Name: Tratamento orientado e seletivo de Teratomas células-tronco derivadas de pluripotentes usando radiação de feixe externo em um modelo animal de pequeno (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 8 s
Description: Aprenda a tratar teratomas derivados de células-tronco pluripotentes com radioterapia de feixe externo em camundongos. Este método permite direcionar tumores seletivamente enquanto minimiza danos aos tecidos circundantes.

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Os autores gostaria de agradecer o nacional institutos de saúde R01 HL134830 (PKN), K08 HL135343 (KS) e 5F32HL134221 (JWR); Howard Hughes Medical Institute (ASL); e o Instituto Cardiovascular de Stanford (ASL) pelo seu apoio.

Este experimento animal foi aprovado e executado sob o Conselho de revisão institucional e o painel administrativo no cuidado de Animal de laboratório na Universidade de Stanford.
1. células cultura de iPSCs
<ol><li>Cresce humano iPSCs derivado pela reprogramação Lentivirus em placas 6-poço revestidas com membrana basal matriz (por exemplo, matrigel, conhecido como matriz aqui).</li>
	<li>Mudar diariamente os meios das iPSCs com meio de cultura enriquecido (ver Tabela de materiais) incubar a 37 ° C e 5% de CO2.</li>
	<li>Uma vez que as células alcança a confluência de 80-90% (aproximadamente a cada 4 dias), adicionar 1 mL da enzima recombinante célula-dissociação (ver Tabela de materiais) por bem e incubar a 37 ° C por 5 min.</li>
	<li>Depois de 5 min, dissociar as células do poço por pipetagem, transferi-los para um tubo de 15 mL e centrifugar a 300 x g.</li>
	<li>Após a centrifugação, aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em meio de cultura enriquecido (ver Tabela de materiais) enriquecido com inibidor de Y27632 a uma diluição de 1:1,000.</li>
	<li>Realizar uma contagem de células de células dissociadas e replate as células na matriz-revestido de placas de 6-poços em uma densidade de 2 x 105 a 4 x 105.</li>
</ol>2. transdução de iPSCs com um Gene repórter do duplo-fusão
<ol><li>Passagem iPSCs em placas de 6-bem como por rotina e adicionar o meio de cultura enriquecido (ver Tabela de materiais) contendo brometo da hexadimethrine de 6 µ g/mL. Nota: O tamanho ideal da colônia é 200-400 células/colônia para produzir a mais alta eficiência de transdução.</li>
	<li>Concentre-se self inactivar lentivirus carregando vagalume luciferase e verde fluorescente da proteína (FLuc-eGFP) conduzida pelo promotor da ubiquitina humana-C por centrifugação do sedimento com um rotor de SW-29 a 50.000 x g durante 2 h a 4 ° C.</li>
	<li>Adicione o concentrado viral para as iPSCs em uma placa de 6 em uma multiplicidade de infecção (MOI), de 10 e incubar durante uma noite a 37 ° C em 5% CO2. Nota: A multiplicidade de infecção foi determinada pela expressão da proteína monomérica fluorescência analisada por uma célula de fluorescência-ativado classificação varredura (FACS).</li>
	<li>No dia seguinte, remova o vírus por centrifugação das placas iPSC 6-poços em 300 x g durante 6 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Mudar a mídia diariamente com meio de cultura enriquecido (ver Tabela de materiais) e passagem conforme protocolo. Utilize um microscópio de fluorescência para determinar a eficiência de transdução aproximada para eGFP.</li>
	<li>Uma eficiência de 30 – 40% é suficiente para a classificação de FACS. Prossiga para o FACS de hiPSCs expressando eGFP, se pelo menos 30-40% das células express eGFP.</li>
	<li>Para confirmar a FLuc atividade ex vivo, as células expressando GFP classificado por FACS com uma densidade de 5.000 células por poço da placa.</li>
	<li>Incube as celulas transduzidas e não transfectadas células (que servirão como o controlo negativo) com o repórter de bioluminescência sonda D-luciferina (100 μmol/L) para 6 h. medir a bioluminescência com um spectrofluorometer de microplacas.</li>
</ol>3. transplante de EPS no flanco Dorsal para formação de Teratoma em camundongos imunodeficientes
<ol><li>Adicione 1 mL da mistura de enzima recombinante célula-dissociação por 6 placa contendo iPSCs humana transfectadas com um gene repórter duplo-fusão (FLuc-GFP) na cultura (ver secção 2) e incube por 5 min.</li>
