Avaliação das respostas de células T Zika vírus específicos em órgãos Immunoprivileged de infectados Ifnar1^{- / -} ratos

Durante a infecção pelo vírus Zika, as células T podem se infiltrar em órgãos imunoprivilegiados para eliminação do vírus, mas também podem contribuir para a imunopagênese, como síndrome de Guillain-Barre ou lesão de testículos. A principal vantagem dessa técnica é que facilita a detecção à base de tetramer de células T específicas de antígeno em órgãos imunoprivilegiados, tanto durante a infecção pelo vírus Zika quanto após a imunização da vacina. Neste modelo, a infecção pelo vírus Zika é iniciada em camundongos eliminadores do receptor alfa/beta, permitindo o rastreamento de células T específicas do vírus Zika no cérebro, testículos e baço.

Usando uma abordagem de coloração de tetramer, é possível investigar apenas características de órgãos imunoprivilegiados infiltrando células T específicas do vírus Zika para explorar contribuições de células T para a imunoproteção e células imunopatômicas. Para a infecção pelo vírus Zika, entregue uma vez 10 às quatro unidades de formação de foco do vírus Zika em 100 microliters de PBS via inoculação retro-orbital em camundongos de seis a oito semanas de interferon alfa/receptor beta. Em seguida, monitore o peso e os sinais clínicos dos animais infectados diariamente por 15 dias.

Sete dias após a inoculação, proteja o animal infectado na posição supina em uma espuma cirúrgica, e use um bisturi estéril para fazer uma incisão da pele ao longo da linha média do abdômen. Use uma tesoura para abrir os músculos abdominais e extrair suavemente o fígado. Em seguida, remova o baço e enxágue o tecido três vezes em PBS para remover o sangue.

Após a última lavagem, coloque o baço em 1,5 mililitros de meio RPMI gelado no gelo até que todos os baços tenham sido coletados. Para gerar uma suspensão unicelular, coloque os baços em um coador de células de malha estéril de 40 micrômetros em cima de um tubo de 50 mililitros, e adicione dois mililitros de meio RPMI gelado suplementado com 10% de soro bovino fetal, ou FBS, ao coador. Em seguida, use o êmbolo de uma seringa de cinco mililitros para macerar o tecido através do filtro, usando meio fresco para lavar as células liberadas através da malha.

Transfira a suspensão unicelular para um tubo cônico de 15 mililitros para centrifugação, e resuspenda a pelota em cinco mililitros de tampão de lise de glóbulos vermelhos. Depois de cinco a seis minutos em temperatura ambiente, pare a lise com 10 mililitros de RPMI gelado mais FBS para uma segunda centrifugação, e resuspense a pelota em 10 mililitros de meio completo para contar. Sete dias após a inoculação, imobilize um rato macho eutanizado, infectado na posição propensa em uma tábua de corte, e proteja o couro cabeludo com fórceps retos de um por dois dentes.

Use uma tesoura de íris para fazer uma incisão midline no couro cabeludo, expondo o crânio, e use pinças afiadas para fixar os dois lados das órbitas com pinças afiadas, fixando o cérebro. Colocando uma ponta de tesoura de íris afiada no foien magnum, corte lateralmente no crânio de cada lado. Corte cuidadosamente da mesma cavidade até a linha média, em direção ao nariz, mantendo as pontas da tesoura o mais superficial possível para evitar ferir o cérebro.

Levante o cérebro com fórceps, e use uma tesoura de íris afiada para dissecar cuidadosamente as fibras nervosas cranianas. Em seguida, use os fórceps para transferir o cérebro para um tubo de 15 mililitros contendo cinco mililitros de RPMI gelado mais FBS. Para isolar os testículos, levante a pele abdominal com fórceps e use a tesoura de íris para fazer uma incisão longitudinal através do integument e da parede abdominal e expor a parte mais baixa do abdômen.

