Visualização de variantes genéticas, metas de curtas e mutações pontuais no contexto morfológico do tecido com um ensaio de RNA In Situ da hibridação

Este método pode abordar questões-chave de pesquisa em neurociência, oncologia e além, como expressão específica do tipo de célula e mapeamento espacial de variantes de splice dentro do cérebro e microambientes tumorais. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode detectar junções de éxons, sequências curtas e mutações pontuais no contexto do tecido com sensibilidade e especificidade muito altas em células únicas. Demonstrando o procedimento estará Hell Pimentel, cientista associado do nosso laboratório.

Para preparar o tecido, fixe-o imediatamente após a dissecção em formalina tamponada a 10% neutra à temperatura ambiente por 16 a 32 horas. Posteriormente, a amostra é processada e incluída em parafina usando procedimentos padrão. Corte o tecido embutido em seções de cinco mícrons para mais ou para menos usando um micrótomo.

Monte as seções em lâminas de vidro eletrostaticamente adesivas e seque ao ar em temperatura ambiente durante a noite. Uma hora antes de realizar o ensaio de hibridização de RNA NC2, coloque as lâminas de tecido montadas em uma grade de lâminas e asse em um forno de ar circulante a 60 graus Celsius. Antes de iniciar o ensaio de hibridização de RNA NC2, certifique-se de que o forno de hibridização esteja ajustado para 40 graus Celsius.

Molhe bem o papel umidificador, remova qualquer água residual e coloque a tampa na bandeja de controle de umidade. Prepare 200 mililitros de reagente de recuperação de alvo 1X disponível comercialmente adicionando 20 mililitros de reagente de recuperação de alvo 10X a 180 mililitros de água. Coloque dois suportes de lâminas em um vaporizador.

Encha um suporte de lâmina com 200 mililitros de reagente de recuperação de alvo 1X e o outro com 200 mililitros de água. Usando o vaporizador, aqueça as duas soluções até ferver. Aqueça o tampão de lavagem 50X a 40 graus Celsius por 10 a 20 minutos.

Em seguida, prepare três litros de tampão de lavagem 1X diluindo 60 mililitros de tampão de lavagem 50X pré-aquecido com 2,94 litros de água. Em uma capela de exaustão, prepare 50% da solução de contracoloração de hematoxilina de Gill adicionando 100 mililitros de hematoxilina de Gill a 100 mililitros de água. Prepare o reagente azulado adicionando 1,43 mililitros de hidróxido de amônio de 20 a 30% a 250 mililitros de água.

Pré-aqueça as sondas alvo a 40 graus Celsius por 10 minutos antes da hibridização da sonda. Leve os sete amplificadoresreagentes, Amp 0 a 6, à temperatura ambiente. Inicie a deslipidização da amostra removendo seções do forno e imergindo as lâminas de tecido montadas em xileno com agitação por cinco minutos.

Depariffinize novamente em xileno fresco por cinco minutos. Desidratar em etanol 100% com agitação por dois minutos. E repita novamente em etanol 100% fresco por dois minutos.

Seque as lâminas ao ar a 60 graus Celsius em um forno de circulação de ar por cinco minutos até que estejam completamente secas. Em seguida, incube as seções com cerca de quatro gotas de peróxido de hidrogênio pronto para uso em temperatura ambiente por 10 minutos para extinguir a atividade da peroxidase endógena. Transvase a solução das lâminas e lave-as duas vezes com água.

Mergulhe brevemente as seções na água pré-aquecida e, em seguida, coloque as seções em 200 mililitros do reagente de recuperação alvo a 100 graus Celsius no vaporizador por 15 a 30 minutos. Remova as lâminas da recuperação do alvo e enxágue duas vezes em água. Mergulhe em etanol 100% por três minutos.

Em seguida, seque as lâminas a 60 graus Celsius em um forno de circulação de ar até que estejam completamente secas. Quando as lâminas estiverem secas, use uma caneta hidrofóbica para desenhar uma barreira hidrofóbica de aproximadamente 0,75 por 0,75 polegadas ao redor da seção. Deixe a barreira secar completamente em temperatura ambiente por um minuto.

Coloque os slides em um suporte de slides e coloque o suporte de slides na bandeja pré-aquecida com controle de umidade. Adicione cerca de quatro gotas de protease 3 a cada lâmina e incube a 40 graus Celsius no forno de hibridização por 15 a 30 minutos. Transvase a solução das lâminas e lave-as duas vezes com água.

