Name: Isolamento e identificação de células do sistema imunológico Extravascular do coração (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Aprenda a isolar e identificar células imunes do miocárdio murino usando digestão enzimática e citometria de fluxo. Este método permite quantificar subpopulações raras em estados de repouso e inflamação.

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Este trabalho foi apoiado pelo canadense institutos de pesquisa em saúde (148808 e 148792), SE foi apoiado por um coração e Stroke Foundation, o prêmio do pessoal do escritório Provincial de Ontário, March of Dimes, Ted Rogers Centre para a investigação de coração e o Peter Munk Centro cardíaco. Xavier possui um CIHR Banting Fellowship. LA tem um coração & Stroke/Richard Lewar Studentship Award.

Declaração de ética: Este protocolo foi revisado e aprovado pelo Comitê de cuidado Animal na rede de saúde da Universidade (Toronto, Canadá) e está em conformidade com o Conselho canadense no cuidado Animal.
1. preparação buffer
<ol><li>Prepare o tampão HBB (Hank está equilibrado sal solução (HBSS), soro bovino de calor 2% inactivada, 0,2% de albumina de soro bovino). Adicione 10 mL de calor inativada soro bovino e 1 g de albumina de soro bovino de 500 mL de HBSS. Filtro de esterilizar através de um filtro de 0,2 µm e armazenar a 4 ° C.</li>
	<li>Preparar o tampão de FACS (tampão fosfato salino (PBS), inactivados por calor de 2% de soro bovino, 1mm de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA, pH 8.0)). Adicione inactivados por calor de 10ml de soro bovino e 1 mL de EDTA 0,5 M para 500 mL de PBS. Filtro de esterilizar através de um filtro de 0,2 µm e armazenar a 4 ° C. Nota: Soluções podem ser armazenadas a 4 ° C por até 1 mês.</li>
</ol>2. rotulagem de leucócitos em circulação
<ol><li>Assepticamente prepare injeção de CD45 anti-rato com 1 µ g de anticorpo diluído em solução salina estéril tamponada de fosfato (PBS) para um volume final de injeção de 200 µ l/mouse. Carregar o volume em uma seringa de insulina 28,5 G e manter-se longe da luz. Nota: Use dois anticorpos anti-CD45 marcado com fluorocromo diferente a fim de diferenciar o intravascular (manchado através da administração i.v.) a coloração intracardíaco (manchado após digestão; consulte a etapa 4).</li>
	<li>
Pré-aquecer ratos (8-12 semanas de idade), expondo a cauda de uma lâmpada de calor vermelho por 5 min. Cuidado: Não superaqueça o animal. Manter a lâmpada a uma distância segura (> 30 cm).<ol>
<li>Contenha o animal na posição esternal, utilizando um dispositivo apropriado. Expor e estabilizar o rabo com a mão não dominante por imobilizando a base da cauda com o índice e o dedo médio e região médio-distal da cauda com o polegar e o dedo anelar. Atenção: Não aplique demasiada força na ponta da cauda como a pele pode ser puxada para. Introduza a agulha com o bisel voltado para cima na veia. Manter a agulha paralelamente à veia em todos os momentos como é fácil para punção da veia. Nota: Introduzir a seringa de sangue pode ocorrer e é um sinal de uma boa injeção. Dobrar a agulha a um ângulo de 90° pode facilitar a administração intravenosa. Confirme com seu escritório de segurança como agulhas dobra podem representar um perigo.</li>
		<li>200 µ l por via intravenosa Injecte na veia da cauda. O líquido deverá fluir facilmente e temporariamente a veia. Cuidado: Não force fluido em se encontrar resistência. Isso é sinal de má colocação da agulha.</li>
		<li>Permitir que o anticorpo a circular por 5 min antes humanamente eutanásia do mouse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. coração isolando e digestão
<ol><li>
Eutanásia em ratos usando CO2 ou por outro procedimento de eutanásia institucionalmente aceitos.
	<ol>
<li>Para eutanásia de CO2 , posicione o mouse na câmara de CO2 e definir a taxa de preenchimento de 20% do volume da câmara por minuto (ou seja, se a câmara estiver 10L, preenchimento a 2 L/min). Executado por 2 min e monitor do mouse até respiração cessou.</li>
		<li>Desligue o CO2 e deixar o mouse de um adicional 1-2 min. Certifique-se de respiração cessou antes de abrir a câmara e executar uma pitada de dedo do pé para confirmar que o mouse está morto antes de prosseguir para processar o mouse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pulverize o mouse com etanol a 70%. Levante a pele do abdômen e dissecar o mouse por corte ao longo do início da linha média ventral a nível dos quadris até o esterno. Abrir o abdômen e mover o fígado para expor o diafragma.</li>
	<li>
Corte o diafragma e, em seguida, as costelas de ambos os lados da linha média, tendo o cuidado de evitar perfurar os pulmões e o coração.
	<ol>
<li>Expor o coração por peeling volta as costelas e, em seguida, corte primeiro os átrios esquerdos seguidos dos átrios direito. Cuidado: Tenha cuidado ao cortar os átrios, garantindo não artérias ou veias estão lesionadas, como isto pode diminuir a eficiência da lavagem do sangue contido nos órgãos.</li>
