Decellularization do coração humana dentro de uma bolsa pressurizada em uma orientação invertida
26 de novembro de 2018
Esse método permite a decellularization de um órgão complexo sólido usando um protocolo simples baseado em choque osmotic e perfusão de detergente iônico com o mínimo de órgão matriz de interrupção. É composto por uma técnica de novela decellularization para corações humanos dentro uma bolsa pressurizada com monitoramento em tempo real da saída de detritos de celular e dinâmica de fluxo.
Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre a geração de andaimes vascularizados, que são realmente o Santo Graal do campo de engenharia de tecidos. A principal vantagem dessa técnica é que uma bolsa pressurizada em uma orientação invertida melhora a descelularização de órgãos humanos não transplantáveis e nos permite fazer isso de forma estéril durante um período de tempo adequado. Para preparar o coração para a descelularização, primeiro realize uma inspeção interna para possíveis defeitos.
Se houver um defeito septo, corrija o defeito com as suturas apropriadas. Em seguida, liga as veias superiores e inferiores com sutura de seda 2-0. Suture a parede do átrio direito com 5-0 PROLENE, e disseque a aorta longe da artéria pulmonar principal para a cannulação subsequente.
Insira os conectores, de acordo com o diâmetro do vaso, na aorta e na artéria pulmonar, e fixe os conectores com suturas de seda 2-0. Usando um dos orifícios da veia pulmonar, insira uma linha de tubos através do átrio esquerdo em direção ao ventrículo esquerdo, e conecte uma linha de infusão ao conector na aorta e uma linha de saída ao conector na artéria pulmonar. Coloque o coração preparado em uma bolsa de poliéster na orientação invertida e coloque a bolsa em um recipiente de perfusão.
Conecte cada uma das linhas às respectivas portas na rolha de borracha, de acordo com o diâmetro do recipiente, e insira a rolha na tampa do recipiente de perfusão para selar a bolsa de poliéster. Em seguida, perfume PBS através da porta de infusão da rolha de borracha para verificar o fluxo da artéria pulmonar e da linha inserida no ventrículo esquerdo, utilizando este fluxo para limpar o órgão de quaisquer vestígios residuais de sangue dentro da vasculatura. Quando o coração estiver pronto, coloque o bioreator montado em uma orientação vertical e conecte a linha de infusão, linha de cabeça de pressão, linha de saída da artéria pulmonar e linha de drenagem bioreatorial para as portas da superfície da tampa de borracha em cima do bioreator de perfusão.
Em seguida, descelularizar o coração por quatro horas com solução hipertônica, duas horas com solução hipotônica, 120 horas com sulfato de dodecyl de sódio, ou SDS, e uma lavagem final com 120 litros de PBS, tudo sob constantes 120 milímetros de pressão de mercúrio medida na raiz aórtica. Durante os últimos 10 litros da lavagem PBS, adicione 500 mililitros de solução de ácido peracético estéril de 2,1% neutralizada com 10 hidróxido de sódio normal à solução de perfusão para esterilizar o andaime. Normalmente, a taxa de fluxo para a aorta durante o processo de descelularização diminui gradualmente à medida que a solução de perfusão muda de hipertônico para hipotônico.
Em contraste, a taxa de fluxo aumenta quando a solução de perfusão é alterada de uma solução hipotônica para SDS, momento em que a taxa de fluxo de infusão demonstra flutuações. A taxa de saída da artéria pulmonar demonstra uma tendência semelhante com as soluções hiper e hipotônicas. No entanto, a taxa de saída durante a perfusão do SDS apresenta uma redução geral.
A eficiência da perfusão coronária também diminui com o tempo à medida que os diferentes reagentes são perfundidos através da vasculatura. Como o fluxo de saída perfusado da artéria pulmonar e do ventrículo esquerdo são coletados simultaneamente, seu conteúdo de detritos pode ser comparado por espectroscopia. A turbidez do efluente de ambos os vasos diminui ao longo do tempo durante as perfusões, embora a turbidez da artéria pulmonar apresente uma mudança de cor mais abrupta em comparação com a observada do ventrículo esquerdo durante o período inicial de perfusão.
A avaliação da correlação entre a turbidez do fluxo e os detritos celulares por um ensaio de proteína de ácido bicinchonínico de seis corações humanos descelularizados revela uma correlação linear entre a concentração proteica e a turbidez do efluente. Ao tentar esse procedimento, é importante monitorar a vazão e coletar o perfusato periodicamente para realmente monitorar o processo de perfusão. Após este procedimento, outras técnicas como avaliação mecânica ou teste de esterilidade podem ser utilizadas para avaliar a fidelidade do andaime e seu potencial uso para recelularização para gerar um tecido cardíaco funcional.
Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo de medicina regenerativa e engenharia de tecidos explorarem a geração de órgãos vascularizados inteiros, mudando literalmente o campo de transplante de órgãos sólidos. Não se esqueça que trabalhar com órgãos humanos e tecidos e produtos químicos, como a SDS, pode ser extremamente perigoso, e sempre usar equipamentos de proteção pessoal adequados ao realizar este procedimento.
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Visão Geral
Este método permite a descelularização de órgãos sólidos complexos, especificamente corações humanos, utilizando um protocolo simples que minimiza a disruptura da matriz do órgão. A técnica emprega uma bolsa pressurizada para monitoramento em tempo real da dinâmica do fluxo e do escoamento de detritos celulares.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Engenharia de Tecidos
- Descelularização de Órgãos
- Pesquisa Cardiovascular
Antecedentes
- A descelularização é fundamental para criar scaffolds vascularizados na engenharia de tecidos.
