Name: Dinâmica proteómica e miRNA análise de polissomos de coração de rato isolado após Langendorff perfusão (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Aprenda a realizar perfilamento de polissomos em corações de camundongo isolados para estudar síntese proteica dinâmica. Este método permite analisar mRNAs, miRNAs e o proteoma de polissomos envolvidos na tradução proteica.

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HL112730 NIH P01 (pano, JVE), NIH R01 HL132075 (pano, JVE), centro do coração feminino-Barbra Streisand (pano, JVE), Dorothy e Lyon de Phillip E. cadeira em Cardiologia Molecular (RAG), Erika Glazer dotado cadeira na saúde do coração feminino (JVE) e a Academia de Ciências da República Checa Apoio institucional RVO: 68081715 (MS).

Todos os estudos em animais foram realizados em conformidade com as orientações institucionais e aprovados pelo Comitê de uso do Cedars-Sinai Medical Center e institucional Cuidado Animal.
1. Langendorff perfusão do coração de rato
<ol><li>
Perfusão de Langendorff de coração de rato com isquemia e reperfusão
	<ol>
<li>Administrar intraperitoneal de pentobarbital de sódio 70 mg/kg para o rato adulto (8 semanas, macho, C57BL6/j). Confirme a anestesia profunda por falta de retirada aos pés pitada.</li>
		<li>Anticoagular com heparina intraperitoneal 500 U/kg.</li>
		<li>Abra o baú através de incisão esternal. Abra o diafragma e corte ao longo da borda costal ao eixo axilar anterior. Em seguida, corte o eixo axilar anterior até o membro anterior para abrir completamente a caixa torácica. Depois, visualizando o coração, prenda a aorta ascendente com fórceps e impostos especiais de consumo rapidamente o coração. A morte é devido à perda de sangue. Coloque o coração no frio Krebs (NaCl 6,9 g/L, KCl 0,35 g/L, NaHCO3 2,1 g/L, KH2PO4 0,16 g/L, MgSO4 0,141 g/L, glicose 2 g/L e CaCl2 0,373 g/L).</li>
		<li>Canule da aorta com uma agulha de ponta sem corte e perfundir o coração retrogradely com solução de Krebs no modo de pressão constante.</li>
		<li>Após um período de estabilização de 15 min, submeta o coração a uma isquemia não-fluxo global por 30 min, seguido de reperfusão por 30 min.</li>
		<li>Corações de colheita após a perfusão de linha de base de 15 min, após 30 min de isquemia ou após a reperfusão de 30 min. Retire os átrios e snap-congelar o tecido em nitrogênio líquido.</li>
		<li>Armazenar a-80 ° C até o uso</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. sedimentação gradiente de densidade de sacarose, solubilização e homogeneização de tecidos
<ol><li>
Preparação de gradiente
	<ol>
<li>Prepare-se 2 soluções (15% e 50%) de sacarose 100 mL, misturar 4 mL de NaCl 2.5 M; 0,8 mL MgCl2 1.25 M; 1 mL de Tris-HCl 1 M, pH 7,5; 15 g ou 50 g de sacarose (15% e 50%, respectivamente); água ultrapura para chegar a 100 mL; e xileno cianol (0,02 mg/mL) para a solução de 15% de cor</li>
		<li>Filtrar cada solução (0,22 µm filtros)</li>
		<li>O dia em que o gradiente é para ser usado, preparar 40 mL de cada solução de sacarose e acrescentar cicloheximida para cada solução para obter uma concentração final de 100 µ g/mL<ol>
<li>Use um gradiente maker para preparar uma mistura entre as soluções de sacarose de 15% e 50%</li>
			<li>Encha o recipiente esquerdo com 5 mL do gradiente 15% de sacarose</li>
			<li>Encha o recipiente certo com o gradiente de sacarose 50%</li>
			<li>Abra a torneira e ligar a bomba para agitar os dois pequenos compartimentos com agitador magnético</li>
			<li>Uso um tubo ligado à segunda torneira para permitir que a solução de sacarose misto fluir em um tubo de centrifugação-ultra com paredes finas. Volume final será de cerca de 10 mL.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Manter os gradientes a 4 ° C (durante a noite, se necessário, mas não mais)</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Homogeneização do tecido do coração
	<ol>
<li>Homogeneizar o coração fresca ou congelada com um polytron em tampão de Lise filtrada (modificado para fracionamento de gradiente de sacarose) contendo 100 mM KCl, pH do Tris 20mm 7.5, 5 mM MgCl2, 0,4% NP-40. Incluem cicloheximida 100 µ g/mL para manter a estrutura de polysome, inibidor de RNase U 0.1 e inibidor da protease cocktail (1 comprimido de 50 mL).</li>
		<li>Incubar o lisado gelo por 15 min.</li>
		<li>Centrifugar a 18.000 x g durante 15 min a 4 ° C para remover material insolúvel e recolher o sobrenadante.</li>
		<li>Reserva de 50 µ l para determinação da proteína, isolamento de RNA e RNA integridade análise (ver Figura 2).</li>
		<li>O sobrenadante (500 – 100 µ l) de camada em cima os gradientes e equilibrar os tubos com tampão de Lise.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sedimentação e coleção de frações
	<ol>
<li>Execute a ultracentrifugação para 120 min a 37.000 rpm a 4 ° C, em um rotor de balde oscilante. De acordo com o fabricante, isso corresponde a 228.000 x g no raio máximo.</li>
		<li>Recolher cada gradiente como 17 frações (fração de cerca de 600 µ l) em tubos de microcentrifuga com monitoramento contínuo de absorbância a 254 nm (OD254).</li>
		<li>Programa coletor de fração da seguinte forma:<ol>
<li>Descartar o primeiro 3 min da coleção (correspondente ao líquido contido nos tubos antes de gradiente)</li>
			<li>De 4 a 19 min, recolha as frações na velocidade de 1 mL/min em 17 fracções.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Coloque as frações no gelo assim que cada um é coletado. Congele as amostras a-80 ° C, se eles não estão sendo processados imediatamente. Um típico UV densitométricos o rastreamento do gradiente como é recolhida é mostrado na Figura 1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. isolamento e análise de mRNAs de Polysome e frações Nontranslating
<ol><li>
Extração do mRNA
	<ol>
<li>Descongelar as frações no gelo, se fossem congelado após a coleção</li>
		<li>Transfira a 200 µ l de cada fração para um tubo fresco Nota: Neste passo, duas ou mais fracções consecutivas podem ser agrupadas. Deve ser feito depois de analisar o gráfico de254 OD para que frações de polysome e não-polysome não se envolva com cuidado.</li>
		<li>Adicionar 10 ng de luciferase RNA como controle interno de cada amostra para efeito de normalização. Nota: As primeiras demão Luciferase devem ser usadas como um controle interno para normalizar os resultados.</li>
		<li>Adicione 700 µ l de reagente de extração de RNA (monofásico solução de fenol e guanidina isotiocianato; ver Tabela de materiais) para cada tubo. Misture bem e incubar os tubos durante 5 min à RT (temperatura ambiente).</li>
		<li>Adicione 140 clorofórmio µ l e vórtice por 15 s. Incubar durante 2-3 min à RT</li>
		<li>Centrifugar as amostras por 15 min a 12.000 x g a 4 ° C.</li>
