Name: In Vitro Formação canina neutrófilos extracelular armadilha: Análise dinâmica e quantitativa por microscopia de fluorescência (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Aprenda a isolar neutrófilos caninos do sangue e visualizar a formação de NETs em células vivas usando microscopia de fluorescência. Este método permite quantificar citH3 e estudar funções imunes em cães.

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O autor correspondente foi financiado pela Morris Animal Foundation (D15CA-907). O estudo foi apoiado por fundos da Universidade da Califórnia, Davis, centro de saúde de equinos e centro de saúde de animais de companhia (2016-24-F). Os autores gostaria de reconhecer Geena Ng pela sua assistência com as figuras e Nghi Nguyen pela sua assistência com o vídeo.

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso da Universidade da Califórnia, Davis e institucional Cuidado Animal (número de protocolo: 18338).
1. coleta de sangue
<ol><li>Retire 10 mL de sangue ou a veia cefálica ou jugular, usando uma agulha 21G por aspiração de seringa.</li>
	<li>Para evitar excessiva tensão de cisalhamento, retire a agulha da seringa antes de transferir o sangue em tubos contendo heparina de sódio (USP 75). Inverta suavemente os tubos algumas vezes para garantir a mistura adequada de anticoagulante e sangue. Seleção de provas de coágulos ou agregados de células vermelhas, antes de colocar as amostras no gelo.</li>
</ol>2. neutrófilo isolamento
<ol><li>Dilua o sangue anticoagulado com um volume igual de fosfato salino do gelada Dubecco (DPBS) (pH 7,4, sem cátions divalentes). Transferência de 8 mL de sangue diluído em um tubo cónico polipropileno de 50 mL contendo 25 mL de dextrano de 3% (a partir de Leuconostoc spp. dissolvido em solução de cloreto de sódio 0,9%). Coloca o tubo na posição vertical em temperatura ambiente por 30 min permitir a agregação e sedimentação de eritrócitos.</li>
	<li>Cuidadosamente da camada em cima de 5 mL de mídia gradiente de densidade em um tubo de fundo redondo de polipropileno 14 mL 5 mL de plasma rico em leucócitos (Figura 1). Tenha cuidado para não misturar as 2 soluções11.</li>
	<li>Centrifuga os tubos a 400 x g com aceleração/desaceleração (A/D) definido como 0 (sem freio) por 30 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Usando um 5 mL pipeta sorológica recolher a camada de células de granulócitos por ignorar o plasma e camadas de células mononucleares (PBMC) de sangue periférico (Figura 1). Use uma outra pipeta cada vez para minimizar a contaminação.</li>
	<li>Lugar de 4 a 6 mL da camada de células polymorphnuclear (PMN) em um tubo cônico polipropileno de 50 mL. Desde que uma pequena quantidade de agregados de eritrócitos pode ser aspirada juntamente com a camada PMN, use uma pipeta sorológica 1ml para remover suavemente os agregados de eritrócitos que são liquidados na parte inferior do tubo.</li>
	<li>Lise as hemácias restantes com 20 mL de água ultrapura fria. Inverter suavemente o tubo várias vezes para 30 a 60 s para garantir a adequada lise antes de adicionar um volume igual de solução de cloreto de sódio 1,8% gelada.</li>
	<li>Centrifugar a 112 x g por 10 min a 4 ° C, A/D definido como 0.</li>
	<li>Repita a etapa de lise de eritrócitos se esta pelota aparece vermelha. Descartar o sobrenadante cuidadosamente com uma pipeta sorológica e suavemente resuspenda o pellet em 100 µ l de DPBS (dextrose 5 mM, 0.9 mM MgCl2, 1,9 mM CaCl2 e 1% albumina de soro bovino, pH 7,3). Combinar todas as células de ressuspensa e colocar no gelo.</li>
	<li>Realizar uma contagem de células usando um analisador de célula automatizada e verificar a contagem por um hemocytometer. Se necessário, concentrar PMN numa lâmina de vidro usando um cytocentrifuge (1.000 rpm, 5 min) e determinar a porcentagem de neutrófilos pela contagem do número de neutrófilos, o número total de células.</li>
	<li>Determinar a viabilidade dos neutrófilos através da realização de um teste de exclusão de trypan azul conforme descrito por Strober et al . 12 sucesso isolamento deve render uma viabilidade de 95 a 100% e neutrófilos devem ser superiores a 95%.</li>
