Name: Expressão de proteínas da fusão fluorescente em murino derivadas da medula óssea as células dendríticas e macrófagos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Aprenda a expressar proteínas de fusão fluorescente em células dendríticas e macrófagos derivados de medula óssea murina usando transdução retroviral. Este método simples e eficiente permite visualizar a localização subcelular de proteínas em células imunes.

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Este trabalho foi financiado pela Checa Science Foundation (GACR) (número do projeto 16-07425S), por Charles University Grant agência (SAUNG) (número do projeto 923116) e pelo financiamento institucional do Instituto de Genética Molecular, Academia de Ciências da República Checa República (RVO 68378050).

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comité de peritos sobre o bem-estar de animais experimentais do Instituto de Genética Molecular e pela Academia de Ciências da República Checa.
1. preparação do reagente
<ol><li>Prepare o tampão de amônio-cloreto-potássio (ACK). Adicionar 4,145 g de NH4Cl e 0,5 g de KHCO3 a 500 mL de DDQ2O, em seguida, adicionar 100 µ l de 0,5 M o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e filtro-esterilizar.</li>
	<li>Prepare o polyethylenimine (PEI) solução. Adicionar 0,1 g de PEI a 90 mL de DDQ2O. Agitação, adicione 1 M de HCl gota a gota até que o pH é inferior a 2.0. Mexa para até 3 h até PEI é dissolvido e depois ajustar o pH para 7.2 com 1 M de NaOH. Ajustar o volume a 100 mL com DDQ2O e filtro-esterilizar. Alíquotas de 1 a 2 mL de produzir e armazenar a-20 ° C. Nota: Após o descongelamento, PEI pode ser armazenado a 4 ° C por até 2 semanas mas não deve ser congelado novamente.</li>
	<li>Prepare os sobrenadantes de cultura de células contendo M-CSF ou GM-CSF. Estes sobrenadantes podem ser feitas com antecedência e armazenados em-80 ° C. Para tornar estes sobrenadantes, crescem as células produtoras de citocinas (células J558 para GM-CSF 18 ) ou CMG 14-12 M-CSF 19em uma placa de Petri em meio da águia modificados de Dulbecco (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS) de 10 cm a confluência. Então, transfira todas as células para 200 mL de mídia em T150 frasco de cultura de tecidos e cultura para dias adicionais de 4 a 5% de CO237 ° C. Recolha o sobrenadante e filtro sobre filtro de esterilização 0,2 µm. Fazer alíquotas e armazenar estas a-80 ° C.</li>
	<li>Preparar 100 mL de meio de cultura celular: DMEM suplementado com 10% inactivadas FBS de calor e sobrenadantes de células secretoras de GM-CSF (para diferenciação de BMDC) ou M-CSF (para diferenciação de BMDM). Nota: A quantidade de citocinas nestes sobrenadantes pode variar e a concentração de trabalho tem de ser determinado empiricamente. Normalmente, o sobrenadante de 2 – 3% de linhagens celulares, GM-CSF (a concentração inicial recomendada é de 2%) ou sobrenadante de 5 – 10% do CMG 14 – 12 células produtoras produzindo M-CSF (a concentração inicial recomendada é de 10%) é usado. Alternativamente, purificado comercialmente disponível M-CSF em 10 ng/mL e GM-CSF a 20 ng/mL podem ser usado com resultados praticamente idênticos à citocina contendo sobrenadantes, i. e., sem qualquer efeito sobre a taxa de diferenciação, eficiência de infecção e Localização subcellular das construções com tag EGFP. Antibióticos, incluindo penicilina G (100 UI/mL), estreptomicina (100 µ g/mL) e gentamicina (40 µ g/mL), podem ser usados para cultura de células em qualquer etapa do protocolo, a menos que indicado o contrário.</li>
</ol>2. produção de retrovírus
Atenção: Embora vetores retrovirais são relativamente seguros quando comparado a outros tipos de vetores virais, eles ainda apresentam um risco potencial de segurança. Portanto, é fundamental para trabalhar com o maior cuidado e equipamento de protecção e aderir a todos os regulamentos de segurança e os requisitos legais para trabalhar com partículas virais.