		<li>Transferi com cuidado, a fase aquosa superior para um novo tubo.</li>
		<li>Desde que o conteúdo de RNA das frações não é alto, adicione 10 µ g de glicogênio como portador para cada tubo.</li>
		<li>Adicione 350 µ l isopropanol para cada tubo. Misture bem e incubar a-20 º C por 1h aumentar o rendimento.</li>
		<li>Centrifugar por 15 min a 12.000 x g a 4 ° C.</li>
		<li>Desprezar o sobrenadante e adicionar etanol de µ l 700 75% para lavar a pelota do RNA.</li>
		<li>Centrifugue por 5 min a 7.500 x g a 4 ° C.</li>
		<li>Remover o etanol e deixe o ar de sedimento secar por 10 a 15 min. Nota: Ressecamento a pelota do RNA impedirá sua completa solubilização em água.</li>
		<li>Resuspenda o pellet de RNA em 50 µ l de RNase-livre ultrapura H2O.</li>
		<li>Incubar as amostras por 10 min a 55 ° C.</li>
		<li>Use 2 μL de cada amostra para medir a qualidade e a quantidade do RNA extraído e armazenar o restante a-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
QPCR e transcrição reversa
	<ol>
<li>Use 4 μL de síntese do cDNA de transcrição reversa kit (veja a Tabela de materiais) para uma reação de 20 μL. Prepare o supermix de acordo com o número de amostras. Transferir o volume necessário para cada tubo e adicionar 5 μL da entrada do RNA para cada tubo. Este volume pode ser corrigido para ser relevante para o alcance das condições de trabalho do polymerase de Taq.</li>
		<li>Incubar os tubos em um termociclador com o seguinte programa recomendado pelo fabricante: 5 min a 25 ° C, 20 min de transcrição reversa por 20 min a 46 ° C e inativação de transcriptase reversa por 1 min a 95 ° C.</li>
		<li>Execute qPCR com o programa otimizado para cada par de primers. Nota: Para detectar a presença de certos mRNAs em frações, volume igual de cada fração (do RNA isolado) deve ser usado para a transcrição reversa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Análise dos resultados
	<ol>
<li>Use o valor de Ct do gene de interesse e o luciferase para calcular os valores de Ct delta</li>
		<li>Express delta cada fração valor de Ct como a porcentagem do valor total do mRNA contido em todas as frações para visualizar a distribuição do mRNA através das diferentes fracções (tabela 1)</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. isolamento e análise de miRNAs de Polysome frações e frações Nontranslating
<ol><li>
Extração de mRNA e miRNA Nota: Este protocolo segue as instruções do fabricante, com algumas mudanças.<ol>
<li>Descongele o glicogênio e o pico-no controle. Manter-se no gelo.</li>
		<li>Adicione 700 µ l de reagente de extração de miRNA para 200 µ l de amostra em pool.</li>
		<li>Adicionar 1 µ g / µ l de glicogênio e homogeneizá-lo usando a pipeta. -Incube durante 5 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Adicionar 3,5 µ l de 1,6 x 108 pico-no controle e misture.</li>
		<li>Adicionar 200 µ l de clorofórmio e vortex, durante pelo menos 15 segundos.</li>
		<li>Incube durante 3 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Centrifugar a 12.000 x g por 15 min a 4 ° C.</li>
		<li>Utilizando uma pipeta, transfira o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mL. Descarte as fases médio e inferior.</li>
		<li>Adicione 1,5 x volume, de etanol 100% ao sobrenadante e misture.</li>
		<li>Transferência de 700 µ l desta mistura para a coluna de extração de miRNA e centrifugue-lo a toda a velocidade para 15 s no RT e descarte o escoamento; Repita este passo com qualquer amostra restante.</li>
		<li>Adicione 700 µ l de tampão 1 à coluna e centrifugue-lo a toda a velocidade para 15 s no RT; Descarte o escoamento.</li>
		<li>Adicionar 500 µ l de tampão de 2 à coluna e centrifuga-lo a toda a velocidade para 15 s no RT; Descarte o escoamento.</li>
		<li>Adicionar 500 µ l de etanol a 80% para a coluna e centrifuga-lo a toda a velocidade por 2 min em RT; Descarte o escoamento.</li>
		<li>Transferir a coluna para um novo 2ml estreantes tubo, abra a tampa e centrifugá-lo a RT por 5 min na velocidade máxima; Descarte o escoamento.</li>
		<li>Adicione 16 µ l de água livre de RNAse para a coluna e centrífuga em cheio a velocidade para 1 min a RT. conservar o eluato no gelo ou armazenar a-80 ° C para análise futura. Nota: Dois microlitros de cada amostra podem ser usados para análise de OD.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transcrição reversa
	<ol>
<li>Prepara-se em gelo. Para cada reação de RT-PCR de 20 µ l, adicionar 4 µ l de buffer miRNA RT, 2 µ l de ácidos nucleicos, 9 µ l de RNA total, 2 µ l da enzima e 3 µ l de água livre de RNAse; misturar e girá-lo para baixo rapidamente.</li>
		<li>O termociclador definido da seguinte forma: 37 ° C por 60 min; 95 ° C por 5 min; Espera de 4 ° C.</li>
		<li>Retirar os tubos do termociclador e adicionar 200 µ l de água livre de RNAse. Armazenar a-20 ° C ou prosseguir para o PCR em tempo real.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
PCR em tempo real Nota: Este protocolo segue 96 formato de placa bem. Prepare a mistura de reação no gelo.<ol>
<li>Preparar a mistura de reação de PCR e adicionar cDNA (de miRNAs acima) de acordo com o intervalo aceitado pelo protocolo. Reações múltiplas podem ser preparadas em lote.</li>
		<li>Adicione um total de 25 µ l de mistura PCR + cDNA em cada poço.</li>
		<li>A placa usando um selo da placa óptica do selo.</li>
		<li>Centrifugue a placa por 1 min a 1.000 x g , à temperatura ambiente.</li>
		<li>Programa o reciclador em tempo real, como segue: Etapa de ativação inicial a 95 ° C por 15 min; Passo 3-ciclismo: desnaturação a 94 ° C por 15 s; Recozimento a 55 ° C por 30 s; extensão a 70 ° C por 30 s (Executar coleta de dados de fluorescência); adicionar 40 ciclos; Derretendo-curva de acordo com o padrão do reciclador.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Análise comparativa
	<ol>
<li>Exemplo de normalização (ver quadro 2):<ol>
<li>Encontre o valor mínimo de SCM.</li>
			<li>Normalize todos os valores SCM a este mínimo.</li>
			<li>Subtrai esse valor a partir dos valores de Ct de miRNAs de interesse (MOI) e gene de referência (REF).</li>
			<li>Analise os dados usando a fórmula de 2-ΔCt .</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Proteomic Analysis
<ol><li>
Extração de proteínas de frações polysome
	<ol>
<li>Combine fracções recolhidas sacarose em três frações finais. Marque as frações como pesado (polissomos de alta eficiência em fracções em pool, 4, 5, 6 e 7 com a maior concentração de sacarose, inferior do tubo gradiente), luz (polissomos baixa eficiência em fração em pool, 8, 9, 10 e 11; meio da tubo de gradiente) e não-traduzindo (frações em pool, 12, 13, 14 e 15 com a menor concentração de sacarose; parte superior do tubo gradiente). Realize o ensaio da proteína em fracções em pool.</li>
