Name: Usando 22 3 anticorpo Anti-PD-L1 concentrar-se na biópsia e citologia amostras de pacientes de câncer de pulmão não-pequenas células (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Aprenda a usar o anticorpo 22C3 concentrado para avaliar a expressão de PD-L1 em amostras de biópsia e citologia de pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas. Este método melhora a seleção de pacientes para imunoterapia com alta concordância com o padrão ouro.

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Este estudo foi patrocinado pela Merck & Co., Inc., Kenilworth, NJ, USA. Os financiadores não desempenharam nenhum papel no projeto de estudo, coleta de dados e análise, a decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de ética local (Comitê de ética de pesquisa humana, Centre Hospitalier Universitaire de Nice/Tumorothèque BB-0033-00025).
Nota: Este protocolo é ajustado especificamente para o uso do anticorpo 22 3 concentrado em um stainer IHC automatizado disponível comercialmente (referido como autostainer aqui, consulte a Tabela de materiais) para amostras de citologia e biópsias de tumor.
1. preparação de amostras de tecido do Tumor
<ol><li>Fixar o tecido do tumor em neutro tamponado formol a 10% (NBF) em uma gaveta. Nota: Tecido de Tumor de tumores de pulmão proximal é geralmente obtido por broncoscopia, realizada sob sedação moderada por um pneumologista, ou especialista de pulmão. Para lesões periféricas e doença pulmonar difusa, é indicada uma biópsia transbrônquica ou agulha. Esses procedimentos são geralmente feitos em uma sala de cirurgia ou unidade de cuidados intensivos.</li>
	<li>Incorpore a gaveta em parafina. Nota: Fixação pode ser alcançada por perfusão ou imersão imediatamente após a dissecação e normalmente requer 8 – 10 h. O volume de fixador deve ser de 15 – 20 x maior do que o volume de amostra. Não é aconselhável fixar tecido de biópsia para mais de 10 h, porque overfixation podem causar mascaramento do antígeno. A velocidade de fixação é de cerca de 1 mm/h à temperatura ambiente.</li>
	<li>Infiltrar-se a amostra de tecido fixo com cera no processador de tecidos (ver Tabela de materiais). Nota: A desidratação é realizada em três banhos de álcool com o aumento da concentração de 70%, 85% e 90%. Água é finalmente removida por três banhos de álcool final do absoluto. A compensação é realizada em três banhos de tolueno e a infiltração de cera em banhos de cera quente (44-60 ° C).</li>
	<li>Incorporar o tecido no interior de um molde cheio de parafina derretida (ver Tabela de materiais) e aguarde a solidificação.</li>
	<li>Secção do tecido parafina em uma espessura de 3 μm em um micrótomo.</li>
	<li>Transferência da faixa de opções de parafina para um vidro de microscópio carregados positivamente deslize (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Secar o slide para 1 h a 37 ° C. Nota: Guarde as seções de tecido a 2 – 8 ° C (preferida) ou à temperatura ambiente até 25 ° C para preservar a antigenicidade e mancha dentro d 15 de seccionamento.</li>
</ol>2. preparação das amostras de citologia
<ol><li>
Coletar Lavagem brônquica em uma solução conservante (ver tabela de materiais). Nota: Para isso, técnica de broncoscopia padrão é usada.<ol>
<li>A distribuição do brônquio a amostrar de lavagem. Recolha a lavagem em um recipiente limpo. Rótulo do recipiente com o paciente do primeiro e último nome, data de nascimento e fonte do espécime.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transferir as águas de lavagem brônquicas para um tubo cónico de 50 mL e adicionar 2 g de DL-ditiotreitol pó (ver Tabela de materiais), vórtice do tubo por 30 min e então ele Centrifugue a 250 x g durante 5 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Remover o sobrenadante e adicionar 10 mL de uma solução mucolítico (ver Tabela de Material).</li>