<ol><li>Uma suspensão de célula única de células de empacotamento Platinum-Eco (Plat-E) em uma placa de Petri de 10 cm da placa e cultivar em 15 mL de DMEM contendo 10% FBS até 50-60% de confluencia (24h). As células devem crescer em um monolayer e não devem formar grupos na cultura.</li>
	<li>Pipeta de 20 µ g de construção retroviral (EG., construção de expressar a proteína fluorescente etiquetada de interesse do vetor de pMSCV) e 10 µ g de pCL-Eco embalagem vector20 em 1 mL de DMEM (sem o soro e antibióticos) e misture suavemente.</li>
	<li>Para um segundo tubo, adicione 75 µ l de PEI em 1 mL de DMEM (sem o soro e antibióticos). Incubar a 5 min à temperatura ambiente (RT) e então misture o conteúdo de ambos os tubos e incube por adicional 10 min a RT Nota: A adição de pCL-Eco é opcional. Isso é que codifica para o receptor viral ecotropic e pode aumentar a concentração de vírus.</li>
	<li>Cuidadosamente, substituir o medium em células Plat-E com 8 mL de DMEMsupplemented fresco com 2% FBS. Pré-aquecer a médio e a 37 ° C antes do uso. Não utilize antibióticos durante a transfeccao, desde que os antibióticos podem reduzir a eficiência do transfection.</li>
	<li>Cuidadosamente adicione (em gotas) a mistura preparada no passo 2.3 nas células Plat-E e incube por 4 h a 37 ° C.</li>
	<li>Após a incubação, trocar o meio em células Plat-E para 10 mL de DMEM pré-aquecido contendo 10% FBS e cultivar as células por 24 h a 37 ° C. Durante esta incubação, as células Plat-E irão produzir vírus na mídia.</li>
	<li>Após 24h, recolher o meio contendo partículas retrovirais de platina Eco células usando uma pipeta de 5 mL e transferir para um tubo de centrífuga de 15 mL (= "sobrenadante 1", que contém partículas retroviral ecotropic).</li>
	<li>Para evitar contaminação por células Plat-E em sobrenadantes virais, girar o vírus coletado em 1250 × g por 5 min a 4 ° C. Para os melhores resultados, o vírus deve ser usado imediatamente para a infecção. Nota: Alíquotas de vírus também podem ser armazenadas a-80 ° C para uso posterior. No entanto, resultará em certa redução na eficiência de transdução. Evite congelamento/descongelamento repetitiva do vírus, uma vez que leva à degradação do vírus.</li>
	<li>Adicionar 10 mL de DMEM previamente aquecido com 10% FBS para Plat-E células e cultivar para outro 24h a 37 ° C.</li>
	<li>Repita os passos de 2.7. e 2.8. para obter "sobrenadante 2".</li>
</ol>3. isolamento de célula de medula murino
<ol><li>Sacrifica o mouse usando o deslocamento cervical ou outro método aprovado. Pulverize o mouse com etanol a 70%.</li>
	<li>Usando uma pinça e tesoura, retire a pele, bem como parte dos músculos da pernas traseiras. Cuidadosamente, desalojar o acetábulo da articulação do quadril sem quebrar o fêmur. Cortou a pata na articulação do tornozelo. Pulverize os ossos (fêmur conectado ao tibia) com 70% de etanol e remova o resto dos músculos usando uma toalha de papel.</li>
	<li>Coloque os ossos em um prato de Petri de 5 cm contendo solução salina estéril tamponada de fosfato (PBS) com 2% FBS (PBS-FBS).  Se preparando mais ossos, mantenha o prato de Petri no gelo até processada.</li>
	<li>Para garantir a esterilidade de cultivo, execute todas as etapas a seguir em uma capa de cultura de tecidos.</li>
	<li>Separe o fêmur a tíbia sem quebrar as extremidades ósseas (curva no joelho comum e cuidadosamente corte com tesoura).</li>
	<li>Processe os ossos um por um. Corte uma parte muito pequena das epífises (aproximadamente 1-2 mm) com uma tesoura, mantendo o osso em pinça.</li>
	<li>Use uma agulha de 30g e um 2 ou seringa de 5 mL de PBS-FBS para lavar as células da medula óssea de ambos os lados do osso em um tubo de centrífuga de 15 mL. Mova a agulha dentro do osso durante a descarga a fim de remover todas as células. Se a agulha fica entupida, mudá-lo. Nota: Ossos devem virar de vermelho para branco durante a lavagem. Isso indica que a maioria das células foram retirada do osso. Use aproximadamente 2-3 mL de PBS-FBS por osso.</li>