		<li>Prepare o estoque de 100% de ácido tricloroacético (TCA) e armazená-lo em 4 ° C, no escuro. Misturar 0,5 mL da amostra com 60 µ l de 100% TCA e incubar a-20 º C durante a noite, no escuro. Nota: Use tubos de retenção de baixa proteína de 1,5 mL (ver Tabela de materiais).</li>
		<li>Após a incubação durante a noite, descongele a amostra em gelo e centrifugação a 15.000 x g, 4 ° C por 30 min. Discard sobrenadante. Nota: 100 µ g de proteína total na amostra dá pelota de proteína visível na parte inferior do tubo.</li>
		<li>Pre-calma acetona no congelador-20 ° C. Adicione 0,5 mL de acetona gelada para a pelota de proteína e centrifugação a 15.000 x g, 4 ° C por 15 min. Discard sobrenadante. Repita duas vezes.</li>
		<li>Ar seco a pelota. Resuspenda o pellet em 360 µ l de tampão Tris-HCl de 50mm (pH 8). Nota: Se necessário, use um sonicador de pulso para Ressuspender o precipitado.</li>
		<li>Adicionar 40 µ l de ditiotreitol 0,1 M (concentração final 10 mM) e incubar a 55 ° C, agitador por 45 min. Adicionar 50 µ l de iodoacetamide de 0,15 M (concentração final 17 mM) e incubar a temperatura ambiente agitador por 30 min no escuro.</li>
		<li>Preparar a solução de tripsina: Resuspenda 20 µ g de tripsina em 100 µ l de bicarbonato de amónio de 50 mM. Adicionar o correspondente volume de solução de tripsina a amostra em 01:50 (w/w) proporção de tripsina: proteína, certifique-se de que o pH é 8 e incubar agitador a 37 ° C durante a noite. Nota: Adicione M 1 bicarbonato de amónio para trazer pH 8.</li>
		<li>Após a digestão do trypsin, legal a amostra, centrífuga brevemente em centrífuga de bancada, adicionar 10% de ácido fórmico a pH 2 – 3 saciar a atividade de tripsina e proceder com a amostra de dessalinização. Nota: Use chapa µ-eluição para dessalinização de amostra.</li>
		<li>Condição do adsorvente a nos poços da placa bem 96 com 200 µ l de metanol usando vácuo três vezes seguido pelo condicionamento de 200 µ l de solução de ácido fórmico 0,1% três vezes. Amostra de carregar e executar uma lavagem de amostra usando a 200 µ l de solução de ácido fórmico 0,1% três vezes. Eluir a amostra com 100 µ l de solução de ácido fórmico 50% acetonitrile/0.1% duas vezes num tubo de 0,5 mL de retenção de baixa proteína. Nota: Eluir a amostra lentamente no começo usar gravitação seguido por baixo vácuo.</li>
		<li>Evaporar o eluído amostra à dessecação concentrador e também diretamente realizar análise de espectrometria de massa ou loja a-80 ° C até o uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Análise de espectrometria de massa
	<ol>
<li>Reconstituir cada pellet (consistindo dos peptides tryptic) em 50 a 100 µ l e injetar 1 µ l no espectrômetro de massa. Nota: Otimize a reconstituição e injeção de volumes para obter a máxima intensidade de sinal LC/MS/MS. No nosso caso, o sinal máximo (íon total atual; TIC) no coração da varredura foi no intervalo de 1E8 para 2E9.</li>
		<li>Usar uma armadilha coluna C18 (300 µm identificação x 5 mm, 5 µm, 100Å) seguido de separação de peptídeo usando coluna C18 (75 µm identificação x 250 mm, 2 µm, 100Å) com uma configuração de taxa de fluxo em 300 nL/min. Set a temperatura capilar nano-fonte a 275 ° C e a tensão do pulverizador de 2 kV.</li>
		<li>Aplica um gradiente linear de B 5 – 35% para 90 min, 35 – 95% B por 3 min, mantendo em 95% B por 7 min e equilibrio de 5% B para 25 min (r: 0,1% de ácido fórmico/água e b: 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila). Adquira MS2 espectros para os 15 íons de intensidade mais altos de cada verificação MS1 usando o modo de CID. Espectrometria de massa uso 3 repetições para cada amostra analisada. Nota: Otimizar e utilizar os parâmetros que são apropriados para suas amostras no instrumento particular espectrometria de massa e condições experimentais. Os condições/parâmetros mencionados na secção 5.2. foram utilizadas e otimizadas em nosso laboratório.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Identificação/quantificação da proteína
	<ol>
<li>Após análise de espectrometria de massa, converta os arquivos de espectros brutos em arquivos de mzXML compatível, utilizando o software MSConvert (http://proteowizard.sourceforge.net/tools/msconvert.html).</li>
		<li>Enviar os arquivos convertidos num motor de busca SEQUEST com os critérios de pesquisa, por exemplo, UniProtKB/Swiss-Prot do mouse banco de dados (mais actualizado canônica revisado); síntese de enzima semi usando tripsina (após KR /-); com até 2 decotes não atendidas; intervalo de massa precursor: 400 a 4.500 amu; modificação de estática: carbamidomethyl (C) 57,021465 amu; tolerância em massa do peptide: 50 ppm; fragmento de massa tipo: monoisotópico. Nota: Outras proteínas de banco de dados pesquisa motores dados condutas e podem ser usadas. Se usando o banco de dados , por exemplo, o rato, que é menos completos do que os bancos de dados para mouse e humanos, pode ser necessário pesquisar contra mouse (e/ou humanos) bancos de dados para aumentar a cobertura do proteoma. Neste caso, a redundância em nomes de proteína precisará ser removido.</li>
		<li>Realizar uma análise post-pesquisa. Ajuste os filtros para visualizar os dados. Por exemplo, defina uma probabilidade mínima de proteína (limiar de proteína) como 95% ou 99%, ou seja, serão exibidas somente as proteínas para que uma análise estatística implica em 95% ou 99% de probabilidade de estar presente na amostra. Definir o filtro para o limiar do peptide (por exemplo, 95%), ou seja, uma probabilidade mínima que será usada para determinar se um espectro identifica um peptídeo. Selecione o número mínimo de peptídeos que vai determinar se uma proteína está presente (recomenda-se 2 peptídeos como um mínimo para identificação de proteínas).</li>
		<li>Avalie as proteínas identificadas para a qualidade/quantidade. Certifique-se de que proteotypic peptídeos são utilizados para a quantificação. Se isoform é identificado garantir é bases na observação de um peptídeo tryptic composto por uma sequência de aminoácidos, exclusiva para a isoforma específica. Qualquer "similares" ou hipotéticas proteínas devem ser submetidos a comparação para ver se o observado peptídeos correspondem a uma proteína conhecida.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Análise do perfil de polysome permite o estudo da tradução de proteínas, analisando o estado translacional de um mRNA específico ou o transcriptoma toda6,7. Também é de grande ajuda quando a tradução local precisa ser estudado como sinaptossomas8. Tradicionalmente, este método envolve a separação de mono e poliribosomami e os mRNAs associados em um gradiente de sacarose, que pode ser acoplado a genômica ou técnicas de proteômica para obter...