	<li>Agitar a amostra por 20 min em velocidade média (nível 9) e centrifuga-lo a 250 x g durante 5 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Remover o sobrenadante e depositar o centrifugado em tubos de coleção contendo 10% NBF.</li>
	<li>Adicione 4 gotas de um eritrócito de preparação de bloco (ver Tabela de materiais) para o centrifugado.</li>
	<li>Transferir o centrifugado para uma gaveta, corrigi-lo em 10% NBF e parafina-incorporá-lo para a preparação de bloco celular e seccionamento (ver passos 1.1 – 1.7).</li>
</ol>3. ensaio de coloração PD-L1
<ol><li>Ligue a autostainer e o computador.</li>
	<li>Clique duas vezes no ícone autostainer e escolher o usuário.</li>
	<li>Clique em 'Criar rótulo' e no 'Protocolo'.</li>
	<li>Clique duas vezes no protocolo 22 3. Nota: O protocolo primeiro está instalado no computador a autostainer clicando em ' criar protocolo '. O protocolo completo é fornecido como arquivo suplementar 1.</li>
	<li>Escreva o ID do paciente no rótulo e clique em 'Imprimir'.</li>
	<li>Manter o rótulo do slide.</li>
	<li>Abra a gaveta slide pressionando no botão da gaveta que foi escolhido.</li>
	<li>Coloque o slide rotulado a almofada térmica com a etiqueta voltada para cima e para dentro.</li>
	<li>Feche a gaveta do slide.</li>
	<li>Remova as tampas dos dispensadores e carregar os reagentes nas prateleiras dos reagentes.</li>
	<li>Abra o capô do corante e coloque os racks no carrossel dos reagentes, certificando-se que eles se encaixam e segure na posição.</li>
	<li>Feche o capô.</li>
	<li>Sobre o software, clique no instrumento que será usado e clique em 'Executar'.</li>
	<li>No final do procedimento de IHC, enxágue o slide por alguns segundos com água da torneira e uma gota de uma solução de limpeza.</li>
	<li>Re-hidratar o slide com um banho de etanol 100% e um segundo banho de etanol a 95% por alguns segundos.</li>
	<li>Coloque o slide dentro da máquina de lamínula para um carregamento automatizado da lamela.</li>
</ol>4. interpretação da coloração PD-L1
Nota: Uma patologista qualificada deve realizar a interpretação do teste de IHC PD-L1.
<ol><li>Avalie a qualidade da manchar o PD-L1, analisando os controles positivos e negativos antes do exame da amostra do paciente. Nota: Os resultados obtidos na amostra do paciente são considerados inválidos se a coloração dos controles não é aceitável.</li>
	<li>Confirme a presença de um mínimo de 100 células de tumor viável sob um microscópio. Observação: Relatório quando a amostra do paciente tem menos de 100 células de tumor.</li>
	<li>Em uma baixa ampliação de 4x, avalie todas as áreas do tumor bem preservado de positivo e negativo. Nota: Em uma ampliação baixa, coloração parcial da membrana ou membrana coloração de intensidade fraca (1 +) pode ser difícil de reconhecer.</li>
	<li>Pontuação de coloração parcial ou total da membrana celular. Nota: A coloração citoplasmática tem de ser excluída da interpretação.</li>
	<li>Calcule o TPS, avaliando a proporção de células de tumor positivo PD-L1 em relação a todas as células do tumor presentes nas áreas tumor bem preservada. Nota: Somente as células do tumor viável devem ser examinadas. Todos os outros elementos celulares, como células do sistema imunológico, células necróticas, células normais e artefatos, tem que ser excluídos do exame.</li>
</ol>

