Proteína endógena de marcação em humanos induzida por células-tronco pluripotentes usando CRISPR/Cas9

O objetivo deste protocolo é gerar células-tronco pluripotentes induzidas por humanos que expressam proteínas de fusão endógenas fundidas para placas fluorescentes terminais N ou C do quadro final. Para alcançar o knock in desejado, usamos o sistema CRISPR-Cas9 e uma abordagem baseada em ribonucleoproteína usando a proteína Cas9 de S.pyogenes do tipo selvagem e um RNA CRSPR sintético de duas partes e tracrRNA. Este RNP é co-entregue com a sequência de marcação fluorescente desejada como um plasmídeo doador via eletroporação.

Células supostamente editadas que expressam a proteína marcada com fluorescência são enriquecidas por FACS. As linhas clonais são então geradas para análise de resultados de edição precisos. Este protocolo de edição de genes tem muitas vantagens sobre as construções tradicionais de superexpressão.

Como uma marca fluorescente é introduzida no genoma, a localização subcelular e a dinâmica da proteína de fusão resultante podem ser estudadas sob controle regulatório endógeno. Aqui usamos células-tronco pluripotentes induzidas como um sistema modelo porque nos permite estudar as proteínas marcadas em células diploides não transformadas. Além disso, como as células podem ser diferenciadas em vários tipos de células, como as células cardiomiócitos mostradas aqui, essa abordagem oferece a oportunidade de criar e estudar proteínas marcadas em uma variedade de contextos celulares isogênicos.

No entanto, com uma otimização cuidadosa, esse protocolo pode ser adaptado para editar os genomas de outros tipos de células de mamíferos. Olá, sou Amanda Haupt, faço parte da equipe de células-tronco e edição de genes aqui no Allen Institute for Cell Science. Hoje, usamos essa abordagem para gerar mais de 35 linhagens celulares diferentes que expressam proteínas de fusão endógenas.

Nós os usamos para estudar uma ampla variedade de estruturas e processos celulares únicos. Essa abordagem foi bem-sucedida em até 95% dos loci tentados até o momento com nosso grupo. Este método será particularmente útil para biólogos celulares interessados em entender melhor a dinâmica de uma proteína em células vivas.

No entanto, uma vez que as linhagens clonais editadas são geradas, as possibilidades de estudo são infinitas. Com este método, somos capazes de identificar consistentemente clones que possuem marcadores de proteína fluorescente monoalélica sem quaisquer outras interrupções na sequência genômica. Ocasionalmente, também podemos obter clones editados biaelicamente.

Neste vídeo, mostraremos algumas das principais etapas na transfecção, enriquecimento de FACS e isolamento de linhagens celulares clonais que expressam proteínas de fusão fluorescentes reguladas endogenamente. Duas a três horas antes da transfecção, trate as hiPSCs com dez inibidores micromolares de ROCK suplementados em meios de crescimento. Isso promoverá a sobrevivência após a eletroporação.

As células terão aparência pontiaguda após este tratamento. As células devem ser removidas da placa de fechamento do tecido usando uma única região de dissociação celular e a suspensão celular coletada em um tubo cônico antes da transfecção. Preparar uma alíquota de 1,84 vezes 10 elevado às seis células para cada condição experimental a ser transfectada.

Prepare tubos complexos de ribonucleoproteína para cada transfecção adicionando 2,88 microlitros de RNA guia de 10 micromolares e 2,88 microlitros de Cas9 micromolar a um tubo de 1,5 mil. Incubar à temperatura ambiente durante um mínimo de 10 minutos, um máximo de uma hora. Granular a alíquota da célula preparada no passo anterior a 211 vezes G durante três minutos à temperatura ambiente.

Em seguida, aspire o sobrenadante e corra para girar o pellet celular em 220 microlitros de tampão de eletroporação. Adicione 220 microlitros de células ressuspensas ao tubo complexo RNP de 1,5 mil previamente preparado. Adicione 4,6 microlitros de um micrograma por plasmídeo doador de microlitro.

Use a ponta de nucleofecção e a pipeta para misturar os dois conteúdos duas a três vezes e, em seguida, transfira cem microlitros de suspensão para o dispositivo de eletroporação preparado. Evite introduzir bolhas na ponta. Aplique mil e trezentos volts por um pulso de trinta milissegundos.

Transfira suavemente a suspensão para uma placa de seis poços com um movimento giratório. Disperse as células movendo suavemente a placa de um lado para o outro e da frente para trás. Depois de repetir para todas as condições experimentais e controles, incubar células transfectadas a 37 graus Celsius e 5% de CO2 por 24 horas, mudando o meio para meio de crescimento regular sem inibidor de ROCK em 24 horas.