		<li>Perfundir o coração com 15-20 mL de PBS frio usando uma seringa de 60 mL equipada com uma agulha 21G e PBS frio. Delicadamente, segure a base do coração com fórceps e insira a agulha no ventrículo esquerdo perto do ápice. Repita o procedimento no ventrículo direito. Uma injeção adequada resulta em brancos pulmões e fígado pálido. Nota: A perfusão deve ser realizada dentro de 5 minutos após eutanásia para evitar a coagulação do sangue, que pode contaminar os órgãos de interesse com células de circulação.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Segurar a base do coração com fórceps e gentilmente puxe o coração, em seguida, desanexar o coração cortando as principais artérias pulmonares e veias, aorta e o saco pericárdico.
	<ol>
<li>Limpar o coração, delicadamente segurando o coração entre o polegar e o dedo indicador em uma toalha de papel limpa fiapos e puxar os átrios e os restos de artérias e veias e de outros contaminantes com fórceps. Nota: Certifique-se a totalidade dos átrios é removida e outros tecidos, tais como o pulmão ou dos vasos sanguíneos, estão presentes como estes tecidos têm suas próprias células imunes residentes. O pulmão, em particular, tem uma população de grandes células imunes que pode mascarar as populações menores daqueles dentro do miocárdio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Coloque o coração em um prato de plástico de 5 cm com 50 µ l de PBS frio.
	<ol>
<li>Picar o coração usando tesouras de dissecação curvas até existem pedaços visíveis e tem uma consistência suave. Nota: Tente manter o coração em uma área isolada do prato durante a cortar para minimizar a perda de tecido.</li>
		<li>Tecido de thetrituratedheart de transferência usando pinça curva para tubo de microcentrifuga de 2 mL com a 800 µ l frio Dulbecco modificado águia médio (DMEM).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Adicionar 450 U/mL ofcollagenase I, 60 U/mL de hialuronidase tipo S e 60 U/mL de DNase-I para cada amostra.
	<ol>
<li>Incube as amostras a 37 ° C, num balanço agitador a 50 rpm para 45 – 60 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Depois da digestão, brevemente amostras de vórtice (20 s) e coloque imediatamente no gelo para manter as amostras em 4 ° C.
	<ol>
<li>Usando uma pipeta de 1 mL, pipete amostras acima e para baixo até que as amostras de tecido são homogêneas e não entupir a ponta da pipeta. Nota: A definição de um número específico de vezes para pipetar pode aumentar a reprodutibilidade. Se os corações não são otimamente digeridos, pedaços de miocárdio podem obstruir a pipeta. Moedura suavemente a ponta da pipeta contra o tubo microcentrifuga ajudará a homogeneizar os pedaços maiores de tecido.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Pre-molhado um coador de célula 40 µm colocado em um tubo cônico de 50 mL com 1 mL de frio HBB.
	<ol>
<li>Adicionar a amostra homogeneizada para o filtro e lave através de derramando lentamente 12 – 14 mL de frio HBB.</li>
		<li>Transferir amostras filtradas para um tubo cônico de 15ml rotulados e manter a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Centrifugar as amostras a 400 x g por 5 min a 4 ° C. Aspire o sobrenadante.
	<ol>
<li>Lyse pilhas de sangue vermelhas, adicionando 1 mL de tampão de lise de amónio-cloreto de potássio (ACK) para cada amostra. Resuspenda as amostras vortexing e incubar a temperatura ambiente por 5 min.</li>
		<li>Uma vez que Lise foi concluído, adicione 5 – 8 mL de frio do Hank equilibrado sal solução (HBSS) para parar a hemólise.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugar as amostras na faz 400 x 5 min a 4 ° C. Aspire o sobrenadante.</li>
	<li>Adicione 1 mL de tampão de FACS para cada amostra e transferir para um tubo de microcentrifugadora rotulados de 1,5 mL. Nota: O protocolo pode ser pausado aqui para até 2 h com amostras armazenadas a 4 ° C.</li>
</ol>4. fluxo Cytometry manchando e análise
<ol><li>
Centrifugar as amostras a 400 x g por 5 min a 4 ° C.
	<ol>
<li>Para reduzir a ligação de anticorpos inespecíficos, diluir 1: 100 anti-CD16/CD32 e bloqueador de monócitos (01:20) (ver Tabela de materiais) contabilização de 50 µ l FACS, por exemplo. Incube a temperatura ambiente por 15 min.</li>
		<li>Prepare a contabilização de diluição (1: 250 para cada anticorpo) Anticorpo de 50 µ l de FACS por amostra. Nota: Uma tintura de viabilidade pode ser incluída no coquetel do anticorpo para eliminar as células mortas. Como alternativa, exclusão de tamanho pequeno por análise de fluxo pode ser usado (Figura 1C e D).</li>
		<li>Sem lavar, adicione 50 µ l de mistura de mestre de anticorpo para cada amostra e misture.</li>
		<li>Incube as amostras a 4 ° C por 30 min no escuro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicione 600 FACS µ l de cada amostra para lavar e centrifugar as amostras a 400 x g por 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Aspire o sobrenadante e ressuspender em 300 µ l FACS. Mantenha as amostras em 4 ° C, no escuro. Nota: Alguns corantes de viabilidade, como o DAPI, exigem a coloração dentro de 10 min antes da execução de citometria de fluxo.</li>
	<li>Análise por citometria de fluxo (ver figuras 1 e 2) dentro da próxima 3h. Se um tempo maior é a fixação necessária, a curto prazo, usando um paraformaldeído de baixa concentração (0,5-1% em PBS) é recomendada para preservar a coloração. Nota: É altamente recomendável para filtrar amostras através de um filtro de célula de 40 µm antes da análise de citometria de fluxo iniciar para evitar obstrução do fluidics do citômetro de fluxo.</li>
</ol>