	<li>Após o período de incubação, disperse as células por aspiração de pipeta e expressão. Adicione igual volume de meio de cultura e centrifugar a 250 x g durante 4 min.</li>
	<li>Após centrifugação, aspirar o sobrenadante, Ressuspender as células em 30 µ l de matriz e colocá-lo em gelo para preservar sua viabilidade antes da injeção. Confirme uma colheita de 1 x 106 células usando um hemocytometer.</li>
	<li>Se utilizando células de fusão dupla repórter-gene-transfectadas, suspenda as células de FACS duplo-positivo (da seção 2) em 30 µ l de matriz.</li>
	<li>Induzir anestesia na semana de 8-10 modelo camundongos usando 2% isoflurance com oxigênio de 1L/min e em seguida use manutenção 2% de isoflurano com 1L/min de oxigênio.</li>
	<li>Utilizando uma seringa de 28,5 G, injetar a mistura de célula/matriz (veja a Tabela de materiais) suspensão no espaço subcutâneo no flanco, apontando para uma injeção de no total de 5 x 103 a 5 x 106 células (aproximadamente 100 ul por injecção).</li>
	<li>Considere uma injecção mais caudal se tenciona manter ratos por período prolongado e antecipando o crescimento do tumor grande.</li>
	<li>São permitidos animais anestesiados para recuperar em uma almofada aquecida até ambulatório (tipicamente < 1h) com acompanhamento da frequência respiratória, de pele cor de dedos até ambulatório.</li>
</ol>4. a bioluminescência de imagem (BLI) das células transplantadas para avaliar a célula de sobrevivência e crescimento de Teratoma
<ol><li>Os desejado momentos após a inoculação, realize uma injeção intraperitoneal de (IP) de 375 mg/kg da sonda repórter D-luciferina em ratos.</li>
	<li>10 min após a injeção do IP, imagem a bioluminescência sinal nos animais anestesiados (interpretados como descrito no passo 3.5) por 30 min usando windows de aquisição 1 min em intervalos de 5 min. Nota: Aquisições de imagem semanal são recomendadas. Anestesia é mantida durante a imagem latente entregando inalado isoflurano através de um cone de nariz.</li>
	<li>Para análise de dados, desenhar uma região de interesse (ROI) sobre o sinal BLI e, em seguida, normalizar para o tempo de aquisição para quantificar as emissões em unidades de máximos fótons por segundo por centímetro quadrado por esterradiano (/sr fótons/s/cm2).</li>
</ol>5. teratoma irradiação usando uma difusora pré-clínicos guiada por imagem (Figura 1)
<ol><li>Anestesia um rato em uma caixa "knockdown" usando 2% de isoflurano em 100% de oxigênio em uma taxa de fluxo de 1 L/min. Depois que o mouse é totalmente anestesiado, transferi-lo para a cama de um irradiador de pré-clínicos guiada por imagem (consulte a Tabela de materiais). Manter a anestesia por 2% de isoflurano continuamente através de um cone de nariz.</li>
	<li>Adquirir imagens de micro-CT como um conjunto de 400 imagens de projeção superior a 360° usando um 40 kVp, feixe de raio-x 2 mA e reconstruir aqueles em imagens volumétricas, com um tamanho de pixel isotrópico de 0,2 mm.</li>
	<li>Planejar um tratamento de radiação usando as micro-CT imagens usando o pacote de software de RT_Image (http://rtimage.sourceforge.net/) e realizar o tratamento. Nota: O plano de tratamento utilizado consiste de feixes de raios-x dois 225 kVp, orientados para passar o teratoma alvo superficial enquanto contornando a superfície do resto do rato e poupando as vísceras subjacentes. Os tempos de exposição para as vigas são ajustados com base em dados trimestrais de calibração do sistema para que a dose no centro do tumor alvo foi de 6 Gy.</li>
	<li>Repita o processo de tratamento em três dias consecutivos para entregar um total de 18 Gy-o tumor do alvo.</li>
	<li>Manter o padrão pós-tratamento, cuidar dos animais.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Dados pré-clínicos e casos anedóticos de vítimas do "turismo de células-tronco" confirmam que o risco de desenvolver os teratomas é uma desvantagem grave associada com tratamentos de PSC23. Desenvolvimento de abordagens de cuidado para prevenir e tratar o risco neoplásico associado com terapias de células-tronco é, portanto, um passo importante para facilitar a tradução clínica de terapias regenerativas célula-tronco. Neste artigo, nós descrito um método de direcionamento terapêutico de teratomas ...