Em seguida, continue a alimentar os hiPSCs a cada 24 horas por 72 a 96 horas monitorando sua confluência. Quando os hiPSCs atingirem 68 a 80% de confluência, prossiga para o enriquecimento do FACS. Duas a três horas antes da transfecção, trate hiPSCs com inibidor de ROCK 10 micromolar suplementado no meio de crescimento para promover a sobrevivência após o enriquecimento de FACS.

Para classificar as células, remova-as da placa usando o reagente de dissociação de célula única e, em seguida, filtre a suspensão hiPSC através de um filtro de malha de 35 mícrons em tubos de poliestireno de fundo redondo. Classifique as células usando dispersão direta e lateral, incluindo: altura versus largura, detritos de trigêmeos e dublês. Use células de controle somente de buffer ao vivo para definir a porta positiva do FP, de modo que menos de 1,1% das células somente de buffer caiam dentro da porta.

Ao classificar as células-tronco, adapte as configurações do instrumento para promover a sobrevivência celular, conforme sugerido na seção de discussão. A batida típica nas eficiências, conforme determinado pela porcentagem de células positivas FP pelo FACS, pode variar de 0,1% a 5% Classifique as células em um tubo de polipropileno de 1,5 a 15 mil contendo 0,5 a 2 mils de meio de crescimento à temperatura ambiente suplementado com inibidor de ROCK de 10 micromolares. Centrifugar as células recolhidas a 211 vezes G durante três minutos à temperatura ambiente.

Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 200 microlitros de meio de crescimento suplementado com inibidor de ROCK 10 micromolar. Transfira até três mil células variadas para um único poço de uma placa de 96 poços revestida com matrigel fresco. Incubar células classificadas a 37 graus Celsius em 5%CO2 por 24 horas, mudando o meio para meio de crescimento suplementado com inibidor de ROCK 5 micromolar em 24 horas.

Em seguida, às 48 horas, continue alimentando as células com meios de crescimento regulares, sem inibidor de ROCK a cada 24 horas por 72 a 96 horas monitorando a confluência. Uma vez que as células estejam maduras o suficiente para serem passadas para fora da placa de 96 poços, recomendamos passá-las gradualmente para placas maiores. Então, por exemplo, de um poço de uma placa de 96 poços, mova-os para um ou dois poços de uma placa de 24 poços.

E então de lá para uma placa de 6 poços, etc., até que você tenha células suficientes para fins a jusante. Geralmente três a quatro milhões de células no mínimo. Para gerar linhas clonais da população enriquecida FACS de células editadas punitivamente, passe para suspensão de célula única e coloque dez mil células em uma placa de 10 centímetros e permita que as colônias cresçam por cinco a sete dias.

Quando as colônias são visíveis macroscopicamente, elas são grandes o suficiente para serem isoladas. Em um microscópio de dissecação, use uma pipeta P200 para raspar e aspirar suavemente colônias individuais da superfície da placa. Transfira o volume contendo a colônia para um único poço da placa de 96 poços.

Depois que todas as colônias forem transferidas, incube a placa em uma incubadora de cultura de tecidos a 37 graus Celsius e 5% de CO2 por 24 horas. Troque o meio para meio de crescimento regular sem inibidor de ROCK em 24 horas. Em seguida, continue alimentando as células a cada 24 horas por 72 a 96 horas até que as colônias tenham aproximadamente triplicado de tamanho.

As células precisarão ser cultivadas e passadas em placas de 96 poços para ter células suficientes para criopreservar antalise para extração de DNA genômico. Consulte o protocolo escrito para obter mais detalhes. Para passar em placas de 96 poços, use um aspirador de oito canais para remover e descartar a mídia da primeira coluna.

Usando uma pipeta multicanal P200, adicione cerca de 200 microlitros de DPBS à primeira coluna da placa para lavar as células. Usando um aspirador de oito canais, remova e descarte a lavagem DPBS da primeira coluna. Em seguida, adicione 40 microlitros de reagente de dissociação à primeira coluna.

Repita essas etapas trabalhando uma coluna de cada vez para até um total de seis colunas da placa de 96 poços. Troque as pontas para ter certeza de não contaminar os poços. Colocar a placa na incubadora durante três a cinco minutos a partir do momento em que o reagente de dissociação foi adicionado à primeira coluna.

