Caracterização funcional de Carboxylesterases em casa resistente a inseticida moscas, Musca Domestica

Este método pode ajudar as questões-chave no campo da toxicologia de insetos, como, se todos expressam os genes de desintoxicação metabólica estão envolvidos na resistência a inseticidas? A principal vantagem desta técnica é que ela permite produzir maiores escalas de proteínas, e caracterizar a função dessas proteínas na metabolização de inseticidas in vitro. Demonstrando os procedimentos, estará Xuechun Feng, um estudante de pós-graduação em meu laboratório.

A pesquisa de doutorado de Xuechen está focada na caracterização da função da carboxila esterase na resistência ao parasita de moscas domésticas, Musca domestica. Para começar, misture um microlitro de DNA plasmático de entrada GFP, com cinco microlitros de um DNA linear C-term disponível comercialmente em tubos de PCR de 250 microlitros. Em seguida, adicione dois microlitros de mistura de recombinação lambda disponível comercialmente a cada um dos tubos de PCR.

Misture delicadamente os tubos e incuba-os a 25 graus Celsius durante a noite. Semeie dois mililitros de cultura de células SF9 de insetos de crescimento em fase logarítmica uniformemente nos poços de uma placa de cultura de células. Em seguida, deixe as células se fixarem por pelo menos três horas em temperatura ambiente, no exaustor.

Usando um microscópio de fase invertida a 250x, verifique a fixação da célula. Em seguida, remova o meio de cultura de células e substitua-o por dois mililitros de meio de inseto de Grace. Depois disso, prepare as soluções de mistura de transfecção A e B de acordo com o protocolo de texto.

Em seguida, misture suavemente as misturas de transfecção A e B batendo nos tubos. Incube a mistura em temperatura ambiente, no capô, por 35 minutos. Em seguida, adicione a mistura gota a gota, nas células semeadas.

Sele os poços com fita adesiva e incube as células a 27 graus Celsius, durante a noite. Substitua os dois mililitros do meio de inseto de Grace por dois mililitros de meio de crescimento completo. Em seguida, adicione 100 micromoles Ganciclovir a cada poço.

Sele os poços com fita adesiva e incube as células a 27 graus Celsius por 72 horas. 72 horas após a infecção, colete o meio de cada poço e transfira-o para tubos de centrífuga de 1,5 mililitro. Em seguida, centrifugue os tubos a 1500 vezes G, por cinco minutos a quatro graus Celsius.

Adicione um mililitro de meio de crescimento completo ao poço e use um microscópio com luz fluorescente para observar os sinais de infecção das células no estágio de amplificação do baculovírus P1. Transfira o sobrenadante para novos tubos de centrífuga de 1,5 mililitro e armazene-os a quatro graus Celsius, em condições escuras. Depois disso, semeie dois mililitros de cultura de células SF9 de insetos de crescimento em fase logarítmica, uniformemente, nos poços de uma placa de cultura de células.

Deixe as células se fixarem por pelo menos três horas em temperatura ambiente, no exaustor. Inocule cinco microlitros de estoque de vírus P1 nos poços semeados da célula e, em seguida, adicione 100 micromoles de Ganciclovir a cada poço. Sele os poços e incube as células por 72 horas a 27 graus Celsius.

Primeiro, cultivar cinco mililitros de células SF9 de insetos de crescimento em fase logarítmica, com meio de crescimento completo, em frascos T25 não tratados. Em seguida, adicione 25 microlitros de solução estoque do vírus P1 para infectar a cultura de células, por 48 horas, com agitação suave, a 27 graus Celsius. Usando acetonitrila, prepare diluições seriadas de 100 milimoles de permetrina.

Em seguida, semeie 200 microlitros de cultura de células infectadas suplementada com 300 microlitros de meio de crescimento completo, em uma placa de 24 poços. Certifique-se de que a permetrina esteja totalmente dissolvida na acetonitrila e uniformemente entregue em cada poço da placa. Depois de adicionar a permetrina, agite suavemente a placa para misturar totalmente a permetrina no meio.

Depois disso, feche a placa com fita adesiva e incube a placa a 27 graus Celsius, por 48 horas, no escuro. Remova o meio de cultura de células da placa sem perturbar a camada de células inferior anexada. Adicione 200 microlitros do reagente MMT a cada poço.

Em seguida, incube a placa a 37 graus Celsius por quatro horas, até que precipitantes de formazan roxo escuro se formem em cada poço. Adicione 500 microlitros de DMSO a cada poço, para dissolver totalmente os precipitantes. Em seguida, transfira 200 microlitros da solução dissolvida para cada poço de uma placa de 96 poços.

A dissolução total do precipitado em DMSO é crucial para a precisão dos resultados. Após adicionar o DMSO às amostras na placa, as amostras serão lavadas com a pipeta, por várias vezes, até que o precipitado esteja totalmente dissolvido. Finalmente, use um leitor de microplacas para medir os valores de absorbância da placa em 540 nanômetros.

No estágio P1, a taxa de infecção é baixa. No estágio P2, a taxa de infecção foi significativamente aumentada. No estágio de infecção P3, quase todas as células apresentaram sintomas de descolamento da placa de cultura celular, aumento do diâmetro celular, bem como a cessação do crescimento celular.

Com base nos valores de absorbância detectados, as células que expressam Md alfa E7 apresentaram viabilidade significativamente maior, em comparação com as células CAT controle. Ao realizar este procedimento, é importante evitar a contaminação celular em todas as etapas, limpando a superfície dos materiais, como garrafas e tubos, com etanol a 70% antes de realizar os experimentos com células. Após este procedimento, alguns outros métodos, como a modelagem por homologia e a análise escura, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como as interações entre a proteína carboxi esterase e o ligante de permetrina.

Essa técnica abriu caminho para os pesquisadores da toxicologia de insetos explorarem a caracterização funcional dos genes e mecanismos de resistência a inseticidas de insetos. Não se esqueça de que trabalhar com inseticida pode ser muito prejudicial, e cuidados, como luvas e jalecos, devem sempre ser tomados durante a realização desses procedimentos.