e na vivo modelos de rato de reparação óssea, imunogenicidade e alergenicidade. Vamos demonstrar como realizar os experimentos, um resumo dos resultados e relatório sobre a biocompatibilidade de biomateriais. Em particular, nós testamos a viabilidade de OB, diferenciação, mineralização e viabilidade OC e diferenciação no contexto de discos de β-tricálcio fosfato (β-TCP). Nós também testamos uma β-TCP/colágeno (β-TCP/C) espuma, que é um material disponível comercialmente usado clinicamente para reparo ósseo em um modelo de mouse de defeito de tamanho crítico raspagem óssea para determinar os efeitos na fase inicial de consolidação óssea. Em experiências paralelas, avaliaram-se respostas imunes e alérgicas em ratos. Nossa abordagem gera um perfil de compatibilidade biológica de um biomaterial osso com uma gama de parâmetros necessários para prever a biocompatibilidade de biomateriais utilizados para consolidação óssea e reparação em pacientes.

Para avaliar a β-TCP para sua eficácia como um biomaterial para reparo ósseo, usamos in vitro e em vivo métodos de triagem. Em primeiro lugar, Nós medimos as respostas de OB para os discos de β-TCP em comparação com controles sozinho médio de linha de base. A Figura 2 demonstra a viabilidade de OB em resposta aos discos de β-TCP em 7 a 14 dias de cultura. Viabilidade celular, medida a partir de células metabolicamente ativas dos poços de cul...

O número de novos biomateriais, projetado para a reparação de lesões ósseas grande está expandindo continuamente com o objectivo de reforçar a consolidação óssea e superar as complicações associadas com o transplante de osso. Aqui, apresentamos uma estratégia multidisciplinar para testes de pré-clínica biocompatibilidade de biomateriais para reparo ósseo.

Perfil de compatibilidade biológica em biomateriais para regeneração óssea

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such ...