	<li>Determine a concentração de neutrófilos multiplicando-se a contagem total de células com a viabilidade de porcentagem e neutrófilos por cento. Isolamento de sucesso deve produzir uma concentração de neutrófilos de 1,5 a 6 x 106/mL.</li>
	<li>Dilua os neutrófilos para uma concentração final de 1 x 106/mL com DPBS contendo dextrose 5 mM, 0.9 mM MgCl2, 1,9 mM CaCl2e 1% de albumina de soro bovino com pH ajustado para 7,3.</li>
</ol>3. fluorescente microscopia de neutrófilos ao vivo
<ol><li>Lugar de 200 a 400 μL de neutrófilos (1 x 106/mL) em cada poço de um poli-L-lisina revestido chapa 12-poços de cultura. Permitir que os neutrófilos aderir ao fundo dos poços, incubando-se as células a 37 ° C por 30 min.</li>
	<li>Rotular os ácidos nucleicos com 1 μM de um dos dois corantes ácidos nucleicos, que manchas nas células com membranas intactas e que as manchas nas células com membranas permeáveis (ver Tabela de materiais), durante 10 minutos à temperatura ambiente.</li>
	<li>Ativar os neutrófilos com 100 lipopolissacarídeo μg/mL (LPS) (e. coli O55. B5), 100 nM phorbol myristate 12 13-acetato (PMA) como controle positivo, ou quantidade equivalente de DPBS como controle negativo para 180 min a 37 ° C.</li>
	<li>Adquirir imagens usando o GFP (excitação: 470/22 nm, emissão: 525/50 nm) e vermelho Texas canais (excitação: 585/29 nm, emissão: 628/32 nm) na microscopia de fluorescência ampliação de 40 X nos seguintes pontos tempo: 30, 90, 120 e 180 min.</li>
</ol>4. líquido de quantificação e detecção de componentes de rede usando a imunofluorescência
<ol><li>Cuidadosamente coloque 18 mm diâmetro poli-D-lisina revestido lamínulas em poços de uma placa de cultura 12-poços. Rotule os poços adequadamente.</li>
	<li>Semente 100 a 200 μL de isolado de neutrófilos (1 x 106/mL) diretamente sobre as lamelas e permitir que os neutrófilos a aderir as lamínulas incubando-se as células a 37 ° C por 30 min.</li>
	<li>Ative os neutrófilos, conforme descrito no ponto 3.3. Inibir a formação de líquido por pretreating neutrófilos com 200 µΜ Cl-amidina (15 min, a 37 ° C) antes da ativação, conforme descrita por Li et al. 13 certifique-se de que o controle do veículo adequado (DMSO) é incluído no experimento.</li>
	<li>Remova cuidadosamente a lamínulas com pinça fina. Uma folha de película de parafina de camada mais um stand de tubo de ensaio para criar poços rasos e coloque 2 a 3 gotas de 4% PFA em cada bem10. Rotular os poços adequadamente e delicadamente Coloque as lamínulas de cabeça para baixo para os poços de PFA-cheia. Permitir que as células a fixar-se em temperatura ambiente por 20 min.</li>
	<li>Lave as células 3 vezes em DPBS por 5 min, movendo-as de um poço para a próxima.</li>
	<li>Se encontrava não pode ser executada logo após a fixação e a ativação de neutrófilos, permita lamínulas ser ar secado colocando as lamínulas viradas para cima em um pedaço de papel de absorvência. Lamínulas podem ser armazenadas por até 1 semana viradas para cima em uma placa de cultura de 12 poços rotulados a 4 ° C até posterior análise. Lave as células 3 vezes em DPBS por 1 min, usando a mesma técnica, conforme descrito em 4.4 antes de prosseguir para a próxima etapa.</li>
	<li>Para permeabilize células, delicadamente encostar o deslizamento da tampa de cabeça para baixo em uma queda de 1%, NP-40 para 1 min usando a técnica descrita em 4.4. Lavar 3 vezes em DPBS por 1 min em uma cadeira de balanço.</li>
	<li>Aleatoriamente, atribuir cada amostra para um número e use um marcador de ponto de diamante para rotular as lamelas em conformidade.</li>
	<li>Preparar e pratos de Petri individuais etiqueta forrado com película de parafina e coloque 100 a 200 μL de 5% de soro de cabra no filme (tampão de bloqueio). Coloque as lamelas de cabeça para baixo sobre o tampão de bloqueio. Coloque em uma cadeira de balanço e incubar durante 1 h a 37 ° C.</li>
	<li>Lavar 3 vezes em DPBS por 5 min em uma cadeira de balanço.</li>
	<li>Diluir o anticorpo primário (1: 400 histona de polyclonal anticitrulinado coelho H3 (citH3) em 5% de soro de cabra). Incube as células em pratos de Petri rotulado forrado com película de parafina. Coloque cada lamela de cabeça para baixo em 50 a 100 μL da solução diluída de anticorpo. Coloque em uma cadeira de balanço e incubar durante 1 h a 37° C.</li>