	<li>Centrifugar as células a 500 x g por 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Desprezar o sobrenadante e lisar os glóbulos vermelhos por resuspending a pelota em 2,5 mL de tampão ACK para 2-3 min à temperatura ambiente. Durante a Lise, filtre as células de medula óssea através de um filtro de célula de 100 μm em um tubo de centrifug de 15 mL. Restaure a tonicidade adicionando 12 mL de PBS-FBS. Nota: Não exceda a 5 min do lysis hipotônica com buffer ACK para evitar a morte celular.</li>
	<li>Centrifugar imediatamente a 500 x g por 5 min a 4 ° C.</li>
</ol>4. medula óssea diferenciação de células na medula óssea derivada de macrófagos
<ol><li>Resuspenda o pellet de células de medula óssea em DMEM suplementado com 10% FBS e antibióticos (consulte a observação após etapa 1.4. para a concentração de antibiótica) e contar as células. Para diferenciação em BM derivada de macrófagos, placa 5 – 10 x 106 de células da medula óssea em 10 cm não-cultura de tecido Tratado (bacteriana) placa de Petri com 10 mL de pré-preparados mídia DMEM com soro e M-CSF de passo 1.4. Nota: O rendimento das células da medula óssea é aproximadamente de 4 x 107 por semana de 6-8-rato velho C57BL/6J.</li>
	<li>Incubar as células na incubadora de cultura celular dias 3 a 5% CO2, 37 ° C. Nota: Durante os primeiros 2 dias, as células não olhe muito vital, como um grande número de pilhas apoptotic é presente (células incapazes de se diferenciar em células mieloides e células terminalmente diferenciadas).</li>
	<li>Depois de 3 dias, a cultura de células de medula óssea começa a olhar vital e formam-se aglomerados de dividir células. Primeiras células aderentes já podem ser observadas. Neste ponto, completar as células com mídia de citocina fresco.</li>
	<li>Adicionar 10 mL de mídia previamente aquecida de DMEM com soro e M-CSF (da etapa 1.4) em cada placa de Petri de 10 cm e devolvê-lo na incubadora de cultura celular. Não há nenhuma necessidade de remover a velha mídia durante esta etapa. Nota: os macrófagos da medula óssea são totalmente diferenciados após 5-7 dias em cultura. A melhor época para colheita é no dia 6-8, onde a maioria das células são aderentes e o prato de Petri é completamente coberto.</li>
	<li>No dia 5, leve o prato de Petri ao subúrbio de cultura celular e incline o prato, até que a mídia está quase alcançando a borda do prato. Retire cuidadosamente a 15 mL de mídia da superfície perto da borda, e as células tendem a ficar no meio do prato. Adicione o mesmo volume de mídia previamente aquecido com M-CSF e coloque o prato de volta para a incubadora. Nota: Se a mídia for aspirada lentamente e com cuidado, quase nenhuma célula é perdida. No entanto, também é possível centrifugar a mídia aspirada e adicionar as células de volta para a cultura, para não garantir que nenhum não-aderente (IE., incompleta diferenciada) células são perdidas.</li>
	<li>Para experiências, são usadas apenas pilhas aderentes (macrófagos). Para colher células, no dia 6 ou 7, remova todas as mídias e células flutuantes. Lave o prato uma vez com PBS pré-aquecido sem soro.</li>
	<li>Adicionar 5 mL de EDTA 0,02% em PBS e incubar durante 3-5 min a 37 ° C numa incubadora de cultura de tecidos.</li>
	<li>Utilizando uma pipeta de 5 mL, remova as pilhas do prato por um fluxo de PBS-EDTA e colocá-los em um tubo de centrífuga de 50 mL com 25 mL de PBS. Se necessário, juntar mais pratos.</li>
	<li>Centrifugar imediatamente a 500 x g por 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Ressuspender o macrófago na mídia DMEM e contar as células. Verifique se a expressão de marcadores de diferenciação de superfície do macrófago (CD11b e F4/80) por citometria de fluxo.</li>
	<li>Para experimentos que requerem as células em suspensão, por exemplo., fluxo cytometry experimentos, qPCR ou análise ocidental do borrão, usar os macrófagos diretamente. Para experimentos com macrófagos aderentes, as células da placa de cultura de tecidos de acordo com a instalação experimental da placa.</li>