<ol><li>Garon, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pembrolizumab+for+the+treatment+of+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pembrolizumab for the treatment of non-small-cell lung cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 372 (21), 2018-2028 (2015).</li>
<li>Herbst, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pembrolizumab+versus+docetaxel+for+previously+treated%2C+PD-L1-positive%2C+advanced+non-small-cell+lung+cancer+%28KEYNOTE-010%29%3A+a+randomised+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Pembrolizumab versus docetaxel for previously treated, PD-L1-positive, advanced non-small-cell lung cancer (KEYNOTE-010): a randomised controlled trial.</a> The Lancet. 387 (10027), 1540-1550 (2016).</li>
<li>Reck, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pembrolizumab+versus+Chemotherapy+for+PD-L1-Positive+Non-Small-Cell+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pembrolizumab versus Chemotherapy for PD-L1-Positive Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 375 (19), 1823-1833 (2016).</li>
<li>Langer, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carboplatin+and+pemetrexed+with+or+without+pembrolizumab+for+advanced%2C+non-squamous+non-small-cell+lung+cancer%3A+a+randomised%2C+phase+2+cohort+of+the+open-label+KEYNOTE-021+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Oncology%22%5BJournal%5D)">Carboplatin and pemetrexed with or without pembrolizumab for advanced, non-squamous non-small-cell lung cancer: a randomised, phase 2 cohort of the open-label KEYNOTE-021 study.</a> The Lancet Oncology. 17 (11), 1497-1508 (2016).</li>
<li>Buttner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+Death-Ligand+1+Immunohistochemistry+Testing%3A+A+Review+of+Analytical+Assays+and+Clinical+Implementation+in+Non-Small-Cell+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Programmed Death-Ligand 1 Immunohistochemistry Testing: A Review of Analytical Assays and Clinical Implementation in Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 35 (34), 3867-3876 (2017).</li>
<li>Folch, E., Costa, D. B., Wright, J., VanderLaan, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+cancer+diagnosis+and+staging+in+the+minimally+invasive+age+with+increasing+demands+for+tissue+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Lung+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Lung cancer diagnosis and staging in the minimally invasive age with increasing demands for tissue analysis.</a> Translational Lung Cancer Research. 4 (4), 392-403 (2015).</li>
<li>Padmanabhan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+Adequacy+of+Small+Biopsy+and+Fine-Needle+Aspiration+Specimens+for+Molecular+Testing+by+Next-Generation+Sequencing+in+Patients+With+Lung+Cancer%3A+A+Quality+Improvement+Study+at+Dartmouth-Hitchcock+Medical+Center%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+%26+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Improving Adequacy of Small Biopsy and Fine-Needle Aspiration Specimens for Molecular Testing by Next-Generation Sequencing in Patients With Lung Cancer: A Quality Improvement Study at Dartmouth-Hitchcock Medical Center.</a> Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 141 (3), 402-409 (2017).</li>
<li>Tsao, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTsao%2C+MS+%22IASLC+ATLAS+of+PD-L1+Immunohistochemistry+Testing+in+Lung+Cancer%22">IASLC ATLAS of PD-L1 Immunohistochemistry Testing in Lung Cancer</a>. , International Association for the Study of Lung Cancer (IASLC) Press. (2017).</li>
<li>Thunnissen, E., de Langen, A. J., Smit, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-L1+IHC+in+NSCLC+with+a+global+and+methodological+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">PD-L1 IHC in NSCLC with a global and methodological perspective.</a> Lung Cancer. , 102-105 (2017).</li>
<li>Ilie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+22C3+anti-PD-L1+antibody+to+determine+PD-L1+expression+in+multiple+automated+immunohistochemistry+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Use of the 22C3 anti-PD-L1 antibody to determine PD-L1 expression in multiple automated immunohistochemistry platforms.</a> PLoS One. 12 (8), e0183023(2017).</li>
<li>Ilie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+22C3+anti-programmed+death+ligand+1+antibody+to+determine+programmed+death+ligand+1+expression+in+cytology+samples+obtained+from+non-small+cell+lung+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cytopathology%22%5BJournal%5D)">Use of the 22C3 anti-programmed death ligand 1 antibody to determine programmed death ligand 1 expression in cytology samples obtained from non-small cell lung cancer patients.</a> Cancer Cytopathology. 126 (4), 264-274 (2018).</li>
<li>Skov, B. G., Skov, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired+Comparison+of+PD-L1+Expression+on+Cytologic+and+Histologic+Specimens+From+Malignancies+in+the+Lung+Assessed+With+PD-L1+IHC+28-8pharmDx+and+PD-L1+IHC+22C3pharmDx%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Immunohistochemistry+%26+Molecular+Morphology%22%5BJournal%5D)">Paired Comparison of PD-L1 Expression on Cytologic and Histologic Specimens From Malignancies in the Lung Assessed With PD-L1 IHC 28-8pharmDx and PD-L1 IHC 22C3pharmDx.</a> Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 25 (7), 453-459 (2017).</li>
<li>Russell-Goldman, E., Kravets, S., Dahlberg, S. E., Sholl, L. M., Vivero, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytologic-histologic+correlation+of+programmed+death-ligand+1+immunohistochemistry+in+lung+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cytopathology%22%5BJournal%5D)">Cytologic-histologic correlation of programmed death-ligand 1 immunohistochemistry in lung carcinomas.</a> Cancer Cytopathology. 126 (4), 253-263 (2018).</li>
<li>Heymann, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-L1+expression+in+non-small+cell+lung+carcinoma%3A+Comparison+among+cytology%2C+small+biopsy%2C+and+surgical+resection+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cytopathology%22%5BJournal%5D)">PD-L1 expression in non-small cell lung carcinoma: Comparison among cytology, small biopsy, and surgical resection specimens.</a> Cancer Cytopathology. 125 (12), 896-907 (2017).</li>
<li>Stoy, S. P., Rosen, L., Mueller, J., Murgu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+death-ligand+1+testing+of+lung+cancer+cytology+specimens+obtained+with+bronchoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cytopathology%22%5BJournal%5D)">Programmed death-ligand 1 testing of lung cancer cytology specimens obtained with bronchoscopy.</a> Cancer Cytopathology. 126 (2), 122-128 (2018).</li>
<li>Ilie, M., Hofman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducibility+of+PD-L1+assessment+in+non-small+cell+lung+cancer-know+your+limits+but+never+stop+trying+to+exceed+them%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Lung+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Reproducibility of PD-L1 assessment in non-small cell lung cancer-know your limits but never stop trying to exceed them.</a> Translational Lung Cancer Research. 6 (Suppl 1), S51-S54 (2017).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Podemos ter validado uma LDT otimizada usando o concentrado de anticorpo 22 3 PD-L1, comparando-a com o correspondente clinicamente validado teste comercial10,11. 3 a 22 concentrado LDT baseados em anticorpo que mostrou uma alta taxa de concordância entre a biópsia (~ 100%) e amostras de citologia (~ 95%) quando comparado com a expressão de IHC PD-L1 determinada usando o ensaio de IHC PD-L1 22 3 ≥ 1% TPS e o ≥ 50% TPS cortar pontos. Como recentemente recomendada ...