	<li>Lavar 3 vezes em DPBS por 5 min em uma cadeira de balanço.</li>
	<li>Diluído anticorpo secundário conjugado com um fluoróforo (1: 200), no soro de cabra de 5%. Incube as células em pratos de Petri rotulado forrado com película de parafina. Coloque cada lamela de cabeça para baixo em 50 a 100 μL da solução diluída de anticorpo. Coloque em uma cadeira de balanço e incubar 1 h a 37 ° C, no escuro.</li>
	<li>Lavar 3 vezes em DPBS por 5 min em uma cadeira de balanço no escuro.</li>
	<li>Para a deteção simultânea da mieloperoxidase (MPO), siga as etapas a seguir para um protocolo de immunolabeling duplo modificado conforme descrito por Li et al. 13
</li>
	<li>Incube as células em pratos de Petri rotulado forrado com película de parafina. Coloque cada lamela de cabeça para baixo em 100 a 200 μL de coelho 10% soro sob suave balançar (durante a noite, 4 ° C, no escuro).</li>
	<li>Lavar 3 vezes em DPBS por 5 min em uma cadeira de balanço no escuro.</li>
	<li>Incube a células em cabra de unconjugated 50 μg/mL anticoelho Fab fragmentos para 2 h à temperatura ambiente em um roqueiro no escuro.</li>
	<li>Lavar 3 vezes em DPBS por 5 min em uma cadeira de balanço no escuro.</li>
	<li>Dilua o anticorpo primário (1: 200 coelho anti-humano MPO anticorpo polyclonal) no soro de cabra de 5%. Incube as células em pratos de Petri rotulado forrado com película de parafina. Coloque cada lamela de cabeça para baixo em 50 a 100 μL da solução diluída de anticorpo. Coloque em uma cadeira de balanço e incubar 1 h a 37° C, no escuro.</li>
	<li>Diluir o anticorpo secundário conjugado com um fluoróforo em 5% de soro de cabra e incubar conforme descrito em 4,8</li>
	<li>Lavar 3 vezes em DPBS por 5 min em uma cadeira de balanço no escuro.</li>
	<li>Controles de interferência devem ser preparadas por excluindo incubação com ambos os anticorpos primários na segunda etapa imune-rotulagem.</li>
	<li>Mancha de DNA com 300 nM de 4', 6-Diamidion-2-Phenylindole, dicloridrato (DAPI) por 5 min no escuro à temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavar 3 vezes em DPBS por 1 min em uma cadeira de balanço no escuro.</li>
	<li>Aplique uma gota (~ 50 μl) de antidesgaste para montagem numa lâmina de vidro. Bata levemente a extremidade da lamela em um papel absorvente para remover o tampão em excesso antes de montar a lamela com as células de cabeça para baixo. O meio de montagem deve formar uma fina camada entre a lamínula e a lâmina de vidro. Para remover as bolhas de ar, pressione suavemente na lamela com pinça fina.</li>
	<li>Permitir que as amostras curar durante a noite, no escuro a 4 ° C. O meio de montagem deve endurecer por análise microscópica com lentes de imersão. Armazenar as amostras em 4 ° C, no escuro.</li>
</ol>5. neutrófilos extracelular armadilha quantificação
<ol><li>Cego aos operadores adquirir e analisar as imagens do microscópio para condições experimentais.</li>
	<li>Usando um microscópio de fluorescência na ampliação de X 40, com 10 imagens aleatoriamente de diferentes regiões de cada lamela em um experimento sob os respectivos canais. Certifique-se de que o tempo de exposição, brilho e contraste de cada canal são mantidos consistentes em toda a aquisição de imagens.</li>
	<li>Analise as imagens usando o software disponível como ImageJ (NIH). Identifica redes com base na localização co de cfDNA, citH3 e MPO (Figura 3A, B). Quantificar o número de redes e neutrófilos em 10 campos aleatórios para cada condição experimental. Números de redes lançado pode ser expressa como uma razão (número de redes: número total de neutrófilos) para cada condição experimental.</li>
	<li>Para avaliar os efeitos do tratamento na expressão intracelular citH3, contar o número de neutrófilos com citH3 intracelular e número de neutrófilos sem citH3 intracelular em 10 campos aleatórios na ampliação de X 40 sob os respectivos canais ( Figura 3, setas vermelhas). Expressão citH3 intracelular pode ser expressa como a relação entre número de neutrófilos com intracelular citH3 para o número de neutrófilos sem citH3 intracelular.</li>
</ol>