<ol><li>Marboe, C. C., Fenoglio, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology+and+natural+history+of+human+myocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22Pathology+and+Immunopathology+Research%22%5BJournal%5D)">Pathology and natural history of human myocarditis.</a> Pathology and Immunopathology Research. 7 (4), 226-239 (1988).</li>
<li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li>
<li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+abundant+tissue+macrophage+population+in+the+adult+murine+heart+with+a+distinct+alternatively-activated+macrophage+profile%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile.</a> PLoS One. 7 (5), 36814(2012).</li>
<li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25349429">Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).</li>
<li>Fujiu, K., Wang, J., Nagai, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24675722 ">Cardioprotective function of cardiac macrophages.</a> Cardiovascular Research. 102 (2), 232-239 (2014).</li>
<li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+Facilitate+Electrical+Conduction+in+the+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart.</a> Cell. 169 (3), 510-522 (2017).</li>
<li>Nahrendorf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+healing+myocardium+sequentially+mobilizes+two+monocyte+subsets+with+divergent+and+complementary+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions.</a> Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).</li>
<li>Clemente-Casares, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CD103%28%2B%29+Conventional+Dendritic+Cell+Surveillance+System+Prevents+Development+of+Overt+Heart+Failure+during+Subclinical+Viral+Myocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A CD103(+) Conventional Dendritic Cell Surveillance System Prevents Development of Overt Heart Failure during Subclinical Viral Myocarditis.</a> Immunity. 47 (5), 974-989 (2017).</li>
<li>Van der Borght, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+Infarction+Primes+Autoreactive+T+Cells+through+Activation+of+Dendritic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Myocardial Infarction Primes Autoreactive T Cells through Activation of Dendritic Cells.</a> Cell Reports. 18 (12), 3005-3017 (2017).</li>
<li>Galkina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+migration+of+effector+CD8%2B+T+cells+into+the+interstitium+of+the+normal+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Preferential migration of effector CD8+ T cells into the interstitium of the normal lung.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3473-3483 (2005).</li>
<li>Edelson, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+CD103%2B+dendritic+cells+form+a+unified+subset+developmentally+related+to+CD8alpha%2B+conventional+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Peripheral CD103+ dendritic cells form a unified subset developmentally related to CD8alpha+ conventional dendritic cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 823-836 (2010).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Inflamação do miocárdio ou miocardite, é uma característica das doenças cardiovasculares mais. No entanto, o miocárdio não é desprovida de seus próprios componentes imunes nos Estados de não-doença. Durante o estado estacionário, muitas células do sistema imunológico residem no miocárdio e desempenham o papel essencial de manutenção e proteção. A caracterização dessas diversas populações de células não teria sido possível sem métodos como o apresentado neste protocolo.
Uma combinação de digest...