Ensaios clínicos recentes têm demonstrado a eficácia do pembrolizumab, um humanizado IgG4 kappa isotipo anticorpo monoclonal que bloqueia a interação entre a morte celular programada 1 (PD-1) e seus ligantes, PD-L1 e L2-PD, no tratamento de pacientes com avançado NSCLC1,2,3,4.
Atualmente, pembrolizumab é aprovado para tratamento de NSCLC PD-L1-expressando em ambos os pacientes tratamento-ingénuos com uma expressão de PD-L1 TPS de ≥ 50% e nenhum receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR) ou linfoma anaplásico quinase (ALK) tumor genômica de aberrações cromossómicas3 e para previamente tratados pacientes com um TPS-PD-L1 de ≥ 1%1.
Expressão de proteínas de PD-L1 detectado pelo IHC foi amplamente utilizado como um ensaio de biomarcador preditiva das terapias anti-PD-1/PD-L1. Em ensaios clínicos pembrolizumab, PD-L1 TPS obtidos com fixada em formol amostras de tecido (FFPE) parafina foi determinada utilizando o companheiro de IHC PD-L1 22 3 ensaio5. Este ensaio foi aprovado pelo Food and Drug Administration (FDA) e tem sido a marcação CE na Europa para a determinação do tumor PD-L1 TPS5.
Opções globais adicionais através de instituições para avaliações confiáveis e de alta qualidade da PD-L1 TPS com LDTs que usam o concentrado anticorpo 22 3 são essenciais para apoiar as decisões clínicas feitas a respeito da elegibilidade de pacientes para pembrolizumab tratamento. Um grande número de laboratórios de patologia não tem acesso para o ensaio de IHC PD-L1 22 3 diagnóstico complementar. Portanto, é essencial o desenvolvimento de confiáveis e consistentes LDTs compatíveis com plataformas de autostainer IHC adicionais, amplamente disponíveis.
Além disso, há uma necessidade de estabelecer LDTs usando amostras de citologia que são o único espécime tipo frequentemente disponível a partir de pacientes NSCLC. O ensaio de companheiro de IHC PD-L1 22 3 é validado para ressecções, biopsias de agulha e broncofibroscopias somente se a broncoscopia produz 100 células de tumor. Embora os tipos de amostra acima são frequentemente obtidos, amostras de citologia são mais facilmente coletadas e são o tipo de amostra mais comumente disponíveis em algumas instituições6,7. No entanto, não há atualmente nenhum ensaio validado de diagnóstico disponíveis para a avaliação da expressão PD-L1 em amostras de citologia; LDTs confiáveis compatíveis com amostras de citologia iria facilitar ainda mais o teste de PD-L1 de alta qualidade.
Além disso, ao estabelecer a validação clínica de uma LDT, o IHC deve ser realizada de forma semelhante ao correspondente clinicamente validado teste comercial8. Por exemplo, várias etapas críticas devem ser verificadas para obter o mesmo sinal em seções seriais como titulação de anticorpos, atrasos de pré-tratamento, tempo de incubação e de sistemas de amplificação9.
Recentemente desenvolvemos uma LDT otimizada que usa o concentrado de 22 3 anticorpo para avaliar a expressão de PD-L1 no tumor biópsias e citologia amostras10,11. Encontramos uma alta concordância com a LDT contra o "padrão ouro" PD-L1 IHC 22 3 ensaio10,11. Este protocolo clinicamente validado oferecerá suporte confiável e de alta qualidade PD-L1 testes globalmente em todas as regiões.