O coração responde para a lesão de reperfusão (R) de forma dinâmica e de isquemia (I). No entanto, há um pequeno insight agudas alterações na síntese de proteínas durante a resposta. Para resolver isso, aproveitamos o método bem estabelecido de polysome1 para identificar alterações na abundância de proteína que refletem a redistribuição dos ribossomas e translacionais fatores regulatórios do citosol para polissomos, de criação de perfil e o aumento de proteínas recém sintetizadas (PTS). Na configuração de I / R, o aumento da síntese de novas proteínas ocorre em um período de tempo que é inconsistente com a transcrição de mRNAs de novo2; Além disso, a discordância entre os níveis de expressão de mRNA e abundância de proteína tem sido relatados3. Por estas razões, nós escolhemos analisar as mudanças na proteome dinâmico como refletido pela tradução da proteína. Para fazer isso, podemos quantificar o mRNA nas fracções polysome e analisar a composição de proteína nas fracções polysome. Finalmente, porque microRNAs (miRs) regular a disponibilidade dos mRNAs para tradução e pode interferir com a eficácia da proteína tradução4,5, examinamos a distribuição de miRs nas fracções polysome, enfocando a resposta a I / r.
Optamos por usar o modelo de perfusão de Langendorff de rato isolado e tecidos colhidos em condições basais de perfusão contínua, após 30 min isquemia global de não-fluxo e após 30 min de isquemia seguida por 30 min de reperfusão. Em seguida, solubilizado no tecido do coração e separados polissomos ao longo de um gradiente de sacarose, seguido de análise proteômica e detecção seletiva de mRNAs e miRNAs por PCR e microarray, respectivamente. Esta combinação de métodos representa uma poderosa abordagem para a compreensão do proteome dinâmico, permitindo a detecção simultânea de mRNA, miRNA e pts, bem como a redistribuição de proteínas reguladoras, miRNA e mRNA entre frações nontranslating, polissomos de baixa eficiência e alta eficiência polissomos (ver Figura 1). Insights sobre o Regulamento dinâmico deste processo serão estendidas por uma análise mais aprofundada da fosforilação de fatores-chave reguladoras como eIF2α ou mTOR. Agora, estas etapas individuais são descritas em detalhes.