Empurre os testículos até a incisão, e use pinças para puxar suavemente a camada de gordura, para expor um testículo globular em ambos os lados. Use a tesoura de íris para dissecar cuidadosamente a camada de gordura e a epidídica, e transfira os testículos para um tubo de 15 mililitros contendo cinco mililitros de RPMI gelado mais FBS. Para gerar uma suspensão unicelular de qualquer um dos tecidos colhidos, coloque o órgão em um coador celular estéril com uma malha de 100 mícrons em cima de um tubo de 50 mililitros, e adicione dois mililitros de RPMI gelado mais FBS ao coador.

Usando o êmbolo de uma seringa de cinco mililitros, amasse o tecido e lave o filtro com meio fresco até que o órgão esteja totalmente moído através da malha. Transfira a suspensão unicelular para um tubo de 15 mililitros para centrifugação e resuspenda a pelota em cinco mililitros de 30% de densidade gradiente médio. Coloque cuidadosamente a solução celular sobre dois mililitros de 70% de gradiente de densidade em um novo tubo de 15 mililitros, e separe as células por centrifugação gradiente de densidade.

Em seguida, transfira as células da interfase entre os dois gradientes de densidade para um novo tubo de 15 mililitros contendo 10 mililitros de RPMI frio mais FBS para outra centrifugação, e resuspenque a pelota em 10 mililitros de RPMI/FBS gelados para contar. Para analisar as células por citometria de fluxo, diluir as células para cinco vezes 10 para as seis células por 100 microliters na concentração de buffer FACS, e incubar as amostras de células com 10 microliters de anticorpos anti-rato CD16/CD32 bloqueadores por amostra. Após 10 minutos à temperatura ambiente, adicione 20 microliters de células ao número apropriado de poços de uma placa de fundo redondo de 96 poços de acordo com o protocolo experimental de coloração de citometria de fluxo, e adicione 20 microliters da mistura de tetramet de proteína E a cada poço para uma incubação de 30 minutos à temperatura ambiente no escuro.

No final da incubação, adicione os anticorpos da superfície celular de interesse às células para uma incubação de 30 minutos a quatro graus Celsius, protegidos da luz. Em seguida, lave as células duas vezes com 200 microliters de tampão FACS por lavagem, e resuspenja cuidadosamente as células em cada poço com 200 microliters de tampão FACS fresco. Em seguida, armazene as amostras a quatro graus Celsius, protegidas da luz, até sua análise em um citómetro de fluxo.

Sintomas patológicos e sinais como mieloparalis e paraparesia motora são observados no receptor alfa/beta interferon 1 camundongos eliminados sete dias após a inoculação com o vírus Zika. As alterações de peso no receptor alfa/beta infectado 1 animais eliminados foram monitoradas por 15 dias, com perda de peso observada pela primeira vez quatro dias após a infecção e recuperação de peso a partir do sétimo dia pós-infecção. Imagens representativas de cérebros murinos infectados revelam edema óbvio e hiperemia sete dias após a inoculação com o vírus Zika.

Imagens representativas de testículos infectados por Zika murina demonstram um gradual encolhimento do sétimo ao 30 dias após a infecção. A análise histopatológica das seções cerebrais e teciduais infectadas pelo Zika também ilustra o efeito das mudanças patológicas destrutivas em comparação com controles não infectados. Como esperado das análises macro e histopatológicas, altas cargas virais também são detectadas no cérebro e testículos de camundongos infectados pelo vírus Zika por imunostaining.

Isso é acompanhado por uma robusta infiltração de células T CD3 positivos no cérebro pós-zika infecção. Os linfócitos T específicos do vírus Zika são detectados tanto em camundongos infectados pelo vírus Zika quanto em camundongos imunizados pela proteína E pela coloração do tetramer da proteína E. Células T cd8-positivas específicas da proteína E também podem ser detectadas no cérebro e testículos sete dias após a inoculação com zika vírus.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no estudo da caracterização de células T específicas de patógenos em órgãos imunoprevalentes durante infecções naturais em modelos animais. Esse método também pode ser aplicado a outros órgãos imuno prevalentes, como placenta ou olho, bem como a infecção viral e câncer. Após este procedimento, os tetramers MHC-I podem ser usados para a detecção imunohistoquímica ou imunofluorescente de células T específicas de patógenos para acessar a distribuição de células T infiltradas no cérebro ou testículos.