<table><tbody><tr><td>NovaPrep HQ1</td><td>Novacyt</td><td>NA</td><td>Solução conservante para espécimes de citologia</td></tr><tr><td>Novaprep&reg; HQ+ B</td><td>Novacyt</td><td>NA</td><td>Solução mucolítica</td></tr><tr><td>Tissue-Tek VIP 6</td><td>Sakura</td><td>6042 VIP 6</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek TEC 5 Sistema de console de incorporação de tecido</td><td>Sakura</td><td>5229 TEC 5</td><td></td></tr><tr><td>lâmina de vidro para microscópio SuperFrost Plus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4951PLUS4</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol em pó</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D3801</td><td></td></tr><tr><td>Heidolph Multi Reax Vortex Shaker</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-889-410</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Cytoblock</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7401150</td><td></td></tr><tr><td>22C3 anti-PD-L1 anticorpo concentrado</td><td>Agilent Dako</td><td>#M365329</td><td></td></tr><tr><td>PD-L1 IHC 22C3 pharmDx</td><td>Agilent Dako</td><td>SK006</td><td></td></tr><tr><td>Autostainer Link 48</td><td>Agilent Dako</td><td>AS480</td><td></td></tr><tr><td>BenchMark ULTRA autostainer</td><td>Ventana</td><td>#750-600</td><td></td></tr><tr><td>OptiView HQ Universal Linker</td><td>Ventana</td><td>#760-700</td><td></td></tr><tr><td>OptiView HRP</td><td>Multimer Ventana</td><td>#760-700</td><td></td></tr><tr><td>OptiView Amplificação H2O2</td><td>Ventana</td><td>#760-099</td><td></td></tr><tr><td>OptiView Amplificador</td><td>Ventana</td><td>#760-099</td><td></td></tr><tr><td>OptiView Amplificação Multômero</td><td>Ventana</td><td>#760-100</td><td></td></tr><tr><td>OptiView DAB</td><td>Ventana</td><td>#760-700</td><td></td></tr><tr><td>OptiView Cobre</td><td>Ventana</td><td>#760-700</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxilina II</td><td>Ventana</td><td>#790-2208</td><td></td></tr><tr><td>Reagente Azulado</td><td>Ventana</td><td>#760-2037</td><td></td></tr><tr><td>Condicionamento Celular 1 (CC1)</td><td>Ventana</td><td>#950-124</td><td></td></tr><tr><td>Capa de Filme Tissue-Tek</td><td>Sakura</td><td>4742</td><td></td></tr></tbody></table>

