Uma medida de cromatografia líquida de alta performance da Quinurenina e ácido cinurênico: matéria bioquímica de cognição e sono em ratos

Este método combina abordagens bioquímicas e comportamentais para ajudar a responder a questões-chave no campo da neurociência sobre o impacto de um desafio agudo de quinurenina em ratos. A principal vantagem da técnica é que ela fornece um método confiável e consistente para a medição de metabólitos da via da quinurenina no cérebro e plasma de ratos. Demonstrando o procedimento estará Carly Fabian, uma estudante assistente de pesquisa do meu laboratório.

No ponto final experimental apropriado após a administração intraperitoneal de quinurenina, descongele o plasma colhido congelado em gelo úmido e dilua as amostras descongeladas com água ultrapura. Transfira 100 microlitros de amostra diluída para recipientes individuais de 25 microlitros de ácido perclórico 6% e votice em centrifugue as amostras. Em seguida, transfira 100 microlitros de sobrenadantes de cada tubo para tubos individuais de microcentrífuga de 250 microlitros para determinação de quinurenina e ácido quinurênico.

Para medição de ácido quinurênico a partir de amostras cerebrais, descongele as amostras cerebrais colhidas congeladas em gelo seco e pese individualmente cada amostra em uma balança analítica precisa. Quando todas as amostras tiverem sido pesadas, mova os tubos para o gelo úmido e dilua cada amostra de tecido na proporção de um para 10 peso por volume com água ultrapura, seguida de homogeneização com um sonicador. Alíquota de 100 microlitros de cada pasta de amostra para um novo tubo, em seguida, adicione 25 microlitros de ácido perclórico a 25% para vórtice e centrifugação.

Em seguida, transfira 100 microlitros de sobrenadante para tubos de microcentrífuga individuais de 250 microlitros para determinação de ácido quinurênico. Para preparar a máquina de cromatografia líquida de alto desempenho, ou HPLC, para análise de quinurenina, primeiro coloque os tubos de admissão de HPLC individuais na fase móvel, água ultrapura e recipientes de acetonitrila 100%. Em seguida, programe o instrumento para funcionar com 5% de acetonitrila e 95% de água ultrapura a 0,5 mililitros por minuto e deixe a máquina de HPLC funcionar por 20 a 30 minutos.

Quando uma pressão e uma linha de base estáveis forem alcançadas, altere a composição da solução para uma fase móvel de acetonitrila a 5% e acetato de sódio a 95% e equilibre o instrumento por mais 30 minutos. Enquanto o instrumento estiver se equilibrando, ligue a lâmpada no detector de fluorescência. Antes da derivitização, bombeie a solução de acetato de zinco separadamente através de uma bomba peristáltica que se combina com a coluna de pós-fase móvel e ligue a bomba de coluna de poste a uma vazão de 0,1 mililitros por minuto por cerca de 20 minutos, até atingir uma pressão estável de cerca de 500 psi.

Quando o instrumento estiver pronto para a análise, configure o software do sistema para controlar os parâmetros da sequência de amostras e permitir a injeção automática de várias amostras. Na tela Executar amostra, clique em Arquivoe arraste para baixo para Criar novo conjunto de amostrasselecionando Vaziona nova janela. Liste individualmente todos os padrões e amostras na ordem em que devem ser executados, com os padrões testados no início e no final da sequência.

Na coluna de função, designe os padrões e amostras e defina o programa para injetar água entre cada cinco amostras. Defina o tempo de execução de cada amostra para 15 minutos e injete 20 microlitros das amostras dos padrões, seguidos por 20 microlitros das amostras de plasma e 30 microlitros das amostras homogeneizadas do cérebro, conforme apropriado experimentalmente. Em seguida, defina os comprimentos de onda de excitação e emissão de acordo com o composto que está sendo medido e execute a sequência.

Para quantificar os dados, abra a tela Procurar Projeto e, na guia Conjuntos de Amostras, clique duas vezes no conjunto de amostras a ser quantificado. Na lista de injeções, destaque todos os padrões e clique com o botão direito do mouse para selecionar Processar'na nova janela. Em seguida, use o menu suspenso para selecionar Calibrar e quantificar'Destaque todos os padrões novamente, clique com o botão direito e selecione Revisar'Quando os cromatogramas abrirem, integre e calibre cada padrão para gerar a curva padrão.

Em seguida, retorne à guia Conjuntos de amostras e clique duas vezes no conjunto de amostras para quantificar e revisar conforme demonstrado, integrando e quantificando cada amostra para gerar a concentração de cada amostra com base na curva padrão criada anteriormente. A análise por HPLC de amostras de tecido colhidas de animais administrados com quinurenina revela um tempo de retenção de quinurenina de cerca de seis minutos e um tempo de retenção de ácido quinurênico de cerca de 11 minutos. A quantificação da quinurenina plasmática e do ácido quinurênico hipocampal revela que a injeção aguda de quinurenina aumenta os níveis de ácido quinurênico cerebral com um pico alcançado duas horas após a injeção que retorna à linha de base quatro horas após a injeção.

Embora não sejam observadas diferenças de grupo durante os ensaios de treinamento do paradigma de evitação passiva, os animais de controle apresentam um aumento significativo na latência para entrar no lado escuro durante os testes, indicando aprendizado contextual, enquanto os animais injetados com quinurenina 24 horas antes não apresentam o mesmo aumento na latência, demonstrando um déficit no aprendizado. Além disso, a avaliação do impacto de uma elevação aguda da quinurenina durante a fase de luz na arquitetura sono-vigília indica uma redução na duração total do sono de movimento rápido dos olhos durante as primeiras duas horas após a injeção de quinurenina. Esses dados são espelhados por um aumento na duração da vigília durante esses períodos de tempo e uma ligeira redução no sono sem movimento rápido dos olhos, demonstrando que uma elevação aguda da quinurenina também causa distúrbios na dinâmica sono-vigília.

Após este procedimento, outros métodos, como análise comportamental, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre o papel da formação elevada de ácido quinurênico na modulação da cognição e do sono.