	<li>As células estão já totalmente diferenciadas. Mantê-los nos meios de comunicação adequados para o experimento pretendido ou da mídia original do crescimento e diferenciação com M-CSF. Nota: Para trabalhar com macrófagos aderentes, transferi-los para uma nova chapa de pelo menos 6 horas antes do uso (idealmente durante a noite) para permitir a plena adesão à superfície nova. A pequena fração de células de flutuação pode ser removida antes do experimento.</li>
</ol>5. medula óssea diferenciação de células na medula óssea derivadas de células dendríticas
<ol><li>Siga o protocolo para BMDMs com ajustes específicos para BMDCs descritos abaixo em etapas 5.2 – 5.4.</li>
	<li>Resuspenda o pellet obtido de células de medula óssea no DMEMsupplemented com 10% FBS e antibióticos e contar as células (pelo seguinte passo 4.1 do protocolo de macrófagos). Para diferenciação em células dendríticas, placa 1 – 1,5 x 107 células de medula óssea em 10 cm não-cultura de tecido Tratado (bacteriana) placa de Petri em 10 mL de pré-preparados mídia DMEM com soro e GM-CSF (da etapa 1.4.).</li>
	<li>Siga as mesmas etapas de cultivo como no protocolo de BMDM (passos 4.3 – 4.5. protocolo de macrófagos). Use mídia DMEM com soro e GM-CSF em vez de M-CSF. Desde que para BMDCs o tempo de cultivo é mais longo (tipicamente 10-12 dias), adicione 1 – 2 alimentações adicionais em intervalos de 3 dias (remover o sobrenadante e adicionar uma nova mídia de cultivo, conforme descrito no passo 4.5.).</li>
	<li>Esta parte do protocolo é praticamente o mesmo que a parte correspondente do protocolo macrófago (passos 4.6 – 4.12. do protocolo de macrófagos). Para experiências use apenas pilhas aderentes. No dia 10-12, coletar as células usando EDTA, contar e placa-los sobre uma superfície nova. Verifique se a expressão de marcadores de superfície de diferenciação de células dendríticas (CD11c +, CD11b +, F4/80-) por citometria de fluxo.</li>
</ol>6. produção de BMDMs e BMDCs expressando EGFP-etiquetado proteína do interesse
<ol><li>Ressuspender o precipitado de células de medula óssea obtido na etapa 3.10. em DMEM suplementado com 10% FBS e antibióticos e contar as células. Para a infecção, usar 2 – 5 x 106 de células de BM por poço de cultura de tecido 6-bem tratada a placa.</li>
	<li>Placa, as células em 1 mL da mídia DMEM preparada por bem, complementadas com M-CSF para diferenciação em BMDMs ou com GM-CSF para diferenciação em BMDCs... manter as células para 4-6 h em uma incubadora de cultura de tecidos com 5% CO2 a 37 ° C.</li>
	<li>Adicione 2 mL de vírus recém coletado ("sobrenadante 1") suplementado com polybrene (12 µ g/mL, concentração final 8 µ g/mL após adição às células). Nota: Congelada alíquota do sobrenadante contendo vírus também pode ser usada, mas a eficácia será menor.</li>
	<li>Centrifugue a placa em 1.250 x g, durante 90 minutos a 30 ° C (com lenta aceleração e desaceleração). Em seguida, incubar durante 4 h com 5% CO2 a 37 ° C.</li>
	<li>Opcional: Substituir 2 mL dos meios de cultura com fresca média contendo respectiva citocina (M-CSF ou GM-CSF) e cultura com 5% CO2 a 37 ° C. No segundo dia, remover 2 mL de meio de cultura e repita o procedimento de toda infecção (etapa 6.3 – 6.4) com 2 mL de vírus recém coletados ("sobrenadante 2"). Nota: Este passo pode aumentar a eficácia de infecção. Melhoria após a segunda infecção é dependente da proteína de tipo e alvo de célula e em nossa experiência pode variar de aumento de 30% em eficiência para nenhuma melhoria em tudo.</li>
	<li>Recolher as células não-aderentes, transfira para um tubo de centrífuga de 15 mL e girar a 500 x g por 5 min (4 ° C). Desprezar o sobrenadante.</li>
	<li>Ressuspender as células em 10 mL de meio de cultura com M-CSF ou GM-CSF, colocar as células em um prato de Petri de 10 cm cultura de não-tecidos tratados e cultura a 37 ° C, 5% de CO2. Número ideal de células para um prato de 10 cm é de 5 – 10 x 106 para BM-derivada de macrófagos e 10 – 15 x 106 para BM-derivado de células dendríticas. Nota: Pratos ou placas menores podem ser usadas, mas números de telemóvel devem ser ajustados em conformidade.</li>
	<li>Siga o macrófago e protocolo de cultivo e diferenciação de células dendríticas descrito na etapa 4 e 5.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