usando 22 3 anticorpo anti-pd-l1 concentrar-se na biópsia e citologia amostras de pacientes de câncer de pulmão não-pequenas células

Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients

Pembrolizumab em monoterapia foi aprovado para o tratamento de primeira e segunda linha de pacientes com PD-L1-expressando avançado câncer de pulmão não-pequenas células (NSCLC). Ensaios de expressão PD-L1 com o ensaio diagnóstico complementar de 22 3 PD-L1 imuno-histoquímica (IHC), o que dá uma proporção de tumor partitura (TPS), foi validada no tecido do tumor. Desenvolvemos um otimizado desenvolvido laboratório teste (LDT) que usa o concentrado de 22 3 anticorpo (Ab) em um autostainer IHC amplamente disponível para espécimes de biópsia e citologia. O TPS-PD-L1 foi avaliada com 120 seções emparelhados todo-tumor de tecido e amostras de biópsia e com 70 combinado amostras de biópsia e citologia (lavagens brônquicas, n = 40; derrame pleural, n = 30). O Ab 22 3 que baseado em concentrado LDT mostrou uma alta taxa de concordância entre a biópsia (~ 100%) e citologia espécimes (~ 95%) quando comparado com a expressão de IHC PD-L1 determinado usando o ensaio de 22 3 companheiro de IHC PD-L1 em ambos os TPS corta pontos (≥ 1%, ≥ 50%). A LDT otimizada apresentada aqui, usando o concentrado de Ab 22 3 para determinar a expressão de PD-L1 em ambos os tecidos de tumor e em amostras de citologia, vai expandir a capacidade dos laboratórios em todo o mundo para avaliar a elegibilidade de pacientes com NSCLC para tratamento com pembrolizumab em monoterapia de forma confiável e reprodutível.

Usando o procedimento apresentado aqui e conforme descrito em detalhes no recentes publicações10,11 deste grupo, LDT otimizado foi clinicamente validado com 120 amostras de biópsia FFPE NSCLC arquivamento de pacientes submetidos à cirurgia ressecção ou uma biópsia no Hospital Universitário Pasteur, Nice, entre março de 2007 e março de 2016. Além disso, para a avaliação da expressão de PD-L1 de amostras de citologia, TPS foi avalia...

Para expandir a capacidade dos laboratórios em todo o mundo para avaliar a elegibilidade de pacientes com câncer de pulmão para tratamento com pembrolizumab, de forma confiável e reproduzível, nós desenvolvemos um ensaio que usa o concentrado de 22 3 anticorpo em um amplamente disponível imuno-histoquímica autostainer, para amostras tanto biópsia e citologia.

Usando 22 3 anticorpo Anti-PD-L1 concentrar-se na biópsia e citologia amostras de pacientes de câncer de pulmão não-pequenas células

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer ...