O desenvolvimento de terapias de células-tronco para regeneração de tecidos encontrou uma série de barreiras nas últimas décadas, prejudicando os esforços para a implantação eficiente de clínica. Estes obstáculos incluem retenção de célula pobre nos locais de entrega, imunogenicidade de células-tronco e o potencial neoplásico como forma os teratomas1. Tumorigenicidade é de particular preocupação clínica, como isso pode prejudicar de destinatários de transplante de células-tronco2. Contas de formação de tumor devido às injeções de células-tronco não regulamentada já foram relatadas em vários ambientes clínicos3,4,5. O potencial para formação de teratoma é mais frequentemente citada clínica preocupação no desenvolvimento de (PSC) células-tronco pluripotentes e provocou atrasos e cancelamentos de alto perfil Múltiplo células-tronco embrionárias (ESC) e induzida por células-tronco pluripotentes (iPSC) ensaios6,7,8,9. Assim, há uma necessidade premente de uma investigação translacional dedicada para fornecer o tratamento adequado, estes tumores iatrogênicas surgirem.
Até à data, a maioria das estratégias para controlar o mau comportamento de células-tronco têm-se centrado na redução do número de EPS com2,de potencial tumorigénico10. Infelizmente, apenas um pequeno número de células residuais (ex.., 1 x 104 a 1 x 105 células11) é necessário para formação de teratoma, que é muito abaixo do limite de detecção citada por ensaios disponíveis atualmente12, 13. outras limitações de usar esses métodos recipiente incluem baixa eficiência e alta despesa, dependência de suspensões de célula única que podem não ser adequados para novas abordagens de engenharia de tecidos e o prejuízo potencial de célula sobrevivência e enxertia.
Poucos estudos abordaram-se as opções de tratamento, seguindo-se formação de teratoma. Talvez a estratégia mais bem estudada é a incorporação de genes de "suicídio" de células-tronco de14,15. Este método envolve manipular geneticamente as células-tronco para incorporar um gene de apoptose-ativando inducible que pode ser ativado por postinjection estimulação farmacológica, proporcionando uma abordagem de resgate, se as células injetadas produzem os teratomas. Esta abordagem, no entanto, sofre de desvantagens significativas, incluindo efeitos fora do alvo de modificações genéticas do EPS e o potencial para um desenvolvimento gradual da resistência de droga16. Uma abordagem semelhante utiliza pequenas moléculas para induzir a morte celular seletiva das EPS através da inibição de anti-apoptotic vias17. Outros grupos têm como alvo a morte celular das EPS usando anticorpos contra pluripotência marcadores de superfície, tais como podocalyxin, como proteína-1 (PODXL)18. O timing da pequeno-molécula ou anticorpo entrega significa ter um impacto significativo sobre o potencial terapêutico das EPS se entregue muito cedo e podem não ter efeito terapêutico se entregue muito tarde. Além disso, não foram estudados os efeitos sistêmicos de pequenas moléculas e anticorpos utilizados desta forma.
Uma abordagem alternativa para o tratamento destes tumores baseia-se sobre o uso de terapia de radiação de feixe externo (RT). RT é uma das principais modalidades atualmente empregadas no tratamento de tumores sólidos19. Inovações em RT, incluindo o desenvolvimento do feixe de próton e radiocirurgia estereotáxica, permitiram a segmentação avançada de estruturas patológicas, evitando danos ao tecido normal, tornando RT conformal ideal para abordar o teratoma formação em estruturas anatomicamente sensível20. Além disso, este método evita a manipulação genética ou transdução viral de células-tronco, que são ambos repleta de clínicos adicionais de segurança e eficácia diz respeito a15. Finalmente, os avanços na micro-irradiators permitiram a aplicação da RT em roedores21.
Neste artigo, demonstramos como criar um modelo pequeno-animal de formação teratoma injetando iPSCs humano em ratos. Então mostramos como aplicar RT para seletivamente erradicar estes tumores in vivo com danos mínimos ao tecido circundante. Essa abordagem fornece uma terapia-alvo para os teratomas PSC-derivado, evitando os efeitos fora do alvo da entrega sistêmica de moléculas biológicas e peptídeos e a manipulação genética, o EPS. Para fins experimentais, oferecemos um passo opcional para transduce células-tronco com genes repórter para controlar a resposta do tumor à radioterapia através de bioluminescência (BLI) de imagem.