Diferentes formas de stress do miocárdio ou acidentes, inclusive isquêmica (reperfusão de isquemia ou infarto do miocárdio) e não-isquêmica (hipertensão ou miocardite), promover o recrutamento de células inflamatórias com reparadora e protetora, mas também Propriedades de patogenicidade. Logo em 1891, Romberg descrita pela primeira vez a presença de celulares se infiltra no miocárdio de pacientes infectados com tifo e febre escarlatina1. No entanto, o estudo detalhado de células do sistema imunológico cardíacas necessária ao desenvolvimento de técnicas mais avançadas de immunophenotyping. Como consequência, somente recentemente nós começaram a entender que uma população diversa de células do sistema imunológico com funções essenciais de manutenção durante o estado estacionário reside dentro do miocárdio.
Histologia tem sido e ainda é, o método mais comum para caracterizar pilhas imunes cardíacas durante a inflamação. No entanto, enquanto histologia representa uma valiosa ferramenta de diagnóstico, sua utilização no estudo de células do sistema imunológico cardíacas tem limitações importantes. As células imunitárias que residem no miocárdio representam uma proporção muito pequena das células totais e são mais ou menos uniformemente distribuídas em um espaço proporcionalmente imenso. Da mesma forma, várias formas de inflamação cardíaca, tais como miocardite viral, apresentam padrões focais de inflamação. Isto significa que uma análise precisa do sistema imunológico do coração muitas vezes exige graus mais elevados de amostragem histológica, aumentando o custo para reduzir o preconceito. Além disso, a histologia fornece uma quantidade muito limitada de informações utilizáveis na identificação de células (por exemplo, o número de parâmetros). Com um número sempre crescente de subconjuntos de célula que exigem o uso de vários marcadores de expressão (incluindo os marcadores de superfície, fatores de transcrição ou moléculas secretadas), citometria de fluxo estabeleceu-se como a ferramenta mais poderosa para immunophenotyping, devido ao baixo custo e alta produtividade.
O uso de técnicas de immunophenotyping é estreitamente dependente do desenvolvimento de protocolos de digestão eficiente que permitiu para análise de single-células de um grande número de células. O desenvolvimento de protocolos exaustivos de extração de célula aberta uma nova janela de oportunidades no estudo da imunologia cardíaca. Através da combinação de digestão, citometria de fluxo e transcriptomics, as grandes populações de macrófagos e células dendríticas, que reside no coração foram caracterizadas2,3. A população mais abundante de células do sistema imunológico cardíacas durante estado estacionário são CD64+MerTK+ macrófagos, que podem ser divididos com base na sua expressão de CCR2 ou CD11c2. CCR2+ macrófagos originam hematopoiese adulta da medula óssea, Considerando que a maioria dos CCR2– macrófagos, que podem expressar os níveis de altos ou baixos de MHC-II, são principalmente de origem pré-natal. Os macrófagos funções chave como reparo4 e remoção de detritos5 durante lesão ou suportando conectividade elétrica6 em estado estacionário. Durante diferentes formas de inflamação ocorrer um afluxo importante de Ly6COi MHC-IIEis CD64int monócitos, que mais tarde se diferenciar em Ly6COi CCR2+ macrófagos2,7 . Uma população significativamente menor, mas importante, de células que residem no miocárdio de indivíduos saudáveis é composta de células dendríticas8,9. Recentemente foram caracterizados os dois subconjuntos principais de DCs convencionais cardíacas (conjuntos): cDC1 (CD103+ DCs) e cDC2 (CD11b+ DCs). DCs desempenham um papel importante na defesa contra infecção8 mas também podem promover a auto-lesão durante a inflamação, particularmente durante o infarto do miocárdio9.
Aqui, descrevemos um método simples para o isolamento das células imunes cardíacas viáveis de miocárdio de rato. O método combina digestão enzimática e mecânica com uma filtração de célula-filtro para obter uma suspensão de célula única que pode ser analisada, ou ainda mais purificada, pela classificação de citometria de fluxo ou enriquecimento magnética do grânulo. Medições precisas de células do miocárdio extravascular necessitam de perfusão cardíaca para remover possíveis contaminantes da corrente sanguínea da microvasculatura cardíaca. Além disso, apresentamos um passo opcional de rotulagem intravascular de células do sistema imunológico que podem ser usadas para diferenciar ainda mais as células do miocárdio de contaminantes intravasculares, com base no protocolo et al Galkina10. Finalmente, apresentamos uma análise de citometria de fluxo básico para identificar as principais subpopulações de macrófagos e cDC.