<table><tbody><tr><td>Pentobarbital</td><td>Vortech Phamaceuticals</td><td>9373</td><td>para eutanásia</td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sagent</td><td>103424</td><td>usado em pinças de preparação langendorff</td></tr><tr><td></td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>91110-10</td><td>usadas para pendurar o coração</td></tr><tr><td>Sistema Langendorff</td><td>Radnoti + caseiro</td><td>n / a</td><td>Um sistema de 'quatro corações' composto por vidro soprado personalizado, tubos e banhos-maria</td></tr><tr><td>Tampão de NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653-5KG</td><td>Krebs e gradiente de sacarose</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>Tampão de Krebs e tampão de lise</td></tr><tr><td>KH2PO42Sigma</td><td></td> <td>P-5504</td><td>Tampão Krebs</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M7774-500G</td><td>Tampão Krebs</td></tr><tr><td></td><td>Glicose Sigma</td><td>G5767</td><td>Buffer de Krebs</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016-500G</td><td>Krebs tampão</td></tr><tr><td>Sacarose em pó</td><td>Sigma</td><td>S0389-1KG</td><td>Gradiente de sacarose</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>208337</td><td>Gradiente de sacarose e tampão de lise</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma</td><td>T1503-1KG</td><td>Gradiente de sacarose e tampão de lise</td></tr><tr><td>Xileno Cyanole</td><td>Sigma</td><td>X-4126</td><td>Gradiente de sacarose</td></tr><tr><td>Cicloheximida</td><td>Sigma-aldrich</td><td>239763</td><td>Gradiente de sacarose e tampão de lise</td></tr><tr><td>RNaseOUT</td><td>Life Technologies</td><td>C00019</td><td>Inibidor de RNAse para tampão de lise</td></tr><tr><td>Igepal CA-360 (NP40)</td><td>Sigma</td><td>I3021</td><td>Tampão de lise Comprimidos</td></tr><tr><td>de coquetel de inibidor de protease, sem EDTA</td><td>Roche</td><td>5056489001</td><td></td></tr><tr><td>Tubo, Thinwall, Ultra-Clear, 13,2 mL, 14 mm x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman</td><td>LE-80K</td><td>Ultracentrifugação dos gradientes</td></tr><tr><td>Rotor</td><td>Beckman</td><td>SW41</td><td>Ultracentrifugação dos gradientes</td></tr><tr><td>Biologic LP (bomba)</td><td>Biorad</td><td>731-8300</td><td>Fracionamento dos gradientes</td></tr><tr><td>BioFrac</td><td>Biorad</td><td>741-0002</td><td>Fracionamento dos gradientes</td></tr><tr><td>Eppendorf RNA/DNA LoBind tubos de microcentrífuga, tubo de 2 mL</td><td>Sigma</td><td>Z666513-100EA</td><td>Fração de gradiente e extração de RNA</td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Life technologies</td><td>AM9738</td><td>Extração</td></tr><tr><td>de RNA Luciferase Controle RNA</td><td>Promega</td><td>L4561</td><td>Extração de RNA</td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Fisher Scientific</td><td>C606-4</td><td>RNA extração</td></tr><tr><td>Glicogênio, grau de RNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0551</td><td>Extração de RNA</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma</td><td>I9516</td><td>Extração de RNA</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma</td><td>E7023-1L</td><td>Extração</td></tr> de <tr><td>RNA iScript cDNA Synthesis Kit</td><td>BioRad</td><td>170-8891</td><td>Transcrição reversa</td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>BioRad</td><td>175-5122</td><td>Quantitative PCR</td></tr><tr><td>miRNeasy Micro Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>217084</td><td>Kit para isolamento total de RNA</td></tr><tr><td>miScript II RT Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>218161</td><td>Kit para miRNA de transcrição reversa</td></tr><tr><td>miScript Sybr Green PCR Kit (200)</td><td>Qiagen</td><td>218073</td><td>Kit para análise de expressão de PCR em tempo real de miRNAs</td></tr><tr><td>Centrifuge 5424R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Para centrifugação de tubos de 1,5 mL ou 2,0 mL em diferentes temperaturas. Velocidade máxima - 21130 x g</td></tr><tr><td>Centrífuga 5810R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Para centrifugação em tempo real de placas PCR em diferentes temperaturas. Velocidade máxima - 2039 x g</td></tr><tr><td>My Cycler Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Para transcrição reversa</td></tr><tr><td>CFX96 Real-Time System/C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Para análise de PCR em tempo real</td></tr><tr><td>miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control</td><td>Qiagen</td><td>219610</td><td>Para controle de qualidade do isolamento de RNA</td></tr><tr><td>Placas PCR de 96 poços de casca dura, perfil baixo, parede fina, rodapé, verde/transparente</td><td>Bio-Rad</td><td>HSP9641</td><td>Para análise de PCR em tempo real</td></tr><tr><td>Filme de vedação de placa de PCR Microseal 'B', adesivo, óptico</td><td>Bio-Rad</td><td>MSB1001</td><td>Para vedação de placa de PCR em tempo real</td></tr><tr><td>Pesquisa mais pipeta de canal único, cinza; 0,5-10 &micro; L</td><td>Eppendorf</td><td>UX-24505-02</td><td>Para pipetagem</td></tr><tr><td>PIPETMAN Classic Pipets, P20</td><td>Gilson</td><td>F123600G</td><td>Para pipetagem</td></tr><tr><td>PIPETMAN Classic Pipets, P200</td><td>Gilson</td><td>F144565</td><td>Para pipetagem</td></tr><tr><td>Rainin L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS Pipeta 100-1000 &micro; L</td><td>Gilson</td><td>17011782</td><td>Para pipetagem</td></tr><tr><td>Glicogênio, grau de RNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0551</td><td>Melhora a eficiência total do isolamento de RNA</td></tr><tr><td>Tubos Posi-Click de 1,7 mL, cor natural</td><td>Isolamento e armazenamento de RNA</td><td>Denville</td><td>C2170</td>; mistura de reagentes</tr><tr><td>Tubos de Ciclagem Térmica -0,2 mL Tampas Individuais, Tubos padrão de 0,2 mL com opticamente</td><td>Denville</td><td>C18098-4 (1000910)</td><td>Reação de transcrição reversa</td></tr><tr><td>Sharp 10 Precision barrier Dicas</td><td>Denville</td><td>P1096-FR</td><td>Para pipetagem</td></tr><tr><td>Sharp 20 Precision barrier Tips</td><td>Denville</td><td>P1121</td><td>Para pipetagem</td></tr><tr><td>Sharp 200 Precision barrier Tips</td><td>Denville</td><td>P1122</td><td>Para pipetagem</td></tr><tr><td>Tips LTS 1 mL Filter</td><td>Rainin</td><td>RT-L1000F</td><td>Para pipetagem</td></tr><tr><td>miScript Primer Assay ( 200)</td><td>Qiagen</td><td>(muda de acordo com o miRNA)</td><td>Para análise de PCR em tempo real</td></tr><tr><td>Gradient Master ver 5.3 Modelo 108</td><td>Instrumentos</td><td></td> BioComp <td>Para preparação de gradientes de sacarose</td></tr><tr><td>ácido tricloroacético</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6399</td><td></td></tr><tr><td>acetona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>650501</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de Tris</td><td>Amresco</td><td>M108</td><td></td></tr><tr><td>ditiotreitol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP172</td><td></td></tr><tr><td>iodoacetamida</td><td>Gbiosciences</td><td>RC-150</td><td></td></tr><tr><td>grau de sequenciamento tripsina modificada,</td> suíno <td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>bicarbonato de amônio</td><td>BDH</td><td>BDH9206</td><td></td></tr><tr><td>ácido fórmico, Optima LC / MS</td><td>Fisher Chemical</td><td>A117</td><td></td></tr><tr><td>metanol, Optima LC / MS</td><td>Fisher Chemical</td><td>A454</td><td></td></tr><tr><td>acetonitrila, Optima LC/MS</td><td>Fisher Chemical</td><td>A996</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind tubes 0.5 mL</td><td>Eppendorf AG</td><td>22431064</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind tubes 1.5 mL</td><td>Eppendorf AG</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>HLB &micro; Placa de eluição 30 &micro; m</td><td>Concentrador SpeedVac Oasis</td><td>186001828BA</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>Savant SPD2010</td><td></td></tr><tr><td>sonicador</td><td>Qsonica</td><td>Oasis180</td><td></td></tr><tr><td>centrífuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>Sorvall Legend micro 21R</td><td></td></tr><tr><td>LC coluna de armadilha PepMap 100 C18</td><td>Thermo Scientific</td><td>160454</td><td></td></tr><tr><td>LC coluna de separação PepMap RSLC C18</td><td>Espectrômetro de massa Thermo Scientific</td><td>164536</td><td></td></tr><tr><td>Espectrômetro</td><td></td>de massa <td>Thermo Scientific</td><td>Orbitrap Elite Ion trap</td></tr><tr><td>Software MSConvert</td><td>Software ProteoWizard Toolkit</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorcerer-SEQUEST Software</td><td>Sage-N Research, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dinâmica proteómica e mirna análise de polissomos de coração de rato isolado após langendorff perfusão