Este método utilizando o concentrado de anticorpos 22C3 para determinar a expressão PD-L1 tanto no tecido tumoral quanto na citologia expandirá a capacidade dos laboratórios de avaliar a seleção de pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas para imunoterapia de forma confiável e reprodutível. A principal vantagem desta técnica é que ela é altamente concordante com o ensaio padrão-ouro e suportará testes PD-L1 confiáveis e de alta qualidade em todas as regiões do mundo. Em geral, os patologistas novos neste método lutarão por causa da coloração granular ocasionalmente observada.Além disso, a coloração das células humanas é um pouco mais intensa do que a observada com o padrão-ouro. Portanto, a formação de patologistas é necessária para obter a interpretação correta da coloração PD-L1 com o LDT 22C3. Demonstrando o procedimento será a Sra.Marame Hamila, um técnico do meu laboratório. Para começar, fixe o tecido tumoral em formalina tamponada 10% neutra em uma fita e incorpore a fita em parafina conforme descrito no protocolo de texto. Incorpore o tecido infiltrado dentro de um molde cheio de parafina derretida.Deixe o tecido ficar no molde até que a parafina se solidifique. Depois disso, use um microtome para secionar o tecido embutido na parafina em uma espessura de três micrômetros. Transfira a fita de parafina para um slide de microscópio de vidro carregado positivamente.Em seguida, seque o escorregador por uma hora a 37 graus Celsius. Primeiro, recolher as lavagens brônquias em uma solução conservante. Transfira as lavagens para um tubo cônico de 50 mililitros.Adicione dois gramas de DL-Dithiothreitol e vórtice do tubo por 30 minutos, depois centrífuga a 250 vezes g por cinco minutos em temperatura ambiente. Remova o supernatante e adicione 10 mililitros de uma solução mucóltica. Agite a amostra em velocidade média por 20 minutos e centrífugue a 250 vezes g por cinco minutos em temperatura ambiente.Depois disso, remova o supernatante e deposite a pelota da célula em um tubo de coleta contendo formalina 10% neutra. Adicione quatro gotas de um agente de preparação de blocos de células. Transfira a cápsula da célula para uma fita.Fixar a pelota celular para incorporação e secção de parafinas usando o processo descrito anteriormente para o preparo de amostras de tecido tumoral. Para começar, ligue o auto-tainer e o computador. Clique duas vezes no ícone de auto-tainer e escolha o usuário.Clique em Criar rótulo e, em seguida, em Protocolo. Clique duas vezes no protocolo 22C3. Preencha a ID do paciente e clique em Imprimir.Depois disso, coloque a etiqueta no slide. Pressione o botão na gaveta de slides escolhida para abri-lo e coloque o slide rotulado na almofada térmica com a etiqueta voltada para cima e para dentro. Feche a gaveta de slides.Em seguida, remova as tampas dos distribuidores. Carregue os reagentes no rack de reagentes. Abra o capô do manchador e coloque os racks de reagente no carrossel de reagentes, certificando-se de que eles se encaixam corretamente e mantenham a posição, em seguida, feche o capô.No software, clique no instrumento que será usado e clique em Executar. No final do procedimento IHC, use água da torneira com uma única gota de solução de limpeza para enxaguar o slide por vários segundos. Desidrate o slide, imergindo-o sequencialmente em dois banhos de etanol por vários segundos cada, em seguida, coloque o slide em uma máquina de cobertura para carregar automaticamente o deslizamento da tampa.Para começar a avaliar a qualidade da coloração PD-L1, analise os controles positivos e negativos antes de examinar a amostra do paciente. Usando um microscópio, confirme a presença de pelo menos 100 células tumorais viáveis. Com baixa ampliação de 4 vezes, avalie todas as áreas tumorais positivas e negativas bem preservadas.Depois disso, escore a coloração parcial ou completa da membrana celular e calcule o escore de proporção do tumor avaliando a proporção de células tumorais PD-L1 positivos em relação a todas as células tumorais presentes nas áreas tumorais bem preservadas. Neste estudo, o escore de proporção do tumor ou TPS é avaliado para amostras de biópsia de tecido pareado em blocos de células preparados a partir de lavagens brônquicas ou derrames pleurais. Padrões representativos de coloração com amostras de biópsia são usados para comparar o concentrado de anticorpos 22C3 com o ensaio companheiro PD-L1 IHC 22C3.O coeficiente de correlação intraclasse, utilizado para medir a correlação do escore TPS como variável contínua, é de 99% entre o LDT e o padrão-ouro. Padrões representativos de coloração com amostras de citologia também são usados para comparar o concentrado de anticorpos 22C3 com o ensaio companheiro PD-L1 IHC 22C3. A taxa de concordância das amostras de biópsia e citologia com o LDT é superior a 95% ao usar qualquer um dos pontos de corte do TPS.O coeficiente de correlação intraclasse, utilizando O TPS como variável contínua, está entre 0,88 e 0,90. Uma vez dominada, esta técnica dá uma alta taxa de concordância com o padrão-ouro na avaliação do corte para positividade ou histologia tumoral para espécimes de tecido e citologia. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que as amostras devem ser avaliadas com referência ao slide he e, em alguns casos difíceis, manchas complementares para avaliar células imunes podem ser realizadas para excluir a má interpretação da expressão PD-L1 apenas em células tumorais.Após este procedimento, outras amostras como biópsias de agulha fina, EUS-FNAs ou escovas brônquicas podem ser avaliadas. Após sua fixação nas clínicas, a robustez do ensaio precisa ser mantida ao longo do tempo, buscando credenciamento, seguindo procedimentos operacionais padrão e participando regularmente de esquemas externos de avaliação da qualidade. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como implementar o protocolo otimizado usando o anticorpo anti-PD-L1 22C3 concentrado em um autostainer IHC amplamente disponível, tanto amostras de biópsia quanto de citologia de pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas.

using-22c3-anti-pd-l1-antibody-concentrate-on-biopsy-cytology-samples

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Este vídeo descreve o ensaio de imunofluorescência de células tumorais circulantes (CTC), uma técnica para caracterizar os biomarcadores em células tumorais circulantes em amostras de pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas. Este ensaio pode ser usado para monitorar mudanças dinâmicas do tumor e resposta imune, que podem refletir a resposta à quimioterapia, radiação e possíveis tratamentos de imunoterapia.