Esses métodos podem ajudar a responder às principais perguntas no campo dos biomateriais. Especialmente para a regeneração óssea. Eles são usados para avaliar a eficácia de biomateriais e potenciais respostas imunológicas.A principal vantagem dessa plataforma multidisciplinar é que ela fornece uma gama de parâmetros para prever a biocompatibilidade de biomateriais utilizados para reparação óssea. As implicações dessas técnicas ósseas in vitro e in vivo se estendem para outras doenças ósseas. Devido à necessidade de triagem pré-clínica de novos biomateriais ortopédicos.A metodologia dermatológica pode fornecer insights sobre biomateriais para a cicatrização óssea, também pode ser aplicada a avaliações biomateriais para qualquer outra indicação clínica. Média de cultura aspirada dos osteoblastos primários 14 dias após a adição do meio de mineralização osteogênica. Enxágüe duas vezes com 0,5 mililitros de 1X PBS.Em seguida, fixar as células adicionando 0,5 mililitros de solução de formalina 10% tamponada e incubando à temperatura ambiente por 10 minutos. Após 10 minutos, aspire a formalina 10% tamponada com uma tubulação de uso único e lave duas vezes com 0,5 mililitros de água ultrapura. Em seguida, adicione 250 microliters de 40 mililitros solução de coloração Alizarin Red S aos osteoblastos fixos.E incubar a placa em temperatura ambiente por 10 minutos em um shaker a 100 shakes por minuto. Seguindo a incubação com solução de coloração, aspire a solução de coloração com uma tubulação de uso único e enxágue com um mililitro de água ultrapura. Repita esta etapa cinco a dez vezes até que a solução de lavagem saia clara para remover manchas não específicas.Depois de aspirar a lavagem final, adicione um mililitro de PBS frio. E incubar a placa em temperatura ambiente por 10 minutos em um shaker como antes. Em seguida, transfira os discos de fosfato beta tricálculo manchados para um novo poço e escaneie as placas com um scanner de localização para registrar a mineralização.Após a captura da imagem, adicione 250 microliters de solução de cloreto de cetilítrio de 10% e agite por 15 minutos para extrair o corante Alizarin Red S. Em seguida, transfira a solução dos poços para tubos individuais de 1,5 mililitros e centrífuga a 17.000 x g por cinco minutos em temperatura ambiente. Diluir o extrato com solução de cloreto de cetilítrio de 10% a uma ração de diluição de 1:10 a 1:20 em um tubo de 1,5 mililitro.Em seguida, transfira 300 microliters de cada amostra diluída para os poços da placa de 96 poços. Inclua dois poços em branco contendo apenas 10% de cloreto de cetilítrio. Em seguida, prepare sete padrões de referência Alizarin Red S que variam de 4 400 micromolar, diluindo a solução de coloração Alizarin Red S de 40 miliômlares com solução de cloreto de cetilítrio de 10% para gerar uma curva padrão.Carregue 300 microliters de cada padrão na placa. Por fim, leia os absorventes das amostras, espaços em branco e padrões de referência em 520 nanômetros. Isole os precursores do osteoplasto da medula óssea dos fêmures e tíbias de um rato eutanizado usando uma tesoura estéril para remover as pernas do corpo na articulação do quadril.Corte os membros nas articulações do joelho e tornozelo e remova o tecido mole com bisturi estéril e fórceps. Corte as epífitas. Insira uma agulha de calibre 27 presa a uma seringa cheia com um mililitro de meio de crescimento ósseo no lúmen e jogue a medula em uma placa de Petri estéril de seis centímetros.Depois de repetir isso para todos os fêmures e tíbias, transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 50 mililitros. Lave a placa petri de seis centímetros com cinco mililitros de meio de crescimento ósseo e transfira-a para o mesmo tubo cônico de 50 mililitros. Centrifugar a 350 x g a quatro graus Celsius por cinco minutos.Após a centrifugação suspender as células em um mililitro por poço de meio de diferenciação osteoclasta. Um rato BALB/c fornece um número suficiente de precursores de osteoclato para uma placa de cultura de 24 poços. Adicione os osteoblastos primários suspensos no meio de crescimento ósseo no bioma material e nos controles a 8,8 * 10^4 células por centímetro quadrado.Discos de fosfato de tricálcio beta, osso bovino controlado e plástico de cultura tecidual são usados aqui. Incubar a 37 graus celsius em 5% de dióxido de carbono por 24 horas. Após 24 horas, adicione precursores de osteoclatos de medula óssea recém-isolados e meio de diferenciação osteoclasta aos osteoblastos primários cultivados e retorne à incubadora por cinco dias de cultura a 37 graus celsius a 5% de dióxido de carbono.Substitua o meio por meio de diferenciação osteoclasta recém-preparado a cada dois dias. Em seguida, colorir os osteoclatos para fosfattase ácida resistente ao tartarato para avaliar a diferenciação. Raspe o couro cabeludo de um rato BALB/c de oito semanas de idade anestesiado e limpe a superfície com solução de iodo povidone de 7,5% e 70% de etanol.Cubra os olhos com pomada oftálmica para evitar a secagem durante o procedimento. Certifique-se de um nível adequado de anestesia por falta de reação a um dedo do dedo do sol e uma pitada de cauda. Em seguida, depois de fazer uma incisão sagital média remover os tecidos conjuntivos de paracranium acima do osso parietal direito raspando-o com um bisturi.Em seguida, use uma trefina dentária estéril com um diâmetro de quatro milímetros a 2000 rotações por minuto para criar um defeito de tamanho crítico no osso parietal direito. Irrigar constantemente a região com solução salina estéril, ao mesmo tempo em que entedia o osso parietal direito e corta através do ectocortexto e algum endocórtex. Para evitar danos ao Dera Mater, use um pequeno elevador periosteal para quebrar o endocortex restante.Em seguida, use fórceps para levantar cuidadosamente o osso calvarial e removê-lo. O defeito resultante deve ser circular e aproximadamente 3,5 milímetros de diâmetro. Em seguida, encha o defeito calvarial com espuma de colágeno de fosfato de tricálculo beta tricálculo, preso em PBS estéril.Para manter o biomamaterial no lugar, aplique 0,5 microliters de adesivo tecidual no final do defeito em dois pontos opostos. Em seguida, feche a pele com uma sutura nãoabsorbável. Coloque um rato anestesiado nas costas, raspe a pele abdominal e limpe a superfície raspada com solução de iodo povidone de 7,5% e 70% de etanol.Depois de fazer uma incisão média de oito milímetros através da pele ao longo da linha alba do abdômen, implante pbs bioma material encharcado sob a pele. Em seguida, suturar a pele com uma sutura nãoabsorbável. Oito semanas após a implantação, extirpa o local de implantação com tecido circundante do rato eutanizado.Esta imagem demonstra que o crescimento em discos de fosfato beta tricálgio mostrados em barras abertas não afeta a viabilidade do osteoblasto em comparação com o crescimento na cultura tecidual plástico aos sete e 14 dias de cultura. Osteoblastos cultivados foram manchados com Alizarin Red S após 14 dias. A mineralização foi maior para controles médios de mineralização em comparação com os osteoblastos cultivados apenas em médios.E em discos beta tricalcium fosfato em poços de cultura de suspensão. Quando um defeito calvário de tamanho crítico induzido cirurgicamente foi deixado vazio, uma camada fina cobrindo todo o defeito foi observada, mas nenhuma formação óssea significativa estava presente em 12 semanas após a operação. Em contraste, quando o defeito continha espuma de colágeno de fosfato de tricálcio beta, remanescentes de espuma cercados por tecido fibroso denso, incluindo alguns vasos sanguíneos e células inflamatórias, a ponte da área de defeito sem evidência de formação óssea.Após a implantação da espuma de fosfato de fosfato beta tricálculo subcutâneo, observou-se uma resposta inflamatória com células gigantes do corpo estranho em seções de hematoxilina e eosina manchadas de uma evidência de fibrose nas seções manchadas de tricromático de Masson em oito semanas. Em contraste, o local de implantação dos controles falsos apresentava inflamação mínima e nenhuma fibrose. Ao tentar este procedimento é importante fazer um entalhe preciso e reprodutível do calvarium sem machucar o animal.Seguindo outros métodos deste procedimento, como os ensaios de diferenciações osteoclasta e alta produtividade em modelos imunológicos peritoneal podem ser pré-formados a fim de responder a perguntas adicionais como a resposta do osteoclante a biomateriais e tipo de resposta imune.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

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