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Estudos em mudanças dinâmicas na tradução de proteínas requerem métodos especializados. Aqui, examinamos as alterações em proteínas recém sintetizadas em resposta à isquemia e reperfusão, usando o coração isolado de rato perfundido juntamente com polysome de criação de perfil. Para se perceber as mudanças dinâmicas na tradução de proteína, caracteriza-se os mRNAs que foram carregados com ribossomas citosólico (poliribosomami ou polissomos) e também recuperou polissomos mitocondriais e comparado a distribuição do mRNA e proteína na frações de alta eficiência (numerosos ribossomos mRNA), baixo-eficiência (menos ribossomos), que também incluiu polissomos mitocondriais e as frações não-traduzindo. os miRNAs pode também associar mRNAs que estão sendo traduzidos, reduzindo assim a eficiência da tradução, examinamos a distribuição dos miRNAs em frações. A distribuição de mRNAs miRNAs e proteínas foi examinada sob condições perfundidas basais, no final de 30 min de isquemia global de não-fluxo e após 30 min de reperfusão. Aqui apresentamos os métodos usados para realizar esta análise — em particular, a abordagem de otimização de extração da proteína do gradiente de sacarose, como este não tem sido descrita antes — e fornecer alguns resultados representativos.

análise do mRNA resultados de mRNA podem ser expressa como uma distribuição de um mRNA específico em cada fração (Figura 3A); para quantificação, combinar polyribosomal frações de traduzir e comparar com a fração não-traduzindo (Figura 3B), apresentando uma relação de abundância de mRNA em traduzir para frações nontranslating. Informações adicionais de são adquiridas, examinando as frações de polysome de alta eficiênc...