Ensaio de imunofluorescência CTC: uma técnica para caracterizar células tumorais circulantes

Este protocolo descreve a preparação de amostras tumorais fixadas em formalina e embebidas em parafina que são usadas para preservar amostras de tecido e citologia de câncer de pulmão de células não pequenas...

Preparação de amostras de tumor embebidas em parafina fixadas em formalina: um protocolo para preservar amostras de tecido e citologia de câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC)

Um protocolo detalhado para um painel de seis-marcador multiplex imunofluorescência é otimizado e executado, usando um corante automatizado para resultados mais consistentes e um menor tempo de procedimento. Esta abordagem pode ser adaptada directamente por qualquer laboratório de estudos imuno-oncologia.

Painel de imunofluorescência Multiplex automatizada para estudos imuno-oncologia em amostras de Carcinoma fixada em formol

A caracterização de células tumorais circulantes (CTCs) é um tema popular na pesquisa translacional. Este protocolo descreve um ensaio semiautomático da imunofluorescência (se) para a caracterização do PD-L1 e a enumeração dos CTCs em amostras pacientes do cancro do pulmão da não-pequena pilha (NSCLC).

Caracterização e enumeração semiautomáticas de PD-L1 de células tumorais circulantes de pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas por imunofluorescência

Este protocolo experimental descreve e otimiza um método de coloração por imunoistoquímica multiplex (IHQ), principalmente otimizando as condições de incubação de anticorpos de canal único e ajustando as configurações de anticorpos e canais para resolver os problemas de autofluorescência e crosstalk de canais em tecidos de câncer de pulmão de origem clínica.

Coloração por imunohistoquímica multiplex para tecido de câncer de pulmão embebido em parafina

Este artigo tem como objetivo descrever uma abordagem gradual para a realização de broncoscopia assistida por robótica combinada com fluoroscopia, ultrassom endobrônquico radial e tomografia computadorizada de feixe cônico para obter criobiópsias pulmonares transbrônquicas direcionadas.

Broncoscopia assistida por robótica combinada com imagens multimodais para criobiópsias pulmonares direcionadas

Este manuscrito descreve os procedimentos operacionais e precauções para investigar os potenciais mecanismos patogênicos comuns que ligam a síndrome de Sjögren primária e o adenocarcinoma de pulmão por meio de análise de bioinformática e verificação experimental.

Síndrome de Sjögren Primária Associada ao Adenocarcinoma de Pulmão: Sondando os Potenciais Mecanismos Patogênicos Comuns e Verificação Experimental

Este manuscrito descreve um método para quantificar o acúmulo de células de tumor nos pulmões em um modelo animal de metástases de tumor.

Ensaio de recrutamento de células de Tumor de pulmão

Aqui, apresentamos o protocolo detalhado, adoptado no BioMILD triagem julgamento para executar o teste de classificador de assinatura microRNA circulantes para detecção precoce de câncer de pulmão.

MicroRNA baseado biópsia líquida: A experiência de miRNA o Plasma assinatura classificador (MSC) para triagem de câncer de pulmão

Um modelo animal é necessário decifrar o papel de células tumorais (CTC) em promover a colonização de pulmão durante a metástase do cancro em circulação. Aqui, nós estabelecemos e realizou com sucesso um na vivo do ensaio para teste especificamente a exigência de assembly de fibronectina poliméricos (polyFN) na CTC para a colonização de pulmão.

O estabelecimento de um ensaio de colonização de pulmão para visualização de células de Tumor nos tecidos do pulmão de circulação

Aprenda a usar o anticorpo 22C3 concentrado para avaliar a expressão de PD-L1 em amostras de biópsia e citologia de pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas. Este método melhora a seleção de pacientes para imunoterapia com alta concordância com o padrão ouro.

Usando 22 3 anticorpo Anti-PD-L1 concentrar-se na biópsia e citologia amostras de pacientes de câncer de pulmão não-pequenas células (Vídeo) | JoVE Journal

Usando 22 3 anticorpo Anti-PD-L1 concentrar-se na biópsia e citologia amostras de pacientes de câncer de pulmão não-pequenas células

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