<ol><li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+and+immunity%3A+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).</li>
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<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+Blue+Exclusion+Test+of+Cell+Viability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111, (2015).</li>
<li>Li, R. H. L., Ng, G., Tablin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-induced+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+canine+neutrophils+is+dependent+on+histone+H3+citrullination+by+peptidylarginine+deiminase%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Immunology+and+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-induced neutrophil extracellular trap formation in canine neutrophils is dependent on histone H3 citrullination by peptidylarginine deiminase.</a> Veterinary Immunology and Immunopathology. 193, 29-37 (2017).</li>
<li>Masuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NETosis+markers%3A+Quest+for+specific%2C+objective%2C+and+quantitative+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers.</a> Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).</li>
<li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAD4+is+essential+for+antibacterial+innate+immunity+mediated+by+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).</li>
<li>Leshner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAD4+mediated+histone+hypercitrullination+induces+heterochromatin+decondensation+and+chromatin+unfolding+to+form+neutrophil+extracellular+trap-like+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">PAD4 mediated histone hypercitrullination induces heterochromatin decondensation and chromatin unfolding to form neutrophil extracellular trap-like structures.</a> Frontiers in Immunology. 3, 307(2012).</li>
<li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+and+inactivators+of+protein+arginine+deiminase+4%3A+functional+and+structural+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization.</a> Biochemistry. 45 (39), 11727-11736 (2006).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Apresentamos aqui um protocolo para observar as alterações no lançamento de conformação e cfDNA núcleos na vida canina neutrófilos usando um corante permeant célula e um corante impermeant célula. A principal vantagem deste teste é que ela permite detecção em tempo real de formação líquida por microscopia de alta resolução em neutrófilos ao vivo sem fixação da pilha, portanto, fornecendo uma ferramenta simples e valiosa para a observação em vitro NET formação. Desde que este ensaio não requer anticorpos para a d...