A expressão da proteína de interesse em células-alvo é uma etapa chave em muitos tipos de estudos biológicos. Diferenciada de macrófagos e células dendríticas são difíceis de transfect por transfecção padrão e técnicas de transdução retroviral. Ignorando o transfeccao dessas células diferenciadas com retroviral transdução da medula óssea progenitores, seguido de diferenciação, quando eles já carregam a construção desejada, é um passo crítico, permitindo a expressão dos cDNAs ectópica nestes tipos de células. Um exemplo d...

Células mieloides representam uma parte indispensável dos nossos mecanismos de defesa contra patógenos. Eles são capazes de eliminar rapidamente os micróbios, bem como células morrendo. Além disso, também estão envolvidos na regulação da reparação e desenvolvimento do tecido e na manutenção da homeostase1,2,3. Todas as células mieloides diferenciarem dos progenitores mieloides comuns na medula óssea. Sua diferenciação em vários subconjuntos funcionalmente e morfologicamente distintos é em grande medida controlada por citocinas e suas várias combinações de4. Os subconjuntos de células mieloides mais intensivamente estudadas incluem neutrofílico granulócitos, macrófagos e células dendríticas. Defeitos em qualquer dessas populações levam a consequências potencialmente fatais e causa graves disfunções do sistema imunológico em humanos e ratos1,2,3,5, 6.
Ao contrário de neutrofílico granulócitos, macrófagos e células dendríticas são células residentes do tecido e sua abundância em órgãos imunes é relativamente baixa. Como resultado, o isolamento e purificação de primárias células dendríticas e macrófagos para experimentos que exigem um grande número dessas células é caro e muitas vezes impossível. Para resolver este problema, foram desenvolvidos protocolos para obter grandes quantidades de homogêneos macrófagos ou células dendríticas em vitro. Essas abordagens baseiam-se a diferenciação das células da medula murino na presença de citocinas: macrófago colônia-estimulando fator (M-CSF) por macrófagos e fator colônia-estimulando de granulócitos macrófagos (GM-CSF) ou Flt3 ligante para células dendríticas7,8,9,10,11,12. As células geradas por esse método são comumente descritas na literatura como medula óssea derivada de macrófagos (BMDMs) e medula óssea derivadas de células dendríticas (BMDCs). Eles têm propriedades fisiológicas mais em comum com o primários macrófagos ou células dendríticas do que com linhas de célula correspondente. Outra grande vantagem é a possibilidade de obter estes formam células geneticamente modificadas ratos13. Comparativo de estudos entre o selvagem-tipo pilhas e células derivadas de camundongos geneticamente modificados são muitas vezes críticas para descobrindo novas funções dos genes ou proteínas de interesse.