Aqui nós apresentamos um protocolo para realizar polysome de criação de perfil em coração isolado de rato perfundido. Nós descrevemos os métodos para análise das frações no que diz respeito a mRNAs, miRNAs e o proteome polysome polysome, polysome de criação de perfil e perfusão do coração.

Dinâmica proteómica e miRNA análise de polissomos de coração de rato isolado após Langendorff perfusão

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre a síntese dinâmica de proteínas e o proteoma envolvido no processo. Essa técnica permite a identificação dos mRNAs que estão sendo selecionados para tradução, os microRNAs que podem participar do processo e interferir na tradução e as proteínas que contribuem para a tradução de proteínas ou estão sendo traduzidas. Este método pode fornecer informações sobre as respostas cardíacas ao estresse, mas também pode ser aplicado ao estudo das respostas agudas ao estresse em outros órgãos.Demonstrando o procedimento estará Miroslava Stastna, cientista do projeto do laboratório de Jennifer Van Eyk. No dia do experimento, encha o compartimento esquerdo de um misturador de gradiente com cinco mililitros de solução de gradiente de sacarose a 15% e encha o compartimento direito com cinco mililitros de solução de gradiente de sacarose a 50%. Abra a torneira e ligue a bomba para agitar os dois pequenos compartimentos com um agitador magnético e use um tubo ligado à segunda torneira para permitir que as soluções misturadas de sacarose fluam para um único tubo de ultracentrífuga com paredes finas no gelo.Em seguida, homogeneizar o tecido cardíaco fresco ou congelado com um POLYTRON em tampão de lise filtrado por 15 segundos no gelo. No final da incubação, centrifugue o lisado para remover o material insolúvel e colha o sobrenadante. Separe 50 microlitros do sobrenadante para determinação de proteínas, isolamento de RNA e análise de integridade de RNA e coloque 100 a 500 microlitros do sobrenadante restante sobre a solução de gradiente.Use tampão de lise fresco para equilibrar os volumes entre os dois tubos de gradiente e ultracentrifugue as amostras em uma ultracentrífuga com um rotor de caçamba oscilante. Tenha muito cuidado para não perturbar o gradiente de sacarose antes ou depois da centrifugação. Para coletar os gradientes, programe o coletor de frações para descartar os três primeiros minutos de coleta e coletar as frações pesadas, leves e não translacionais à velocidade de um mililitro por minuto em 17 frações de quatro a 19 minutos com monitoramento contínuo da absorbância a 254 nanômetros.Coloque cada fração no gelo assim que for coletada. Em seguida, armazene as amostras a menos 80 graus Celsius, se não estiverem sendo processadas imediatamente. Para extrair proteínas das frações polissômicas, combine as frações de sacarose coletadas em três frações finais e marque as frações como pesadas, leves e não traduzidas.Misture 0,5 mililitros de cada amostra com 60 microlitros de ácido tricloroacético a 100% ou TCA. Incube as frações durante a noite a menos 20 graus Celsius no escuro. Na manhã seguinte, descongele as amostras no gelo antes de peletizar as proteínas por centrifugação.Descarte os sobrenadantes e lave os pellets duas vezes com 0,5 mililitros de acetona gelada de menos 20 graus Celsius por centrifugação. Certifique-se de que o pellet, após a precipitação do TCA, esteja completamente dissolvido, usando sonicação por pulso para garantir a solubilização completa, conforme necessário. Seque os pellets ao ar livre após a última lavagem antes da ressuspensão em 360 microlitros de tampão Tris-HCl.Em seguida, adicione 40 microlitros de ditiotreitol para uma incubação de 45 minutos a 55 graus Celsius com agitação. No final da incubação, adicione 50 microlitros de iodoacetamida às amostras para uma incubação de 30 minutos no agitador à temperatura ambiente, protegida da luz, seguida de digestão das amostras com uma proporção de tripsina para proteína de um para 50 pesos para uma incubação noturna a 37 graus Celsius. Na manhã seguinte, após o resfriamento, centrifugue brevemente as amostras e ajuste o pH para dois a três com ácido fórmico a 10% para extinguir a atividade da tripsina.Para dessalinizar as amostras, primeiro condicione o sorvente nos poços de uma placa de 96 poços com 200 microlitros de metanol três vezes, seguido de condicionamento com 200 microlitros de ácido fórmico a 0,1% por poço três vezes. Em seguida, carregue as amostras em cada poço e lave as amostras três vezes com 200 microlitros de ácido fórmico a 0,1% por lavagem. Usando gravitação, seguida de baixo vácuo, eluir as amostras com 100 microlitros de ácido fórmico a 0,1% em acetonitrila a 50% duas vezes em um tubo de 0,5 mililitro de baixa retenção de proteína por amostra.Em seguida, use um concentrador para evaporar os eluatos da amostra até a secura e reconstituir cada pellet de peptídeo tríptico em 50 a 100 microlitros de ácido 0,1% fórmico para análise de espectrometria de massa. A análise de mRNA pode ser realizada para avaliar a distribuição de um mRNA específico de interesse em cada fração ou para quantificação e comparação das frações de tradução polirribossômica combinadas com a fração não traduzida como uma proporção da abundância de mRNA em cada fração. Por exemplo, aqui, são mostradas as mudanças na distribuição do mRNA nas frações de tradução e não tradução após a sujeição do coração de camundongo à isquemia ou reperfusão de isquemia, em comparação com o tratamento cardíaco simulado.Neste experimento representativo, a análise de um subconjunto de microRNAs nas frações pesadas agrupadas revelou que 22 microRNAs foram associados a polissomas durante a isquemia, nove foram associados durante isquemia e reperfusão e sete foram comuns a ambas as condições, demonstrando que a associação de microRNAs é dinâmica em resposta aos estresses de isquemia e reperfusão. Além disso, a maioria das proteínas ribossômicas mitocondriais foi identificada na fração leve, e a maioria das proteínas ribossômicas citosólicas foi identificada comumente nas frações pesada e leve. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de ter muito cuidado com o gradiente de sacarose.A precipitação de TCA para extração de proteínas de frações polissômicas foi selecionada em nosso fluxo de trabalho com base na capacidade de processar a fração com alta concentração de sacarose e no número de proteínas identificadas por espectrometria de massas. Geralmente, indivíduos novos neste método podem ter dificuldades devido aos desafios associados à reprodutibilidade do gradiente de sacarose. A precipitação de TCA é vantajosa, pois apenas pequenos volumes são necessários para precipitar as proteínas, o pellet é visível no fundo do tubo e não há acúmulo de sacarose durante a precipitação.