Quando as células na primeira coluna da placa começarem a se levantar do fundo, use uma pipeta multicanal P200 para adicionar 160 microlitros de DPBS à primeira coluna e triture suavemente as células nas posições de 12 horas, 3 horas, 6 horas e 9 horas de cada poço. Transfira todo o volume com suspensão de células para uma placa de 96 poços com fundo em V. Repita essas etapas para as colunas restantes que possuem reagente de dissociação, trocando as pontas para não contaminar os poços.

Girar a placa de fundo em V na centrífuga a 385 vezes G durante três minutos à temperatura ambiente. Os sub mostrados até este ponto para 96 passagens de poços são realizados da mesma maneira sempre que as células são passadas neste formato de placa. A seguir, mostraremos como proceder se você estiver pronto para criopreservar as células no formato de 96 poços.

Consulte o protocolo escrito para obter mais informações. Após a etapa de centrifugação mostrada na seção anterior, aspire o sobrenadante usando uma pipeta multicanal P200 e, em seguida, ressuspenda em 60 microlitros de meio de crescimento suplementado com inibidor de ROCK 10 micromolar. Repita para todos os poços, trocando as pontas para não contaminar cruzadamente.

Transfira 30 microlitros de suspensão celular para uma placa de cultura de tecidos de 96 poços não revestida com matrigel. Transfira os 30 microlitros restantes de suspensão para uma placa irmã e, em seguida, adicione rapidamente 170 microlitros de tampão de congelamento a cada poço sem misturar. Observe que esse processo é feito em placas irmãs duplicadas, de modo que exista uma população de células de backup após o descongelamento de uma das placas individuais.

Colocar células criopreservadas em apenas todas as outras colunas da placa de 96 poços permite um descongelamento mais rápido. Enrole o prato com parafilme e coloque-o em uma caixa de isopor em temperatura ambiente com tampa. Coloque a caixa inteira no freezer de 80 graus Celsius negativos.

Após 24 horas, as placas podem ser transferidas para fora da caixa de isopor e classificadas a 86 graus Celsius negativos por até quatro semanas. A criopreservação de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos em formato de 96 poços permite uma quebra temporal na cultura de células. O pesquisador pode realizar ensaios de validação genômica nas minas clonais para identificar os clones geneticamente desejáveis para descongelar para estudos futuros.

Quatro dias após a transfecção da linha WTC hiPSC com uma proteína Cas9 de RNA guia específico e um plasmídeo modelo de doador cuidadosamente projetado, observou-se que 0,95% das células expressavam GFP. O FACS foi usado para classificar todas as células positivas para GFP como uma população enriquecida. Estudos preliminares de microscopia revelaram a localização esperada da proteína de fusão da lâmina nuclear B1 mEGFP no envelope nuclear.

A proteína marcada com fluorescência foi observada em cerca de 95% das células com intensidades variadas. Após a geração da linhagem clonal, clones com intensidade uniforme de mEGFP foram obtidos e posteriormente analisados para edição precisa. Para concluir, mostramos um método de transfecção para edição de genes de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos para a expressão de proteínas de fusão fluorescentes reguladas endogenamente.

Como as ineficiências típicas de detonação são baixas, algumas estratégias de enriquecimento, como o método FACS mostrado aqui, resultam em uma população de células supostamente editadas expressando a proteína de fusão. A população enriquecida pode ser usada para estudos biológicos ou linhas clonais podem ser geradas conforme descrito neste método, tornando possível identificar linhas celulares que são editadas com precisão por genes. É importante lembrar que as quebras de fita dupla induzidas por Cas9 no genoma são frequentemente reparadas de forma imprecisa, apesar da incorporação da etiqueta no locus pretendido.

Além disso, em clones editados monoalelicamente, o alelo não marcado freqüentemente contém indels provavelmente causados por reparo de junção de extremidade não homólogo. Essas descobertas ressaltam a importância da validação genética após uma batida de CRISPR Cas9 revelada apenas por meio da análise do genoma de linhagens celulares clonais. A expressão da proteína de fusão esperada por si só não garante uma edição precisa.

Ao usar este protocolo para editar células-tronco pluripotentes induzidas por humanos, tome cuidado para seguir as recomendações detalhadas no protocolo escrito para garantir o manuseio suave das células para uma sobrevivência celular ideal e diferenciação espontânea mínima. Esperamos que este vídeo e a lista de protocolos e materiais associados ajudem você a realizar experimentos semelhantes em seu próprio laboratório com sua proteína favorita. Obrigado por assistir.