Os neutrófilos são granulócitos curta duração responsáveis para a defesa inicial contra invasão de agentes patogénicos. Neutrófilos, recrutados para o local da infecção, eliminam microorganismos pela fagocitose, degranulação e geração de oxigênio reativo espécies (ROS)1. Na presença de bactérias ou Endotoxinas, neutrófilos liberação dos neutrófilos extracelular armadilhas (redes), composto de cromatina extracelular decorado com histonas e granulares proteínas como elastase e mieloperoxidase (MPO)2. Embora os NETs têm propriedades antimicrobianas indispensáveis, aumentar as evidências experimentais e clínicas sugere que excesso de zelo formação líquida durante a sepse pode levar a vários órgãos disfunção e morte3,4, 5 , 6.
Porque redes podem desempenhar um papel fisiopatológico semelhante em cães, intervenções terapêuticas que impedem ou diminuem a formação de líquido podem servir como estratégias de tratamento romance em animais sépticos. Por esta razão, há uma necessidade de uma técnica confiável avaliar e quantificar os componentes líquidos em cães e NETosis. NET componentes incluindo DNA sem célula (cfDNA) e os nucleossomas anteriormente foram avaliadas em neutrófilos caninos e plasma de cães clínico7,8,9. Utilizando ensaios de fluorescência, Goggs e Letendre encontraram que cães sépticos têm níveis mais elevados de cfDNA que cães saudáveis8. Embora essas técnicas sejam altamente objetiva e quantitativa, medição de cfDNA e os nucleossomas como marcadores de NETosis é específico já que eles podem ser derivados de células necróticas diferente NETosing neutrófilos. Aqui nós descrevemos uma técnica que utiliza a microscopia de fluorescência para examinar os comportamentos dos neutrófilos de NETosing ao vivo. Também detalhamos um protocolo modificado usando duplo-immunolabeling para quantificar subjetivamente redes e seus componentes como MPO e citH3 em canino neutrófilos10.

