Name: Proteína endógena de marcação em humanos induzida por células-tronco pluripotentes usando CRISPR/Cas9 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 48 s
Description: Aprenda a marcar proteínas endógenas em células-tronco pluripotentes humanas usando CRISPR/Cas9 e FACS. Este método permite estudar dinâmicas proteicas sob controle regulatório endógeno em células vivas.

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Agradecemos a Daphne Dambournet para muitas discussões perspicazes e conselhos sobre gene edição, Thao fazer para ilustração, Angelique Nelson para leitura crítica do manuscrito e Andrew Tucker para gerar a linha de celular jesuina B1 mEGFP-tag. Queremos reconhecer as células-tronco e Gene Editing e equipes de desenvolvimento de ensaio do Instituto Allen para a ciência da célula por suas contribuições para o processo de controle de qualidade e edição de gene. A linha WTC que usamos para criar nossa linha celular gene-edição foi fornecida pelo Bruce R. Conklin Laboratory no Gladstone institutos e UCSF. Agradecemos o Instituto Allen para o fundador da ciência da célula, Paul G. Allen, para sua visão, encorajamento e apoio.

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O método apresentado aqui para gerar endogenamente regulada fusões de proteína fluorescente em hiPSCs é uma abordagem versátil e poderosa para gerar linhas de células de gene editado com aplicações que vão desde imagens de células vivas para vários estudos funcionais e " modelos de doenças em um prato"usando linhas de paciente-derivado hiPSC13,14,15. Enquanto este método tem sido usado para introduzir grandes etiquetas FP para N - ou C-terminal de proteínas endógenas, potencialmente poderia ser usado para apresentar outras marcas ou pequenas alterações genéticas modelo ou correto doença-causando mutações22,23 . Para inserções menores, o tamanho do braço homologia pode ser reduzido, mas a abordagem geral da edição apresentada neste método ainda pode aplicar24,25. Enquanto o uso de hiPSCs é fortemente incentivado por sua vasta utilidade, com otimização do cuidado, este protocolo pode ser adaptado para editar os genomas de outras linhas de células de mamíferos.
Ao identificar um gene de interesse para marcação de FP, estimativas de abundância de transcrição (a partir de dados de RNA-Seq ou microarray) é um bom ponto de partida para avaliar se um gene ou a isoforma de interesse é expresso, embora os níveis de transcrição não sempre se correlacionam com níveis de proteína. A estratégia de FACS-enriquecimento descrita aqui irá funcionar melhor para genes que são expressos pelo menos moderadamente bem no tipo de célula de interesse. Esta estratégia também foi bem sucedida na seleção para fusões que apresentam padrões de localização punctate e/ou discretos como centrin, desmoplakin e paxillin onde o sinal à relação de fundo é muito baixo12,19. Genes que não são altamente expressas ou só são expressos em tipos de células derivadas podem exigir estratégias de seleção adicionais.
O ponto de partida para crRNA e doador projetos de plasmídeo de modelo utilizado em linhas de células humanas deve ser o genoma humano de referência (GRCh38). Porque os genomas de linhagens celulares diferentes podem variar dentro da mesma espécie, e porque CRISPR/Cas9 é específico da sequência, é extremamente útil identificar variantes de linha específica de célula (polimorfismos de nucleotídeo único ou inserções/exclusões (puntuais)) que diferem do genoma de referência e incorporar estas no projeto. Isso garante que o crRNAs será compatível com o genoma do hospedeiro e que as armas de homologia doador modelo plasmídeo irão reter quaisquer variantes específicas de linha celular. Uma estratégia sugerida é incorporar homozigotos variantes crRNAs e doador de armas de homologia de plasmídeo modelo durante o processo de design. Incorporando as variantes heterozigotas é opcional. Os reagentes específicos utilizados para grandes batida-em experimentos e outras considerações-chave para este protocolo são discutidas abaixo.
Proteína Cas9
O principal benefício do uso de proteína Cas9 é que introduzindo o Cas9 e gRNA como um complexo de RNP foi mostrado para resultar em uma duração limitada de actividade nuclease em comparação com abordagens baseadas em plasmídeo onde a expressão do Cas9 e gRNA pode continuar por dias e levar a maior em-fora-alvo e atividade26,27. Um benefício adicional do uso de proteína Cas9 é que está prontamente disponível para clivar uma vez dentro das células. Isto contrasta com métodos mais convencionais de usando Cas9 mRNA ou Cas9/gRNA plasmídeo que necessitam de transcrição, tradução e processamento de26,28. Sua proteína de S. pyogenes Cas9 agora está disponível de várias fontes comerciais.
Guia do RNA
Existem muitas ferramentas disponíveis publicamente para encontrar alvos de crRNA perto do local de inserção de FP desejado que têm zero ou alguns previstos fora-alvos no genoma do hospedeiro29,30,31,32. Eficiência em HDR e a precisão do resultado HDR varia amplamente entre alvos de crRNA usados em um determinado locus12. Por esta razão, testando vários crRNAs (2-4 e de preferência dentro de 50 bp do local de inserção desejada) por locus é recomendada, pois isto pode aumentar a probabilidade de uma experiência bem sucedida de edição. Possibilidades atuais para a entrega de gRNA incluem sintético 2-parte crRNA tracrRNA, gRNAs única sintética (sgRNAs), e em vitro transcrito sgRNAs, ou entregar um plasmídeo para células expressando o sgRNA de um promotor de U6. Este protocolo não foi otimizado para atividade de decote alto. Não modificado 2-parte crRNA e tracrRNA (ver Tabela de materiais) foram usados com o objetivo de gerar linhas de células mono-alélico FP-etiquetado enquanto causando a perturbação menos potencial para as células.