<table><tbody><tr><td>Linha de Controle de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas</td> Universidade de <td>Stanford</td><td>Nguyen Lab</td><td>Cultura de células de matriz de membrana basal de matrigel Corning iPSC</td></tr><tr><td>354234</td><td>Fisher Scientific</td><td>CB-40234</td><td>Cultura de células de meio de cultura iPSC</td></tr><tr><td>Essential 8</td><td>ATCC-The global bioresource center</td><td>30-2203</td><td>Cultura de células de iPSC</td></tr><tr><td>Tryple E</td><td>Gibco</td><td>12605-036</td><td>Cultura de células do inibidor 2 HCL do iPSC</td></tr><tr><td>Y27632 (inibidor de ROCK)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S104950MG</td><td>Cultura de células de iPSC</td></tr><tr><td>Lentivirus</td><td>Cyagen</td><td>P170721-1001cjn</td><td>Transdução de iPSC com gene repórter de dupla fusão</td></tr><tr><td>Reagente de infecção/transfecção de Polyrbrene</td><td>Millipore Sigma</td><td>TR-1003-G</td><td>Transdução de iPSC com gene</td></tr> <tr><td>repórter de dupla fusãoGene repórter Fluc-eGFP impulsionado pelo promotor da ubiquitina</td><td></td><td>Laboratório Sam Gambhir</td><td>da Universidade de Stanford Transdução de iPSC com gene repórter de dupla fusão</td></tr><tr><td>D-luciferina</td><td>Perkin Elmer</td><td>122799</td><td>Transdução de iPSC com gene repórter de fusão dupla e</td></tr><tr><td>citômetro de fluxo BLI (BD FACSARIA III)</td> <td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>FACSAria</td><td>Transdução de iPSC com espectrofluorômetro de microplaca de gene repórter de dupla fusão</td></tr><tr><td>(Glomax Navigator System)</td><td>Promega Bio Systems, Sunnyvale, CA</td><td>GM2000</td><td>Transdução de iPSC com gene repórter de dupla fusão</td></tr><tr><td>Xenogen IVIS 200&nbsp;</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td>BLI</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>irradiação CDS019936</td><td>irradiador</td></tr><tr><td>X-Rad SmART guiado por imagem&nbsp;</td><td>Precision X-ray Inc., North Branford, CT</td> Pacote de software de <td>RT_Image de irradiação</td><td>X-Rad SmART</td></tr><tr><td></td><td>Universidade de Stanford (http://rtimage.sourceforge.net/)</td><td>RT_Image v0.2&beta;</td><td>irradiação</td></tr></tbody></table>

tratamento orientado e seletivo de teratomas células-tronco derivadas de pluripotentes usando radiação de feixe externo em um modelo animal de pequeno

Targeted and Selective Treatment of Pluripotent Stem Cell-derived Teratomas Using External Beam Radiation in a Small-animal Model