Para iniciar o procedimento de hibridização da sonda, adicione cerca de quatro gotas da solução de sonda pronta para uso apropriada para cobrir toda a seção. Hibridizar as sondas a 40 graus Celsius no forno de hibridização por duas horas. Transvase a solução das lâminas e lave as lâminas em 200 mililitros de tampão de lavagem 1X à temperatura ambiente com agitação ocasional por dois minutos.

Repita o procedimento de lavagem. O próximo passo é amplificar o sinal incubando as seções em uma série de reagentes amplificadores. Adicione cerca de quatro gotas de Amp 0 para cobrir toda a seção em cada lâmina e incube a 40 graus Celsius no forno de hibridização por 30 minutos.

Em seguida, transvase a solução e lave as lâminas em 200 mililitros de tampão de lavagem 1X à temperatura ambiente com agitação ocasional por dois minutos. Repita o procedimento de lavagem. Da mesma forma, incube as seções em Amp 1 a Amp 6 na temperatura e pelo tempo indicado neste esquema.

Depois que as lâminas forem tratadas com a série de reagentes de amplificação, prepare uma solução de trabalho de corante Fast Red. Adicione o volume apropriado de corante Fast Red-B e corante Fast Red-A em um tubo e misture bem. Transvase o excesso de líquido das lâminas e adicione a solução de trabalho de corante Fast Red às lâminas.

Incube as lâminas em uma bandeja com tampa em temperatura ambiente por 10 minutos. Após 10 minutos, transvase a solução Fast Red e lave as lâminas duas vezes, mergulhando para cima e para baixo com água da torneira. Para contra-corar as seções de tecido, mergulhe as lâminas em solução de hematoxilina de 50% Gill em temperatura ambiente por dois minutos.

Lave as lâminas com água da torneira, repetindo várias vezes até que as lâminas estejam limpas enquanto as seções permanecem roxas. Mergulhe as lâminas em água de amônia 02% duas a três vezes para azular. Substitua a água de amônia por água da torneira e lave as lâminas de três a cinco vezes.

Seque as lâminas em um forno de circulação de ar a 60 graus Celsius por 15 minutos até secar completamente. Coloque uma a duas gotas de reagente de montagem em uma lamínula e coloque a lâmina sobre a lamínula, evitando qualquer aprisionamento de bolhas de ar. Seque as lâminas ao ar por pelo menos cinco minutos.

Por fim, observe as lâminas sob um microscópio de campo claro padrão. As sondas de junção de exon Double-Z foram projetadas para determinar o status do EGFRvIII em duas amostras de glioblastoma de parafina fixada em formalina ou FFPE. Ambas as sondas do tipo selvagem detectaram sinal em ambas as amostras, indicando que as duas amostras expressam EGFR do tipo selvagem.

No entanto, a sonda mutante detectou sinal apenas na amostra positiva para EGFRvIII e não na amostra negativa para EGFRvIII. Sondas de controle positivo e negativo foram incluídas no ensaio. Quando um ensaio de alvo curto foi realizado em células Jurkat, preparadas como um pellet de célula FFPE usando sondas antisense ou sensoriais, visando as sequências em vermelho, uma coloração robusta foi observada com sondas antisense para CDR3-alfa e CDR3-beta, enquanto as sondas sensoriais detectaram pouco ou nenhum sinal.

O dapB foi usado como controle negativo. O ensaio também é capaz de detectar mutações pontuais. Neste exemplo, duas sondas foram projetadas, uma para detectar a sequência EGFR mutada L858R e outra para detectar a sequência do tipo selvagem EGFR L858.

A sonda mutante detectou sinal na linhagem celular H1975, que é heterozigótica para a mutação EGFR L858R, mas não detectou sinal na linhagem celular H2229, que expressa apenas o tipo selvagem EGFR L858. A sonda do tipo selvagem detectou sinal em ambas as linhagens celulares. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de fixar adequadamente seus tecidos, executar sondas de controle positivo e negativo e usar o sistema de processamento de lâminas no forno de hibridização.

Após este procedimento, outros métodos como IHC com marcadores celulares podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como identificar a expressão específica do tipo de célula de variantes de splice ou sequências curtas de alvo. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores em neurociência, oncologia e além explorarem eventos alternativos de splicing no contexto do tecido, identificando mutações pontuais mapeadas espacialmente e visualizando sequências altamente homólogas e curtas in situ. Não se esqueça de que trabalhar com formalina e xileno tamponados neutros pode ser extremamente perigoso e precauções como trabalhar em uma capela e usar equipamentos de proteção individual devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.