<table><tbody><tr><td>Dextrano de Leuconostoc spp.</td><td>Sigma</td><td>31392</td><td>Peso molecular 450.000 - 650.000</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Life Sciences</td><td>17144002</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Phosphate-Buffered Salina</td><td>ThermoFisher A1285801 científica</td><td></td><td>com cátions divalentes</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Solução salina tamponada com fosfato</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190136</td><td>Sem cátions divalentes</td></tr><tr><td>E. coli O55:B5</td><td>InvivoGen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Laranja Fluorescente Nucleico Ácido Mancha</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11368</td><td>5 mM em DMSO; manchas em células com membranas permeáveis</td></tr><tr><td>SYTO Green 16 Fluorescente Nucleico Mancha</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S7578</td><td>1 mM em DMSO; colorações em células com membranas intactas</td></tr><tr><td>Surface-Amps NP-40</td><td>Pierce</td><td>28324</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas revestidas com poli-D-lisina</td><td>neuVitro</td><td>H-12-pdl</td><td>12 mm de diâmetro</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-histona citrulinada</td><td>H3 Abcam</td><td>Ab5103</td><td></td></tr><tr><td>Cabra não conjugada anti-coelho Fragmentos de Fab</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-007-003</td><td>Especificidade: IgG (H+L)</td></tr> <tr><td>Anticorpo anti-mieloperoxidase</td><td>Dako</td><td>A0398</td><td></td></tr><tr><td>4,6-Diamidino-2-fenilina (DAPI)</td> <td>Life Technologies Corporation</td><td>D1306</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro formação canina neutrófilos extracelular armadilha: análise dinâmica e quantitativa por microscopia de fluorescência

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

Em resposta à invasão de patógenos, os neutrófilos liberar neutrófilos armadilhas extracelulares (redes), que são redes extracelulares de DNA decorado com histonas e proteínas antimicrobianas. Formação excessiva de líquido (NETosis) e liberação de citH3 durante a sepse está associada a vários órgãos e mortalidade em ratos e seres humanos, mas suas implicações em cães são desconhecidas. Aqui, descrevemos uma técnica para isolar caninos neutrófilos do sangue inteiro para observação e quantificação de NETosis. Plasma rico em leucócitos, gerado pela sedimentação de dextrano, é separado por meios de separação gradiente de densidade comercialmente disponíveis e granulócitos coletados para contagem e testes de viabilidade celular. Para observar em tempo real NETosis em neutrófilos ao vivo, celular permeant e celular impermeant fluorescente do ácido nucleico manchas são adicionadas ao neutrófilos ativados por lipopolissacarídeo (LPS) ou phorbol myristate 12 13-acetato (PMA). Alterações na morfologia nuclear e formação líquida são observadas ao longo do tempo por microscopia de fluorescência. In vitro NETosis caracteriza-se ainda mais por co-colocalization do DNA de células livres (cfDNA), mieloperoxidase (MPO) e citrulinado histona H3 (citH3) usando um protocolo duplo-encontrava modificado. Para quantificar objectivamente formação líquida e citH3 expressão usando microscopia de fluorescência, redes e células citH3-positivo são quantificadas de forma cega usando software disponível. Esta técnica é um ensaio específico para avaliar em vitro capacidade dos neutrófilos caninos para submeter-se NETosis.

Usando este protocolo de imagem de célula viva, os investigadores podem observar a morfologia nuclear, integridade da membrana plasmática e presença de cfDNA na vida de neutrófilos. Um corante nuclear impermeant de célula manchas vermelho de ácidos núcleos em células com as membranas das células danificadas. Célula-permeant outro corante, rótulos os ácidos nucleicos intracelular em células vivas com membranas de plasma intactas. Todos os neutrófilos intactos, independentemente de seus tra...

Podemos descrever métodos para isolar caninos neutrófilos do sangue inteiro e visualizar a formação líquida em neutrófilos ao vivo usando microscopia de fluorescência. Também descritos são protocolos para quantificar a formação líquida e citrulinado histona H3 (citH3) expressão usando microscopia de imunofluorescência.