O crescente número de vítimas do "turismo de células-tronco," o não regulamentado transplante de células-tronco em todo o mundo, levantou preocupações sobre a segurança do transplante de células-tronco. Embora o transplante de diferenciados ao invés de células indiferenciadas é prática comum, os teratomas ainda podem decorrer da presença de células-tronco indiferenciadas residuais no momento do transplante ou de mutações espontâneas em diferenciados células. Porque muitas vezes, terapias de células-tronco são entregues em locais sensíveis anatomicamente, mesmo pequenos tumores podem ser clinicamente devastadoras, resultando em cegueira, paralisia, anormalidades cognitivas e disfunção cardiovascular. Acesso cirúrgico a esses sites também pode ser limitado, deixando os pacientes com poucas opções terapêuticas. Controlar o mau comportamento de células-tronco é, portanto, fundamental para a tradução clínica de terapia de células-tronco.
Radiação de feixe externo oferece um meio eficaz de fornecer terapia-alvo para diminuir a carga de teratoma, minimizando lesões ao redor de órgãos. Além disso, este método evita a manipulação genética ou transdução viral de células-tronco, que estão associados com preocupações de eficácia e segurança clínica adicional. Aqui, descrevemos um protocolo para criar os teratomas de células-tronco derivadas de pluripotentes em camundongos e aplicar radioterapia de feixe externo para ablate seletivamente estes tumores in vivo.

Os ratos injetados normalmente irão demonstrar formação de crescimento teratoma após 4-8 semanas, como confirmado pela BLI de imagem (Figura 2). Tumores vão encolher drasticamente quando irradiados com uma dose acumulada de 18 Gy deu um mês após a entrega do celular, resultando em uma diminuição significativa no sinal do luciferase (Figura 2). Importante, retirados do site irradiado 5mm de tecidos normais não parecem ter qualquer...

Pesquisa sobre estratégias de tratamento para os teratomas de células-tronco derivadas de pluripotentes é importante para a tradução clínica de terapia de células-tronco. Aqui, descrevemos um protocolo para, em primeiro lugar, gerar células-tronco derivadas os teratomas em camundongos e, depois, para seletivamente alvo e tratar estes tumores in vivo usando uma difusora de pequenos animais.

Tratamento orientado e seletivo de Teratomas células-tronco derivadas de pluripotentes usando radiação de feixe externo em um modelo animal de pequeno

The growing number of victims of &#34;stem cell tourism,&#34; the unregulated transplantation of stem cells worldwide, has raised concerns about the ...

O objetivo geral deste procedimento é atingir seletivamente teratomas derivados de células-tronco em camundongos para avaliação da eficácia in vivo da radioterapia de feixe externo de pequenos animais. A principal vantagem da terapia de feixe de radiação externa é que é uma terapia direcionada para teramtomas associadas a células-tronco que evita os efeitos adversos fora dos alvos de terapias sistematicamente entregues. Os avanços na radioterapia de feixe externo permitiram o direcionamento específico de pequenos teratomas, evitando danos aos tecidos normais, tornando esta terapia ideal para o tratamento de teratomas sensíveis à radiação.Esse método pode não apenas fornecer insights sobre a otimização de estratégias para terapias celulares, como também tem o potencial de se tornar clinicamente aplicável em terapias humanas. Comece tomando uma placa de seis poços contendo iPSCs. Induzir a formação de tetratoma em animais imunodeficientes adicione um mililitro de mistura de enzimas de dissociação celular recombinante por poço da placa de 6 poços contendo células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem transduzidas com um gene repórter de fusão dupla para uma incubação de cinco minu

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As células pluripotentes humanas estaminais (hPSCs) têm o potencial para tratar uma miríade de diferentes doenças. A utilidade destas células reside no facto de que eles podem diferenciar-se em qualquer tipo de célula no corpo. Descrevemos aqui o ensaio teratoma, que é usado para demonstrar a pluripotência das hPSCs.

Geração Teratoma na Cápsula do Testículo

O objetivo deste artigo é descrever o uso de um modelo de glioblastoma ortotópico para estudos quimioradioterapia. Este artigo irá passar por transformação celular, implantação, e radioterapia do mouse através de um modelo intracraniana.

