Isolamento e identificação de células do sistema imunológico Extravascular do coração

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre a composição dos subconjuntos de células imunes no coração, tanto durante estados estacionários quanto de doença. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser usada para imunofenotipagem precisa de populações de células imunes cardíacas, incluindo subconjuntos muito raros. Este protocolo é relativamente simples.

No entanto, as injeções nas veias da cauda podem ser difíceis, por isso é importante praticar essa técnica até que você se sinta confortável antes de usar animais experimentais. Para rotular os leucócitos circulantes, carregue 200 microlitros de anticorpo anti-CD45 conjugado com fluoróforo de camundongo recém-preparado em PBS em uma seringa de insulina de calibre 28,5 e pré-aqueça oito camundongos de 12 semanas em um cobertor de água circulante ajustado para 35 a 41 graus Celsius por cinco a dez minutos. Quando a veia da cauda estiver dilatada, prenda o primeiro animal na posição esternal em um dispositivo de contenção apropriado.

Se as veias da cauda não estiverem suficientemente dilatadas, mergulhe a cauda em água a 36 a 40 graus Celsius por um a dois minutos. Quando as veias da cauda estiverem prontas, esfregue a área de injeção com gaze embebida em etanol a 70% e imobilize a base da cauda com os dedos indicador e médio e a região médio-distal da cauda com o polegar e o dedo anelar. Segurando a agulha com o lado chanfrado para cima e paralelo à veia, insira a agulha em uma veia da cauda dilatada e injete por via intravenosa todo o volume do anticorpo.

Em seguida, permita que o anticorpo circule por cinco minutos antes da eutanásia humana. Para colher o coração, borrife o camundongo com etanol 70% e levante a pele do abdômen para abrir o abdômen ao longo da linha média ventral, dos quadris até o esterno. Abra o peritônio e mova o fígado para expor o diafragma.

Corte o diafragma e as costelas em ambos os lados da linha média, tomando cuidado para não perfurar os pulmões e o coração. Descasque as costelas para expor o coração antes de incisar os átrios esquerdo e direito. Segurando suavemente a base do coração com uma pinça, insira uma agulha de calibre 21 presa a uma seringa de 60 mililitros no ventrículo esquerdo próximo ao ápice e perfunda o coração com 15 a 20 mililitros de PBS frio.

A perfusão adequada do coração é essencial para evitar contaminantes intravasculares. Portanto, tome cuidado para dissecar e perfundir o coração rapidamente após a eutanásia para evitar a contaminação devido ao sangue coagulado. Após a perfusão do ventrículo direito, como acabamos de demonstrar, pulmões brancos e fígado pálido devem ser observados.

Segurando a base do coração com a pinça, puxe suavemente o coração para cima e corte as principais artérias e veias pulmonares, aorta e saco pericárdico para separar o tecido cardíaco. Segurando suavemente o coração entre os dedos polegar e indicador, limpe cuidadosamente o coração com uma toalha de papel limpa e sem fiapos e use a pinça para remover os átrios e quaisquer restos de artérias e veias importantes ou outros contaminantes. Coloque o coração limpo em um prato de plástico de cinco centímetros e adicione 50 microlitros de PBS frio.

Usando uma tesoura de dissecação curva, pique o coração até que não haja pedaços visíveis e o tecido tenha uma consistência lisa e espessa. Use uma pinça curva para transferir o tecido para tubos de microcentrífuga de dois mililitros contendo 800 microlitros de DMEM frio. Suplementar com colagenase, DNase e hialuronidase e incubar por 45 a 60 minutos a 37 graus Celsius e 50 rpm.

No final da digestão, vórtice amostras por 20 segundos e coloque-as imediatamente no gelo. A amostra deve ser sempre mantida a quatro graus Celsius, a menos que especificado de outra forma, pois alguns antígenos de superfície podem ser internalizados se deixados à temperatura ambiente. Em seguida, pré-umedeça o filtro de células de 140 microlitros em um tubo cônico de 50 mililitros por amostra com um mililitro de HBB frio.

Usando uma pipeta de um mililitro, pipetar as amostras até que as suspensões de tecido sejam homogêneas e não obstruam a ponta da pipeta e adicione as amostras homogeneizadas aos filtros. Lave lentamente as amostras através dos filtros com 12 a 14 mililitros de HBB frio por amostra e transfira as amostras filtradas para um tubo cônico de 15 mililitros rotulado no gelo. Uma boa digestão é demonstrada pela ausência de restos de coração no filtro.

Colete as amostras por centrifugação e remova o sobrenadante. Adicione um mililitro de tampão de lise de potássio e cloreto de amônio a cada amostra. Ressuspender as amostras com um breve vórtice, seguido de uma incubação de cinco minutos à temperatura ambiente.

Em seguida, pare a hemólise com cinco a oito mililitros de HBSS frio. Colete as amostras por centrifugação e ressuspenda os pellets em um mililitro de classificação de células ativadas por fluorescência ou tampão FACS e transfira para tubos de microcentrífuga individuais de 1,5 mililitro para outra centrifugação. Para analisar as amostras por citometria de fluxo, ressuspender os pellets em 50 microlitros de anticorpo anti-CD16/CD32 e um bloqueador de monócitos para reduzir a ligação inespecífica do anticorpo por uma incubação de 15 minutos à temperatura ambiente.

Sem lavar, adicione 50 microlitros de mistura principal de anticorpos a cada amostra com mistura para uma incubação de 30 minutos a quatro graus Celsius protegida da luz. No final da incubação, lave as amostras com 600 microlitros de tampão FACS por tubo e ressuspenda os pellets em 300 microlitros de tampão FACS fresco ou 1% de paraformaldeído. Em seguida, analise os leucócitos cardíacos por citometria de fluxo de acordo com os protocolos padrão de análise de fluxo.

A análise da suspensão cardíaca de célula única por citometria de fluxo requer pré-gating com CD45 para diferenciar células imunes de células não imunes do coração, seguido por gating de exclusão de célula única e tamanho pequeno. Os macrófagos, identificados por sua expressão de CD64, são a principal população de células imunes do coração, representando 60 a 70% de todas as células imunes. As células dendríticas cardíacas convencionais são células CD64-negativas que expressam altos níveis de MHC classe II e CD11c.

Essas células podem ser divididas com base em sua expressão de CD103 ou CD11b e representam uma subpopulação cardíaca muito menor em comparação com os macrófagos. O uso de citometria de fluxo de uma única suspensão celular de miocárdio permite o estudo de pequenas subpopulações de leucócitos no coração. Por exemplo, usando a análise de citometria de fluxo para comparar as células imunes do miocárdio do tipo selvagem versus camundongos deficientes em Batf3, a falta de células dendríticas positivas para CD103 pode ser confirmada nos animais nocauteados.

Além disso, esta análise revelou uma falta de alteração significativa da composição de outras populações cardíacas nos animais deficientes em Batf3, demonstrando o grau de sensibilidade que pode ser alcançado usando este método combinado de digestão enzimática e mecânica para obter uma única suspensão celular. Ao tentar este procedimento, é importante sempre levar em consideração a viabilidade do seu isolado de células. Portanto, recomendamos otimizar o tempo e a concentração enzimática da digestão de acordo com suas condições experimentais.

Após este procedimento, outros métodos, como sequenciamento de RNA de célula única, ensaios funcionais e isolamento de esferas magnéticas, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre as funções das células isoladas.