In Vitro Formação canina neutrófilos extracelular armadilha: Análise dinâmica e quantitativa por microscopia de fluorescência

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Este método pode responder a perguntas-chave sobre armadilha extracelular de neutrófilos ou formação de NET em cães ou outras espécies. As principais vantagens dessas técnicas incluem a detecção real ao vivo da formação de NET e a identificação de componentes de NET, como peroxidase leve e histona citrulinada H3. Comece obtendo 10 a 20 mililitros de sangue da veia jugular de um doador canino saudável, removendo a agulha da seringa antes de dispensar o sangue em tubos de heparina sódica para evitar o compartilhamento excessivo. Inverta suavemente os tubos algumas vezes para garantir uma mistura adequada do sangue e do anticoagulante e verifique se há coágulos e agregados de glóbulos vermelhos antes de colocar as amostras no gelo.Dilua o sangue anticoagulado com um volume igual de PBS de Dulbecco gelado e transfira oito mililitros de sangue diluído para um tubo cônico de polipropileno de 50 mililitros contendo 25 mililitros de 3% de Dextrana filtrado. Coloque o tubo na vertical por 30 minutos em temperatura ambiente para permitir a agregação e sedimentação dos eritrócitos. Em seguida, coloque cuidadosamente cinco mililitros de plasma rico em leucócitos em cima de cinco mililitros de meio gradiente de densidade em um tubo de fundo redondo de polipropileno de 14 mililitros.Após a centrifugação por gradiente de densidade, use uma pipeta sorológica de cinco mililitros para transferir a camada intermediária de células granulocitárias para 50 mililitros cônicos e lise quaisquer eritrócitos co-aspirados com as células polimorfonucleares com 20 mililitros de água fria e ultrapura. Inverta suavemente o tubo por 30 a 60 segundos para garantir a lisagem adequada antes de lavar as células em um volume igual de solução gelada de cloreto de sódio a 1,8%. Depois de inverter o tubo algumas vezes, centrifugue a quatro graus Celsius.Use uma pipeta sorológica para remover cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda suavemente o pellet em 100 microlitros de tampão de cultura de células. Conte e confirme sua viabilidade por exclusão de azul de tripano. Em seguida, dilua os neutrófilos para uma vez dez elevado a seis células por mililitro de concentração de tampão de cultura de células.É essencial usar uma técnica estéril adequada e manusear os neutrófilos com cuidado durante todo o processo de isolamento, pois a contaminação e as forças de cisalhamento podem levar à necrose in vitro e à lise celular. Para obter imagens dos neutrófilos por microscopia de fluorescência, adicione 200 a 400 microlitros de células em cada poço de uma placa de cultura de 12 poços revestida com poli-L-lisina para uma incubação de 30 minutos a 37 graus Celsius. Quando os neutrófilos estiverem ligados ao fundo dos poços, rotule as células com um corante de ácido nucleico fluorescente adequado por 10 minutos à temperatura ambiente.No final da incubação, ative os neutrófilos com 100 microgramas por mililitro de LPS, 100 nanomolares de PMA como controle positivo ou um volume equivalente de tampão de cultura de células como controle negativo a 37 graus Celsius. Em seguida, imagine as culturas de neutrófilos por microscopia de fluorescência com uma ampliação de 40 vezes nos pontos de tempo indicados. Para uma quantificação NET, coloque cuidadosamente lamínulas revestidas com poli-D-lisina de 18 milímetros de diâmetro em alvéolos individuais de uma placa de cultura de 12 poços e rotule os poços de acordo com o estímulo experimental.Em seguida, semeie de 100 a 200 microlitros dos neutrófilos isolados diretamente nas lamínulas para uma incubação de 30 minutos a 37 graus Celsius. Quando os neutrófilos aderirem às lamínulas, ative os neutrófilos em cada poço com LPS, PMA ou DPBS por 180 minutos, conforme demonstrado. Durante os últimos 30 minutos da incubação, coloque uma folha de filme de parafina sobre um suporte de tubo de ensaio para criar poços rasos e adicione duas a três gotas de 4% de paraformaldeído a cada poço.Rotule os poços como experimentalmente apropriados e use uma pinça fina para transferir suavemente as lamínulas de cada placa de cabeça para baixo para o poço preenchido com PFA correspondente apropriado. Após 20 minutos em temperatura ambiente, lave as células fixas três vezes por cinco minutos em duas a três gotas de solução salina tamponada por lavagem, movendo as células de um poço de DPBS para o próximo. Para permeabilizar as células, coloque suavemente as lamínulas de cabeça para baixo em uma gota de 1% NP-40 por um minuto, seguida por três lavagens salinas tamponadas de um minuto em um balancim.Após a última lavagem, coloque as lamínulas de cabeça para baixo em 100 a 200 microlitros de soro de cabra a 5% em placas de Petri rotuladas individualmente forradas com filme plástico de parafina fresco para uma incubação de uma hora a 37 graus Celsius com balanço. No final da incubação de bloqueio, lave as lamínulas três vezes em solução salina tamponada com balanço, como acabamos de demonstrar. Transfira as lamínulas para placas de Petri revestidas com filme de parafina de plástico individuais em 50 a 100 microlitros do anticorpo apropriado de interesse para uma incubação de uma hora a 37 graus Celsius com balanço.Após a lavagem, incubar as lamínulas com o anticorpo secundário conjugado com fluoróforo adequado durante uma hora a 37 graus Celsius, protegido da luz. No final da incubação do anticorpo secundário, lavar as lamínulas três vezes em solução salina tamponada no escuro com balanço, seguida de coloração com corante de ácido nucleico com DAPI durante cinco minutos no escuro à temperatura ambiente. Após três lavagens salinas tamponadas de um minuto no escuro com balanço, aplique uma gota de 50 microlitros de meio de montagem antidesbotamento em uma lâmina de vidro por amostra e monte cuidadosamente cada lamínula seca de cabeça para baixo em uma gota de meio de montagem.Em seguida, deixe as amostras curarem durante a noite a quatro graus Celsius, protegidas da luz. Na manhã seguinte, obtenha 10 imagens aleatoriamente de diferentes regiões de cada lamínula com uma ampliação de 40 vezes. Todos os neutrófilos intactos, independentemente do tratamento, devem aparecer em verde e exibir os núcleos lobulados característicos de zero a 30 minutos após a estimulação.Por volta dos 90 minutos, os núcleos dos neutrófilos tratados com PMA começam a perder sua aparência lobulada e continuam a se descondensar até a liberação do DNA livre de células. O LPS, um estimulante mais lento e fisiológico dos neutrófilos caninos, normalmente não resulta em descondensação da cromatina ou NETose até 90 minutos após a estimulação. Por 120 minutos, os neutrófilos ativados por LPS e PMA podem ser vistos cercados por DNA livre de células.Em comparação com as células estimuladas por LPS, mais neutrófilos ativados por PMA perdem a integridade da membrana plasmática, como evidenciado pela coloração com corante impermeável às células. Os neutrófilos não estimulados devem manter seus núcleos lobulados e membranas plasmáticas intactas durante todo o período de incubação. Neutrófilos estimulados por LPS por 180 minutos produzem andaimes NET discretos semelhantes a teias nas proximidades de neutrófilos próximos.Em contraste, os neutrófilos ativados por PMA produzem grandes quantidades de NETs que são visivelmente maiores em área. De fato, o PMA, um potente estimulante de uma enzima que catalisa a histona H3 citrulinada intracelular do componente NET essencial, induz um número maior de células que expressam histona H3 citrulinada intracelular em comparação com neutrófilos não estimulados e estimulados por LPS. Ao realizar este ensaio, é extremamente importante que o operador que adquire e analisa as imagens do microscópio esteja cego para as condições experimentais para manter a avaliação objetiva do ensaio.Metade desses procedimentos tem seus ensaios, como o ELISA ou citometria de fluxo, podem ser realizados para quantificar ainda mais a histona citrulinada H3 nas células. Não se esqueça de incluir controles negativos que consistem em neutrófilos não estimulados ou neutrófilos tratados com o inibidor da peptidil arginina, crirolídeo amidina. Também recomendamos testar diferentes diluições de anticorpos primários e secundários para minimizar ligações e interferências inespecíficas.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Neutrófilos Traps Extracelular (NET) são um mecanismo inato importante imunológico para combater as bactérias patogênicas, fungos e parasitas. Aqui nós descrevemos métodos para isolar granulócitos neutrófilos do sangue humano e para ativá-las para formar redes. Nós apresentamos técnicas de preparação para visualizar NETs em microscopia óptica e eletrônica.