<table><tbody><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Wisent</td><td>311-010-CL</td><td>1x PBS</td></tr><tr><td>21 G x 1 1/2 (0,8 mm x 40 mm) Agulha PrecisionGlide</td><td>BD</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s Solução salina balanceada</td><td>Wisent</td><td>311-511-CL</td><td>1x HBSS</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503-50G</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino</td><td>Sigma</td><td>B9433</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M Ácido etilenodiaminotetracético</td><td>BioShop</td><td>EDT111</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de vácuo, 0.2 &micro; m Seringa de insulina Filtropur V50</td><td>Sarstedt</td><td>83.1823.001</td><td></td></tr><tr><td>28 G 1/2 1 cc</td><td>BD</td><td>329424</td><td></td></tr><tr><td>seringa de 60 mL</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>Meio Eagle Modificado de Dulbecco</td><td>Wisent</td><td>319-005-CL</td><td>1x DMEM com 4,5 g/L de glicose e L-Glutamina e Piruvato</td></tr><tr><td>de Sódio Colagenase I</td><td>Sigma</td><td>C0130</td><td>de Clostridium histolyticum</td></tr><tr><td>Hialuronidase tipo I-S</td><td>Sigma</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>DNase-I</td><td>Sigma</td><td>D4513</td><td>de pâncreas bovino</td></tr><tr><td>Filtro de células, 40 &micro; m Nylon</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de lise de cloreto de amônio - potássio (ACK)</td><td>Lonza</td><td>10-546E</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700 anti-camundongo / humano CD11b</td><td>Biolegend</td><td>101222</td><td>diluição 1:250</td></tr><tr><td>APC / Cy7 anti-mouse Ly-6c</td><td>Biolegend</td><td>128025</td><td>diluição 1:250</td></tr><tr><td>APC anti-mouse CD103</td><td>Biolegend</td><td>121414</td><td>diluição 1:250</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 anti-rato CD11c</td><td>Biolegend</td><td>117334</td><td>1:250 diluição</td></tr><tr><td>PE anti-rato Ly-6G</td><td>Biolegend</td><td>127607</td><td>1:250 diluição</td></tr><tr><td>Pacific Blue anti-rato I-Ab</td><td>Biolegend</td><td>116422</td><td>diluição 1:250</td></tr><tr><td>FITC anti-rato CD64 (FcgRI)</td><td>Biolegend</td><td>139315</td><td>1:250 diluição</td></tr><tr><td>PE/Cy7 anti-rato CD45</td><td>Biolegend</td><td>103113</td><td>diluição 1:250</td></tr><tr><td>PerCP/Cy5.5 anti-rato CD45</td><td>Biolegend</td><td>103132</td><td>diluição 1:40</td></tr><tr><td>TruStain fcX (anti-rato CD16/32)</td><td>Biolegend</td><td>101320</td><td>diluição 1:100</td></tr><tr><td>True-Stain Bloqueador de monócitos</td><td>Biolegend</td><td>426101</td><td>diluição 1:20</td></tr><tr><td>FlowJo V10</td><td>TreeStar Inc</td><td></td><td>https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</td></tr><tr><td>Mouse: Batf3-/-</td><td>O Laboratório Jackson</td><td>JAX: 013755</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e identificação de células do sistema imunológico extravascular do coração

Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart

O sistema imunológico é um componente essencial de um coração saudável. O miocárdio é lar de uma população rica de subconjuntos de células imunes diferentes com compartimentalização funcional tanto durante o estado estacionário e diferentes formas de inflamação. Até recentemente, o estudo de células do sistema imunológico no coração exigido o uso da microscopia ou protocolos de digestão mal desenvolvidos, que forneceu suficiente sensibilidade durante inflamação grave, mas com confiança não foram capazes de identificam pequenas — mas chave — populações de células durante o estado estacionário. Aqui, vamos discutir um método simples que combina enzimática (colagenase, hialuronidase e DNAse) e digestão mecânica de corações murino precedidas pela administração intravascular de fluorescente etiquetado anticorpos para diferenciar pequenas mas inevitável contaminantes de célula intravascular. Este método gera uma suspensão de células viáveis isoladas que podem ser analisados por citometria de fluxo para identificação, fenotipagem e quantificação, ou ainda mais purificado com fluorescência-ativado da pilha classificação ou separação magnética do grânulo para estudos de análise ou em vitro transcricionais. Nós incluímos um exemplo de uma análise de cytometric do fluxo passo a passo para diferenciar o macrófago chave e populações de células dendríticas do coração. Para uma experiência de tamanho média (10 corações) a conclusão do procedimento requer 2 a 3 h.

Até à data, nenhum bom método foi projetado para isolar as células imunes de outros componentes da célula cardíaca, tais como cardiomyocytes. Portanto, análise da suspensão por citometria de fluxo cardíaco única célula requer um pre-gating com CD45 para identificar as populações de células imunes, seguidas por uma única célula e tamanho pequeno exclusão associada (Figura 1A). Alternativamente, uma coloração de viabilidade pode ser realizada p...

Este protocolo apresenta um método simples e eficiente de isolar, identificar e quantificar as células imunes que residem no miocárdio de ratos durante o estado estacionário ou inflamação. O protocolo combina digestão enzimática e mecânica para a geração de uma suspensão de célula única que pode ser mais analisada por citometria de fluxo.

Isolamento e identificação de células do sistema imunológico Extravascular do coração

The immune system is an essential component of a healthy heart. The myocardium is home to a rich population of different immune cell subsets with ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre a composição dos subconjuntos de células imunes no coração, tanto durante estados estacionários quanto de doença. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser usada para imunofenotipagem precisa de populações de células imunes cardíacas, incluindo subconjuntos muito raros. Este protocolo é relativamente simples.No entanto, as injeções nas veias da cauda podem ser difíceis, por isso é importante praticar essa técnica até que você se sinta confortável antes de usar animais experimentais. Para rotular os leucócitos circulantes, carregue 200 microlitros de anticorpo anti-CD45 conjugado com fluoróforo de camundongo recém-preparado em PBS em uma seringa de insulina de calibre 28,5 e pré-aqueça oito camundongos de 12 semanas em um cobertor de água circulante ajustado para 35 a 41 graus Celsius por cinco a dez minutos. Quando a veia da cauda estiver dilatada, prenda o primeiro animal na posição esternal em um dispositivo de contenção apropriado.Se as veias da cauda não estiverem suficientemente dilatadas, mergulhe a cauda em água a 36 a 40 graus Celsius por um a dois minutos. Quando as veias da cauda estiverem prontas, es

isolation-identification-extravascular-immune-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este método para isolar células do sistema imunológico funcional do coração fornece uma alternativa aos métodos convencionais de digestão da colagenase, que causa a ativação de células imunes indesejadas, resultando em uma capacidade de resposta diminuiu dessas células. Nosso método de isolamento de rendimentos funcional cardíaca células do sistema imunológico, evitando os problemas associados com a digestão enzimática.