- Os métodos atuais frequentemente danificam a matriz do órgão.
- São necessárias técnicas aprimoradas para órgãos humanos não transplantáveis.
- O monitoramento em tempo real pode aprimorar o processo de descelularização.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver uma nova técnica de descelularização para corações humanos.
- Aprimorar a esterilidade e a eficiência do processo de descelularização.
- Facilitar a geração de scaffolds vascularizados.
Métodos Utilizados
- Inspeção interna do coração para detectar defeitos.
- Correção de defeitos septais com pontos cirúrgicos.
- Legadura das veias cavas superior e inferior.
- Dissecação da aorta para canulação.
Resultados Principais
- O envelope pressurizado melhora a eficiência da descelularização.
- O monitoramento em tempo real permite um melhor controle do processo.
- Foi alcançada uma mínima perturbação da matriz do órgão.
- O método é aplicável em um ambiente estéril.
Conclusões
- Essa técnica representa um avanço significativo na descelularização de órgãos.
- Apresenta potencial para futuras aplicações na engenharia de tecidos.
- Pesquisas futuras podem expandir seu uso para outros tipos de órgãos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A descelularização de corações humanos inteiros utilizando uma bolsa pressurizada em orientação invertida permite a geração de scaffolds vascularizados para engenharia de tecidos cardíacos, atendendo à necessidade crítica por órgãos transplantáveis. Este método possibilita a redução preditiva de riscos ao preservar a arquitetura da matriz extracelular e permitir o monitoramento em tempo real da dinâmica de perfusão, o que fornece informações sobre a qualidade do scaffold e seu potencial de recelularização. Isso posiciona a técnica como uma capacidade fundamental para o avanço do desenvolvimento de corações bioartificiais e para a redução da dependência de órgãos doadores.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação da composição da matriz extracelular cardíaca e da arquitetura vascular para validação de alvos em terapias para insuficiência cardíaca.
- Valor Operacional: Fornece uma plataforma de suporte reprodutível para estudos mecanicistas de interações entre células e matriz em tecidos doentes versus saudáveis.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera scaffolds padronizados derivados de humanos para avaliação quantitativa do enxerto celular, proliferação e integração funcional em modelos pré-clínicos.
- Valor Operacional: Apoia a prontidão do ensaio por meio de métricas de turbidez em tempo real e correlação de proteínas que permitem controle do processo e consistência entre lotes.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Facilita a continuidade translacional ao fornecer um suporte cardíaco humano relevante para a doença, para avaliação de estratégias de recelularização e maturação eletromecânica.
- Valor Operacional: Permite decisões de avanço ajustadas ao risco por meio da análise correlativa da turbidez do efluente e da remoção de detritos celulares como indicador de controle de qualidade.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra ao continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos promissores e avaliação pré-clínica, por meio de uma plataforma de suporte vascularizado derivado de origem humana.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre alvos da matriz extracelular cardíaca e a elucidação de vias por meio da preservação da arquitetura tecidual nativa.
- Triagem: Permite a padronização de ensaios por meio da correlação entre a turbidez mensurável do efluente e o ensaio proteico com ácido bicinconínico, para monitorar a eficiência da descelularização.
- Análises: Fornece resultados quantificáveis, incluindo dinâmica da vazão, gradientes de pressão e perfis de saída de detritos, que orientam a otimização do processo e decisões de continuidade ou interrupção.
- Pesquisa Translacional: Conecta a descoberta à validação pré-clínica, fornecendo um suporte adequado para recelularização e avaliação funcional em modelos de doenças.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma capacidade reutilizável de geração de suportes aplicável a múltiplos programas de reparo e regeneração cardíaca.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na fidelidade do esqueleto mediante a preservação da matriz extracelular tridimensional e das vasculaturas, reduzindo a ambiguidade mecanicista na engenharia de tecidos cardíacos.
- Valor Operacional: Padronização e escalabilidade alcançadas por meio de sistema de bolsa pressurizada, permitindo descelularização estéril e monitorada ao longo de períodos prolongados.
- Valor Estratégico: Melhoria nas decisões de prosseguimento ou interrupção com base no monitoramento em tempo real da perfusão e nas métricas de remoção de detritos, reduzindo riscos biológicos em fases avançadas em portfólios de medicina regenerativa.
- Impacto no Portfólio: Priorização ajustada ao risco de candidatos a esqueletos utilizando a correlação quantitativa entre turbidez e proteína como critério de liberação para fluxos de trabalho de recelularização.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em perfusão de órgãos, manipulação de reagentes de descelularização e processamento estéril de tecidos.
- Depende de infraestrutura de biorreator de perfusão capaz de manter pressão constante de 120 mmHg e troca de soluções com múltiplos reagentes.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de coleta de efluente, espectroscopia e ensaios de proteínas para avaliação consistente da qualidade do esqueleto.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes tamanhos de órgãos e arquiteturas vasculares ao se estender além dos corações humanos.
- Inclui limitações práticas relacionadas aos riscos de exposição a reagentes (por exemplo, SDS, ácido peracético), exigindo protocolos rigorosos de EPI e contenção.