Análise de Localização subcellular das proteínas nas células vivas requer o acoplamento de uma etiqueta fluorescente à proteína do interesse na vivo. Isto é conseguido mais comumente expressando a construção de fusão geneticamente codificado, composta por uma proteína analisada acoplada (geralmente através de um curto vinculador) a uma proteína fluorescente (EG., verde proteína fluorescente (GFP))14,15 , 16. a expressão de proteínas fluorescente etiquetadas em células dendríticas ou macrófagos é um desafio. Estas células são geralmente difíceis de transfect por procedimentos de transfeccao padrão e as eficiências tendem a ser muito baixa. Além disso, o transfection é transitório, ele gera estresse celular e alcançou a intensidade de fluorescência pode não ser suficiente para microscopia17. A fim de obter uma fração razoável destas células, com um nível suficiente de expressão do transgene, a infecção de células progenitoras de medula óssea com retroviral vetores e sua posterior diferenciação em BMDMs ou BMDCs tornou-se um muito eficiente abordagem. Isso permitiu a análise das proteínas de origem mieloide em seu ambiente nativo de celular, em um estado estável ou durante os processos que são críticos para a resposta imune, tais como a fagocitose, formação de sinapse imunológica ou migração. Aqui, descrevemos um protocolo que permite a expressão estável de proteínas fluorescente etiquetadas um interesse de murino medula óssea derivada de macrófagos e células dendríticas.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA</td><td>15028</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA</td><td>10270</td><td>Para suplementação de mídia</td></tr><tr><td>KHCO3</td><td>Lachema, Brno, República Tcheca</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, EUA)</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina</td><td>BB Pharma AS, Praga, República Tcheca</td><td>N/A</td><td>PENICILINA G 1,0 DRASELN&Aacute; SOL' BIOTIKA</td></tr><tr><td>Estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, EUA)</td><td>S9137</td><td>Sal de sulfato de estreptomicina em pó</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Dr. Kulich Pharma, Hradec Kr&aacute; lov&eacute;, República Tcheca</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenonimina, linear, MW 25.000</td><td>Polyscience, Warrington, PA, EUA</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, EUA)</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, EUA)</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Preparado internamente pela instalação de mídia da IMG ASCR, Praga, República</td> <td>TchecaN/A</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-camundongo/humano CD11b Anticorpo, clone M1/70</td><td>BioLegend (San Diego, CA, EUA)</td><td>101212</td><td>análise de citometria de fluxo</td></tr><tr><td>PE anti-camundongo F4/80 Anticorpo, clone BM8</td><td>BioLegend (San Diego, CA, EUA)</td><td>123110</td><td>análise de citometria de fluxo</td></tr><tr><td>APC anti-camundongo CD11c Anticorpo, clone N418</td><td>BioLegend (San Diego, CA, EUA)</td><td>117310</td><td>análise de citometria de fluxo</td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>PeproTech (Rocky Hill, NJ, EUA)</td><td>315-02</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>PeproTech (Rocky Hill, NJ, EUA)</td><td>315-03</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA</td> Análise de citometria de fluxo <td>H1398</td><td>uso em 1-2 &micro; g/mL</td></tr></tbody></table>