Isolamento de células do sistema imunológico funcional cardíaca

O protocolo para detectar células auto-reactivas T CD4 no cérebro e no coração por coloração direta com complexo de histocompatibilidade principal dextramers classe II foi descrito neste relatório. Para análise detalhada, um método confiável para enumerar as freqüências de células T CD4 + antígeno-específicas in situ também é concebido.

A detecção in situ de células T CD4 autoreactive em Cérebro e Coração Usando principal de histocompatibilidade Dextramers classe II

tecido cardíaco humano abriga populações de células precursoras perivasculares multipotentes que podem ser adequados para a regeneração do miocárdio. A técnica aqui descrita permite o isolamento e purificação simultânea de duas populações de células estromais multipotentes associados com os vasos nativos de sangue, ie CD146 + CD34 - pericitos e células CD34 + CD146 - células adventícias, a partir do miocárdio humano.

Isolamento de perivascular Multipotentes populações de células precursoras a partir de tecido cardíaco humano

Neste artigo, é fornecido um método para isolar cardíacas células estromais mesenquimais de endomiocárdica bioptic amostras de pacientes de cardiomiopatia arrhythmogenic. Sua caracterização e o protocolo para impulsionar sua diferenciação de adipogenic são descritos.

Isolamento e caracterização de cardíacas células estromais mesenquimais de endomiocárdica Bioptic amostras de pacientes Arrhythmogenic cardiomiopatia

Apresentado aqui é um protocolo para isolar vários subconjuntos de macrófagos e outras células não imunes do miocátrio humano e do rato, preparando uma única suspensão celular através da digestão enzimática. Também são apresentados esquemas de gating para identificação baseada em citometria de fluxo e caracterização de macrófagos isolados.

Isolamento de subconjuntos de macrófagos e células estromais de espécimes miocárdios humanos e de camundongos

O objetivo deste trabalho é desenvolver um método para isolar os cardiomiócitos do coração adulto e medir o conteúdo e a nucleação do DNA.

Isolamento de Cardiomiócitos de Corações Fixos para Imunocitoquímica e Análise ploidy

Apresentamos um protocolo para o isolamento de células endocárdicas e coronárias de corações de ratos através da digestão sequencial de tecidos em um tampão de digestão, coleta celular de ciclos de centrífuga recorrentes e purificação celular usando microesferas CD31 anti-ratos.

Isolamento das Células Endocárdicas e Coronárias da Parede Livre Ventricular do Coração de Rato

O protocolo aqui apresentado fornece uma abordagem passo-a-passo para o isolamento de macrófagos residentes cardíacos da região do nó sinoatrial (SAN) e do nó atrioventricular (AVN) de corações de camundongos.

Isolamento e Cultura de Macrófagos Cardíacos Residentes do Nó Sinoatrial e Atrioventricular Murino

Relatamos aqui um protocolo para a quantificação e diferenciação de linfócitos B miocárdicos com base em sua localização no espaço intravascular ou endotelial utilizando citometria de fluxo.

Quantificação e Análise Baseada em Citometria de Fluxo de Células B do Miocárdio

Este protocolo demonstra isolamento guiado por microscopia e coloração por imunofluorescência de veias pulmonares murinas. Preparamos amostras de tecido contendo o átrio esquerdo, veias pulmonares e pulmões correspondentes e as coramos para troponina cardíaca T e Conexina 43.

Microdissecção e Coloração por Imunofluorescência de Mangas Miocárdicas em Veias Pulmonares Murinas

Este estudo estabeleceu um método estável e eficiente para o isolamento, cultura e determinação funcional de células-tronco CD34+ residentes na parede vascular (CD34+ VW-SCs). Este método de isolamento fácil de seguir e eficaz em termos de tempo pode ser utilizado por outros investigadores para estudar os mecanismos potenciais envolvidos nas doenças cardiovasculares.

Isolamento imunomagnético das células-tronco CD34+ residentes na parede vascular de camundongos

Aprenda a isolar e identificar células imunes do miocárdio murino usando digestão enzimática e citometria de fluxo. Este método permite quantificar subpopulações raras em estados de repouso e inflamação.

Isolamento e identificação de células do sistema imunológico Extravascular do coração

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