dynamic-proteomic-mirna-analysis-polysomes-from-isolated-mouse-heart

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Langendorff modo de perfusão do coração isolado, em conjunto...

Avaliação da função cardíaca e Energetics em Corações Isolados rato Usando 31 P NMR Spectroscopy

Perfil de expressão única célula permite a análise detalhada de expressão gênica de células individuais. Descrevemos métodos para o isolamento dos cardiomiócitos, e preparar a lisados ​​resultando tanto para microarray transcriptoma todo ou qPCR de metas específicas.

Profiling única célula transcricional dos cardiomiócitos de rato adulto

Avanços na espectrometria de massa permitiu a análise de alto rendimento de expressão da proteína e da modificação de uma série de tecidos. Combinada com fraccionamento subcelular e modelos de doença, a massa espectrometria quantitativa e bioinformática pode revelar novas propriedades nos sistemas biológicos. O método aqui descrito analisa cromatina proteínas associadas na definição de doença cardíaca e é prontamente aplicável a...

Análise quantitativa de proteomas cromatina na Doença

Cardiomiócitos individuais de camundongos selvagens e mutantes podem ser isolados do coração para estudar sua contratilidade e transientes de cálcio. Isso permite caracterizar a contribuição da disfunção celular para a disfunção cardíaca por qualquer causa.

Isolamento e Fisiológica Análise de rato Cardiomyocytes

A análise da expressão de proteínas em válvulas embrionárias jovens de camundongos foi dificultada pelo tecido limitado disponível. Este manuscrito fornece um protocolo para preparar proteínas a partir de regiões de válvulas embrionárias de camundongos em desenvolvimento para análise de western blot.

Isolamento de proteínas a partir da Embryonic Rato Coração Região Válvula Desenvolvimento

micro-RNAs (miRNAs) são sequências de RNA curtas e altamente homólogas, servindo como reguladores pós-transcricional de RNAs mensageiro (mRNAs). Métodos de deteção de miRNA atuais variam em sensibilidade e especificidade. Descreveremos um protocolo que combina a hibridação in situ e imunocoloração para a deteção simultânea de moléculas miRNA e proteína em cortes de tecido de coração de rato.

Tecido-específica miRNA Expression Profiling Mouse coração seções usando em hibridação in Situ

Um método é descrito para o isolamento simultâneo de miócitos e não miócitos tanto da atria quanto dos ventrículos de um único coração de rato adulto. Este protocolo resulta em rendimentos consistentes de miócitos cardíacos altamente viáveis e não miócitos e detalha condições ideais de cultura específica celular para fenotipagem e análise in vitro.

Isolamento simultâneo e cultura de miócitos atrial, miócitos ventriculares e não-miócitos de um coração de rato adulto

Desenvolvemos um método simple para isolar células cardíacas individuais de camundongos de alta qualidade pela técnica de perfusão antegrada. Este método é livre de Langendorff e útil para isolar miócitos ventriculares e atrial ou células intersticiais, como fibroblastos cardíacos ou progenitores.

Um método de perfusão antegrada para isolamento cardiomiocócito de camundongos

O desenvolvimento do cérebro mamífero requer o controle adequado da expressão genética no nível da tradução. Aqui, descrevemos um sistema de perfil polisso com uma plataforma de gradiente e fracionamento de sacarose fácil de montar para avaliar o status translacional de mRNAs no cérebro em desenvolvimento.

Análise da tradução no cérebro do rato em desenvolvimento usando perfil polino

Aqui, descrevemos um protocolo para isolar uma quantidade suficiente de cardiomiócitos únicos não cardiomiócitos com alta viabilidade de um coração de camundongo pós-infarto do miocárdio (IM). Isso pode ser usado para sequenciamento subsequente de célula única, análise de citometria de fluxo e cultura de células primárias.

Preparação de uma Suspensão de Células Não-Cardiomiócitos para Sequenciamento de RNA de Célula Única de um Coração de Camundongo Adulto Pós-Infarto do Miocárdio

Aprenda a realizar perfilamento de polissomos em corações de camundongo isolados para estudar síntese proteica dinâmica. Este método permite analisar mRNAs, miRNAs e o proteoma de polissomos envolvidos na tradução proteica.

Dinâmica proteómica e miRNA análise de polissomos de coração de rato isolado após Langendorff perfusão

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