expressão de proteínas da fusão fluorescente em murino derivadas da medula óssea as células dendríticas e macrófagos

Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

Macrófagos e células dendríticas são células cruciais que formam a primeira linha de defesa contra patógenos. Eles também desempenham papéis importantes no início de uma resposta imune adaptável. Trabalho experimental com estas células é bastante desafiador. Sua abundância em órgãos e tecidos é relativamente baixa. Como resultado, eles não podem ser isolados em grandes números. Eles também são difíceis de transfect com construções de cDNA. No modelo murino, estes problemas podem ser parcialmente superados por diferenciação em vitro de progenitores da medula óssea na presença de macrófagos de M-CSF ou GM-CSF para células dendríticas. Desta forma, é possível obter grandes quantidades dessas células de poucos animais. Além disso, os progenitores da medula óssea podem ser transfectadas com vetores retrovirais carregando do cDNA construções durante as fases iniciais de cultivo antes da sua diferenciação em células dendríticas derivada de medula óssea e macrófagos. Assim, a transdução retroviral seguida de diferenciação em vitro pode ser usada para expressar várias construções de cDNA nestas células. A habilidade de expressar proteínas ectópica substancialmente amplia a gama de experiências que podem ser executadas nessas células, incluindo a imagem de célula viva de proteínas fluorescentes, purificações em tandem para interactome análises, análises de estrutura-função, monitoramento de funções celulares com biosensores e muitos outros. Neste artigo, descrevemos um protocolo detalhado para retroviral transdução de murino medula óssea derivada de células dendríticas e macrófagos com vetores que codifica para proteínas fluorescente-etiquetadas. O exemplo de duas proteínas do adaptador, OPAL1 e PSTPIP2, vamos demonstrar sua aplicação prática em citometria de fluxo e microscopia. Também discutimos as vantagens e as limitações desta abordagem.

Sinalização de adaptador de proteínas é geralmente pequenas proteínas sem qualquer atividade enzimática. Eles possuem vários domínios de interação ou motivos, que mediam a ligação a outras proteínas envolveram na transdução de sinal, incluindo tirosina quinases, fosfatases, ubiquitina ligases e outros21. Para a demonstração da funcionalidade do presente protocolo, adaptadores de células mieloides, PSTPIP2 e OPAL1 foram selecionados. PSTPIP2 é uma bem caracterizadas...

Neste artigo, nós fornecemos que um protocolo detalhado para a expressão de proteínas da fusão fluorescente em murino medula óssea derivada de macrófagos e células dendríticas. O método é baseado na transdução da medula óssea progenitores com construções retrovirais seguidas por diferenciação em macrófagos e dendríticas células em vitro.

Expressão de proteínas da fusão fluorescente em murino derivadas da medula óssea as células dendríticas e macrófagos

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave nos campos da biologia celular macrófago e dendrítica sobre a localização subcelular e dinâmica de várias proteínas nesses tipos de células. As principais vantagens dessa técnica são que ela é relativamente simples, barata e demonstra uma melhor eficiência e estabilidade de expressão do que a maioria dos outros métodos disponíveis. Demonstrando o procedimento será Jarmila Kralova, uma estudante de pós-graduação do meu laboratório.Para produzir o retrovírus, emplaque uma suspensão unicelular de células de embalagem Eco-platina em uma placa de petri de 10 centímetros e cultivar as células em 15 mililitros de DMEM, suplementados com 10% de soro bovino fetal, ou FBS, até que a cultura seja de 50 a 60% confluente. No dia seguinte, adicione 20 microgramas da construção retroviral de interesse e 10 microgramas de vetor de embalagem ecológica PCL a 1 mililitro de DMEM sem soro, com mistura suave. Adicione 75 microliters de PEI em 1 mililitro de DMEM sem soro e antibióticos a um segundo tubo para uma incubação de cinco minutos à temperatura ambiente, e misture o conteúdo de ambos os tubos para uma incubação adicional de 10 minutos à temp

expression-fluorescent-fusion-proteins-murine-bone-marrow-derived

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo demonstra o processo de diferenciação mielóide células dendríticas da medula óssea de ratos. Isolamento de rato tíbia e fêmur, e processamento de medula óssea são demonstradas. Fotos demonstrando a morfologia das células antes e depois da diferenciação, e figuras representando fenótipo celular e IL-12 maturação de produção a seguir usando CpG são mostrados.

Cultura de células dendríticas mielóides a partir de precursores da medula óssea

Apresentação de antígenos em órgãos linfóides secundários pelas células dendríticas é crucial para o início da célula T mediada resposta imune adaptativa. Aqui demonstramos a cultura de medula óssea células dendríticas derivadas de camundongos, ativação e de rotulagem para os dois fótons de imagem.

Geração de Medula Óssea Derivado Células Dendríticas murino para uso em dois fótons de imagem

Dendríticas células antígenos captação e migrar para órgãos imunes a antígenos presentes processados ​​às células T. Qdot nanocristais rotulagem fornece um sinal duradouro e estável fluorescente. Este permite o rastreamento de células dendríticas a diferentes órgãos, por microscopia fluorescente.