Neutrófilos Traps Extracelular: Como Gerar e visualizá-los

Este vídeo demonstra a indução e visualização de armadilhas extracelulares de neutrófilos ou TNEs em neutrófilos pré-marcados usando soro de paciente contendo anticorpos anticitoplasma de neutrófilos. Além disso, o uso de um corante de DNA impermeável e microscopia de fluorescência permite a visualização de NETs.

Indução e visualização de armadilhas extracelulares de neutrófilos em neutrófilos pré-marcados

armadilhas extracelulares dos neutrófilos (NETS) são redes de ADN, histonas e proteínas de neutrófilos. Embora um componente da resposta imunitária inata, redes estão implicados na autoimunidade e trombose. Este protocolo descreve um método simples para o isolamento dos neutrófilos canino e quantificação de redes que utilizam um ensaio de microplaca de fluorescência.

A fluorescência ensaio simples para a quantificação de Canine neutrófilos Extracelular Armadilha lançamento

Aqui, apresentamos um protocolo para a geração de armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) e a operação NETQUANT, uma opção de software totalmente automática para quantificação de NETs em imagens de imunofluorescência.

Quantificação automatizada baseada em imagem de armadilhas extracelulares de neutrófilos usando NETQUANT

Este protocolo descreve um ensaio de neutrófilos armadilha extracelular (NET) altamente sensível e alta taxa de transferência para a quantificação semi-automático de ex vivo NET formação pela microscopia confocal tridimensional de imunofluorescência. Este protocolo pode ser usado para avaliar a formação de líquido e degradação após estímulos diferentes e pode ser usado para estudar terapias NET-alvo potenciais.

Um ensaio de alta produtividade para avaliar e quantificar a formação de neutrófilos extracelular armadilha

As armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) são estruturas tridimensionais geradas por granulócitos estimulados de neutrófilos. Tornou-se claro nos últimos anos que as redes estão envolvidas em uma grande variedade de doenças. A detecção de redes no tecido pode ter relevância diagnóstica, sendo necessários protocolos padronizados para a rotulagem de componentes NET.

Rotulagem de imunofluorescência de armadilhas extracelulares de neutrófilos humanos e murinos em tecido embebido em parafina

Descrevemos um método para identificar armadilhas extracelulares (NETs) em trombo cardiogênico felino fixo e parafinado de parafina usando recuperação de antígeno induzido pelo calor e um protocolo de rotulagem de dupla imunorotulagem.

Identificação de Armadilhas Extracelulares De Neutrófilos em Trombo Arterial Felino Embutido parafina usando Microscopia de Imunofluorescência

Apresenta-se aqui um protocolo para a indução e análise de armadilhas extracelulares (TNEs) de neutrófilos in vitro . A quantificação do DNA, da catelicidina (LL37) e da atividade enzimática produziu dados que mostram a variabilidade na composição e morfologia dos TNEs induzidos por estímulos microbianos e químicos em condições controladas semelhantes.

Análise morfológica e composicional de armadilhas extracelulares de neutrófilos induzidas por estímulos microbianos e químicos

Armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) estão associadas a várias doenças, e a imunofluorescência é frequentemente usada para sua visualização. No entanto, existem vários protocolos de coloração e, em muitos casos, apenas um tipo de tecido é examinado. Aqui, estabelecemos um protocolo geralmente aplicável para coloração de NETs em tecido humano e de camundongo.

Imagem por Imunofluorescência de Armadilhas Extracelulares de Neutrófilos em Tecidos Humanos e de Camundongos

Apresentamos um método automatizado de alto rendimento para quantificar armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) utilizando o sistema de análise de células vivas, juntamente com uma abordagem dual-dye dependente de permeabilidade de membrana.

Técnica de Alto Rendimento em Tempo Real para Quantificar a Formação de Armadilhas Extracelulares de Neutrófilos em Neutrófilos Humanos

Este protocolo definido descreve uma abordagem de microscopia de alto rendimento em tempo real para visualizar e quantificar a liberação de armadilha extracelular de neutrófilos humanos (NET) in vitro. O método reprodutível permite a investigação das características e cinética da liberação de NET após estimulação com indutores distintos de NETosis e permite a avaliação da farmacologia dos antagonistas da NETosis.

Quantificação microscópica em tempo real e de alto rendimento da liberação de armadilhas extracelulares de neutrófilos humanos e avaliação da farmacologia dos antagonistas

Aprenda a isolar neutrófilos caninos do sangue e visualizar a formação de NETs em células vivas usando microscopia de fluorescência. Este método permite quantificar citH3 e estudar funções imunes em cães.

In Vitro Formação canina neutrófilos extracelular armadilha: Análise dinâmica e quantitativa por microscopia de fluorescência

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