Radioterapia em uma combinação ortotópico modelo de tumor de cérebro de camundongos

Este vídeo descreve a técnica de radioimunoterapia pré-direcionada ou PRIT, na qual imunoconjugados seguidos de radioligantes são administrados para o tratamento de tumores. Esta radioimunoterapia reduz as doses de radiação para tecidos saudáveis e utiliza radionuclídeos com meias-vidas muito baixas, incompatíveis com vetores baseados em anticorpos.

Radioimunoterapia pré-direcionada: um método para entrega direcionada de radionuclídeos terapêuticos a tumores

Nós desenvolvemos novas nanovesículas multifuncionais intrínsecas chamados porphysomes, que têm dependentes de estrutura fluorescência auto-têmpera e propriedades fototérmicos únicas, assim funcionando agentes terapia fototérmica como potentes. Formulamos porphysomes utilizando extrusão de alta pressão e investigou sua eficácia terapia fototérmica em um modelo de tumor xenoenxerto.

One Minute, Sub-One-Watt Photothermal ablação tumoral Usando Porphysomes, Intrínseca Multifuncional nanovesículas

A técnica criada para inocular xenografts ortotópico de câncer de bexiga invasivo primário requer laparotomia e mobilização da bexiga. Este procedimento inflige morbidade significativa nos ratinhos, é tecnicamente difícil e demorado. Por isso, desenvolvemos um de alta precisão, a abordagem percutânea utilizando a orientação do ultra-som.

Minimamente Invasiva Estabelecimento de murino ortotópico bexiga Xenoenxertos

As células estaminais são portadores terapêuticos promissores para tratar tumores cerebrais devido ao seu tropismo intrínseco de tumor. A entrega de células estaminais intranasais não invasivas ultrapassa a barreira hematoencefálica e demonstra um forte potencial de tradução clínica. Este artigo resume os princípios básicos da administração de células estaminais intranasais em um modelo de glioma de mouse.

Entrega intranasal de células-tronco terapêuticas para Glioblastoma em um modelo de mouse

No passado, pequena animal irradiação geralmente foi realizada sem a capacidade de direcionar um volume de tumor bem delineados. O objetivo era imitar o tratamento do glioblastoma humano em ratos. Utilizando uma plataforma de irradiação de animais pequenos, realizamos guiada por MRI irradiação conformal 3D com secundário-volume baseados em PET impulsionando em um ajuste pré-clínicos.

PET e MRI guiada irradiação de um modelo do rato de Glioblastoma usando um Microdifusora

Aqui, apresentamos um protocolo utilizar injeção guiada por ultra-som de neuroblastoma (NB) e células (ES) de sarcoma de Ewing (estabeleceu linhas celulares e células tumorais do paciente-derivado) biologicamente relevantes locais para criar modelos pré-clínicos confiáveis para câncer pesquisa.

Utilização do ultra-som guiado implantação celular tecido-dirigido para o estabelecimento de Xenografts biologicamente relevantes Tumor metastático

Aqui apresentamos um protocolo para realizar radioterapia baseada em tomografias pré-pêtrons em um modelo de glioblastoma de ratos usando algoritmos desenvolvidos internamente para otimizar a precisão e eficiência.

Positron Emission Tomography-based Dose Radiation Therapy em um modelo de rato glioblastoma usando a plataforma de pesquisa de radiação animal de pequeno porte

O glioblastoma é uma forma devastadora de câncer cerebral primário, e a terapia térmica intersticial a laser está emergindo como uma alternativa promissora à ressecção cirúrgica convencional para glioblastoma inoperável. Este protocolo descreve um modelo de camundongo pré-clínico otimizado que pode ser usado para estudar os efeitos do tratamento ou tratamentos adjuvantes e combinatórios.

Um modelo murino imunocompetente para terapia térmica intersticial a laser de glioblastoma

Aprenda a tratar teratomas derivados de células-tronco pluripotentes com radioterapia de feixe externo em camundongos. Este método permite direcionar tumores seletivamente enquanto minimiza danos aos tecidos circundantes.

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Tratamento orientado e seletivo de Teratomas células-tronco derivadas de pluripotentes usando radiação de feixe externo em um modelo animal de pequeno

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