Geração e Rotulagem de murino derivadas da medula óssea Células Dendríticas com Nanocristais Qdot de Estudos de rastreamento

Os macrófagos têm sido reconhecidos como um componente crítico das respostas imune inata e adaptativa. A recente explosão de conhecimentos relativos aos aspectos evolutivos, genéticos e bioquímicos da interação entre macrófagos e micróbios renovou atenção científica para macrófagos. Este artigo descreve um método para diferenciar macrófagos de medula óssea de ratinho.

Medula Óssea derivadas de macrófagos Produção

Combinatória 5 proteínas fluorescentes marcação de células-tronco e progenitoras hematopoiéticas permite in vivo de rastreamento via clonal confocal e microscopia de dois fótons, fornecendo insights sobre medula óssea hematopoiética arquitetura durante a regeneração. Este método permite o mapeamento destino não-invasivo de espectro codificados células hspCs derivados em tecidos intactos por longos períodos de tempo após o transplante.

In vivo Clonal Rastreamento de Stem hematopoiéticas e células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes usando confocal e microscopia multifotônica

Células da medula óssea cultivadas com fator estimulador de colônias de macrófagos granulócitos (GM-CSF) geram uma cultura heterogênea contendo macrófagos e células dendríticas (DCs). Este método destaca o uso da ligação de MHCII e hialuronano (HA) para diferenciar macrófagos das DCs na cultura GM-CSF. Os macrófagos nesta cultura têm muitas semelhanças com os macrófagos alveolares.

Geração e identificação de GM-CSF macrófagos derivados e dendríticas células alveolares do tipo de ratinho de Medula Óssea

Relata-se um protocolo de utilização de células activada por fluorescência para isolar células dendríticas plasmocitoides (PDC) com elevado grau de pureza a partir da medula óssea de ratinhos lúpus-propenso para estudos funcionais de PDC.

Classificação de células activadas por fluorescência Para a purificação de células dendríticas plasmocitï¿½des do rato de Medula Óssea

Este estudo demonstra o uso da citometria de fluxo para detectar a produção de (ROS) de espécies reativas de oxigênio resultantes da ativação do FcγR. Esse método pode ser usado para avaliar as mudanças no antimicrobial e redox função dos fagócitos em resposta aos complexos imunes, opsonized microorganismos ou direto FcγR cross-linking de sinalização.

Fluxo Cytometric medição da produção de ROS em macrófagos em resposta a FcγR cross-linking

Aqui, apresentamos um método econômico e eficiente para isolar e gerar células dendríticas derivadas da medula óssea de camundongos após 7 dias de cultura com 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

Protocolo Econômico e Eficiente para Isolar e Culturing Células Dendríticas Derivadas da Medula Óssea de camundongos

Este protocolo descreve o isolamento de timócitos duplo-negativos do timo de camundongo seguido de transdução retroviral e co-cultura no sistema de co-cultura de linhagem celular estromal de medula óssea delta-like 4 (OP9-DL4) para análise funcional adicional.

Co-cultura e transdução de timócitos murinos em células estromais delta-like 4 expressando para estudo de oncogenes em leucemia de células T

Este protocolo descreve um método não enzimático e direto para isolar células da medula óssea de camundongos neonatais de 7 a 9 dias de idade e gerar macrófagos diferenciados usando um sobrenadante de células L929 como fonte de fator estimulador de colônias de granulócitos (M-CSF). Os macrófagos derivados da medula óssea foram posteriormente analisados quanto aos antígenos de superfície F4/80, CD206, CD11b e competência funcional.

Isolamento da medula óssea de camundongos neonatais e preparação de macrófagos derivados da medula óssea

Aprenda a expressar proteínas de fusão fluorescente em células dendríticas e macrófagos derivados de medula óssea murina usando transdução retroviral. Este método simples e eficiente permite visualizar a localização subcelular de proteínas em células imunes.

Expressão de proteínas da fusão fluorescente em murino derivadas da medula óssea as células dendríticas e macrófagos

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