Dinâmica proteómica e miRNA análise de polissomos de coração de rato isolado após Langendorff perfusão

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre a síntese dinâmica de proteínas e o proteoma envolvido no processo. Essa técnica permite a identificação dos mRNAs que estão sendo selecionados para tradução, os microRNAs que podem participar do processo e interferir na tradução e as proteínas que contribuem para a tradução de proteínas ou estão sendo traduzidas. Este método pode fornecer informações sobre as respostas cardíacas ao estresse, mas também pode ser aplicado ao estudo das respostas agudas ao estresse em outros órgãos.

Demonstrando o procedimento estará Miroslava Stastna, cientista do projeto do laboratório de Jennifer Van Eyk. No dia do experimento, encha o compartimento esquerdo de um misturador de gradiente com cinco mililitros de solução de gradiente de sacarose a 15% e encha o compartimento direito com cinco mililitros de solução de gradiente de sacarose a 50%. Abra a torneira e ligue a bomba para agitar os dois pequenos compartimentos com um agitador magnético e use um tubo ligado à segunda torneira para permitir que as soluções misturadas de sacarose fluam para um único tubo de ultracentrífuga com paredes finas no gelo.

Em seguida, homogeneizar o tecido cardíaco fresco ou congelado com um POLYTRON em tampão de lise filtrado por 15 segundos no gelo. No final da incubação, centrifugue o lisado para remover o material insolúvel e colha o sobrenadante. Separe 50 microlitros do sobrenadante para determinação de proteínas, isolamento de RNA e análise de integridade de RNA e coloque 100 a 500 microlitros do sobrenadante restante sobre a solução de gradiente.

Use tampão de lise fresco para equilibrar os volumes entre os dois tubos de gradiente e ultracentrifugue as amostras em uma ultracentrífuga com um rotor de caçamba oscilante. Tenha muito cuidado para não perturbar o gradiente de sacarose antes ou depois da centrifugação. Para coletar os gradientes, programe o coletor de frações para descartar os três primeiros minutos de coleta e coletar as frações pesadas, leves e não translacionais à velocidade de um mililitro por minuto em 17 frações de quatro a 19 minutos com monitoramento contínuo da absorbância a 254 nanômetros.

Coloque cada fração no gelo assim que for coletada. Em seguida, armazene as amostras a menos 80 graus Celsius, se não estiverem sendo processadas imediatamente. Para extrair proteínas das frações polissômicas, combine as frações de sacarose coletadas em três frações finais e marque as frações como pesadas, leves e não traduzidas.

Misture 0,5 mililitros de cada amostra com 60 microlitros de ácido tricloroacético a 100% ou TCA. Incube as frações durante a noite a menos 20 graus Celsius no escuro. Na manhã seguinte, descongele as amostras no gelo antes de peletizar as proteínas por centrifugação.

Descarte os sobrenadantes e lave os pellets duas vezes com 0,5 mililitros de acetona gelada de menos 20 graus Celsius por centrifugação. Certifique-se de que o pellet, após a precipitação do TCA, esteja completamente dissolvido, usando sonicação por pulso para garantir a solubilização completa, conforme necessário. Seque os pellets ao ar livre após a última lavagem antes da ressuspensão em 360 microlitros de tampão Tris-HCl.

Em seguida, adicione 40 microlitros de ditiotreitol para uma incubação de 45 minutos a 55 graus Celsius com agitação. No final da incubação, adicione 50 microlitros de iodoacetamida às amostras para uma incubação de 30 minutos no agitador à temperatura ambiente, protegida da luz, seguida de digestão das amostras com uma proporção de tripsina para proteína de um para 50 pesos para uma incubação noturna a 37 graus Celsius. Na manhã seguinte, após o resfriamento, centrifugue brevemente as amostras e ajuste o pH para dois a três com ácido fórmico a 10% para extinguir a atividade da tripsina.

Para dessalinizar as amostras, primeiro condicione o sorvente nos poços de uma placa de 96 poços com 200 microlitros de metanol três vezes, seguido de condicionamento com 200 microlitros de ácido fórmico a 0,1% por poço três vezes. Em seguida, carregue as amostras em cada poço e lave as amostras três vezes com 200 microlitros de ácido fórmico a 0,1% por lavagem. Usando gravitação, seguida de baixo vácuo, eluir as amostras com 100 microlitros de ácido fórmico a 0,1% em acetonitrila a 50% duas vezes em um tubo de 0,5 mililitro de baixa retenção de proteína por amostra.

Em seguida, use um concentrador para evaporar os eluatos da amostra até a secura e reconstituir cada pellet de peptídeo tríptico em 50 a 100 microlitros de ácido 0,1% fórmico para análise de espectrometria de massa. A análise de mRNA pode ser realizada para avaliar a distribuição de um mRNA específico de interesse em cada fração ou para quantificação e comparação das frações de tradução polirribossômica combinadas com a fração não traduzida como uma proporção da abundância de mRNA em cada fração. Por exemplo, aqui, são mostradas as mudanças na distribuição do mRNA nas frações de tradução e não tradução após a sujeição do coração de camundongo à isquemia ou reperfusão de isquemia, em comparação com o tratamento cardíaco simulado.

Neste experimento representativo, a análise de um subconjunto de microRNAs nas frações pesadas agrupadas revelou que 22 microRNAs foram associados a polissomas durante a isquemia, nove foram associados durante isquemia e reperfusão e sete foram comuns a ambas as condições, demonstrando que a associação de microRNAs é dinâmica em resposta aos estresses de isquemia e reperfusão. Além disso, a maioria das proteínas ribossômicas mitocondriais foi identificada na fração leve, e a maioria das proteínas ribossômicas citosólicas foi identificada comumente nas frações pesada e leve. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de ter muito cuidado com o gradiente de sacarose.

A precipitação de TCA para extração de proteínas de frações polissômicas foi selecionada em nosso fluxo de trabalho com base na capacidade de processar a fração com alta concentração de sacarose e no número de proteínas identificadas por espectrometria de massas. Geralmente, indivíduos novos neste método podem ter dificuldades devido aos desafios associados à reprodutibilidade do gradiente de sacarose. A precipitação de TCA é vantajosa, pois apenas pequenos volumes são necessários para precipitar as proteínas, o pellet é visível no fundo do tubo e não há acúmulo de sacarose durante a precipitação.