Dador modelo plasmídeo
Porque alguns da homologia braço sequência desde o dador plasmídeo modelo será incorporado o genoma do hospedeiro durante o evento HDR, mutações pontuais para os sites de reconhecimento de crRNA devem ser introduzidas para evitar a segmentação por Cas9 seguindo HDR. Muitas vezes a mais simples mudança disruptiva é transformar a sequência de PAM que. Porque algumas sequências não-canônicos do PAM ainda podem ser reconhecidas pelo tipo selvagem Cas9 S. pyogenes , é melhor evitar o uso NGG, nascimento ou NGA33. Quando o braço de homologia a sofrer uma mutação, evite mutações não-sinónimas e a introdução de códons raros. Se uma mudança de sinônimo para a sequência de PAM não for possível, considere fazer três mutações sinónimas de ponto na região da semente (10 bp proximal à PAM) do sítio de ligação do crRNA. Extremo cuidado deve ser tomado ao fazer essas alterações na região untranslated 5ʹ (UTR), desde que estas regiões podem conter sequências reguladoras importantes. Consultar um banco de dados de conservação genética tais como faixas de genómica comparativa do UCSC Genome Browser podem fornecer orientação, nestes casos, como alterações em bases não-conservada podem ser melhor toleradas do que muda para bases altamente conservadas17. Às vezes, a simples inserção da sequência FP é suficiente para perturbar o sítio de ligação do crRNA (como na Figura 1); no entanto, a sequência recém-anexado deve ser verificada para a persistência da ligação crRNA e sequências de PAM.
Aminoácido linkers entre o FP e a proteína nativa são recomendados para conservar a função da proteína de fusão34. Muitas vezes um vinculador de aminoácido pode ser escolhido para a sua carga em particular ou o tamanho. Se uma fusão de cDNA com um design semelhante do alvo endógena proteína de fusão tem sido bem estudada, que mesmo vinculador de sequência pode ser usada para o TOC-no experimento CRISPR/Cas912,19. Se essa informação não estiver disponível, um vinculador curto como GTSGGS também tem sido usado com sucesso12. Outros estudos têm demonstrado sucesso com uma sequência de genérico vinculador de ácido 3-amino pequeno para uma variedade de alvos35.
Transfection e enriquecimento de FACS
Muitos reagentes de transfecção disponíveis comercialmente são formulados para a entrega de certos tipos de moléculas de células, Considerando que um sistema de eletroporação pode ser usado para entregar os reagentes com uma ampla gama de tamanho, carga e composição. Além de ser um método comum de Transfeccao para células difícil-para-transfect, como hiPSCs, electroporation também traz o benefício de entregar todos os três componentes para bater-em FP CRISPR/Cas9-mediada conforme descrito neste método. Electroporation foi encontrado para produzir os melhores resultados quando comparado com outros reagentes comercialmente disponíveis ao desenvolver esse método (dados não mostrados) e também tem sido usado por outros para RNP entrega26,28,36 .
Quando usando esse protocolo para edição hiPSCs, especial deve ter cuidado para garantir suave manipulação das células antes e após o processo para a sobrevivência da célula ideal e mínima diferenciação espontânea de edição gene. Em particular, os métodos de enriquecimento de FACS devem ser adaptados para classificação de células-tronco, usando o bico maior possível (130 µm), uma baixa taxa de fluxo (≤24 µ l/min), fluido de bainha de conservantes (como soro fisiológico, consulte Tabela de materiais) e amostra de baixa pressão (10 psi). Em vez de célula única classificação, que resulta em qualidade inferior viabilidade em células-tronco, os hiPSCs FACS-enriquecido são classificados em massa e expandiu-se como uma população para otimizar a integridade de viabilidade e células-tronco de células. No entanto, a única célula classificação pode ser apropriado para menos tipos de células sensíveis. Para promover a sobrevivência celular, células retornou a cultura não é mais do que uma hora depois da colheita para o enriquecimento de FACS e mantidas à temperatura ambiente durante todo o processo de classificação. Para alguns tipos de células, a sobrevivência da pilha também pode ser melhorada por células de incubação no gelo (4° C) durante todo o processo de classificação.
A expansão em massa de células FP-positivo fornece uma oportunidade para avaliar a população por análise de imagem para localização da proteína de fusão antes de gerar linhas clonais. Enquanto a população enriquecida resultante de células pode ser suficiente para alguns estudos, estas populações frequentemente exibem sinal FP de intensidade variável. As linhas clonais isoladas têm sinal uniforme (Figura 3), tornando-os mais adequados para experimentos funcionais12.
Geração de linha celular clonal
Durante o processo de geração clonal e edição linha, é importante controlar a morfologia celular. hiPSC colônias crescidas em condições de livre de alimentador devem exibir bordas lisas e um centro bem embalado, mesmo12,18,19. Células diferenciadas devem ser observadas em menos de 5% da cultura. Ao escolher colónias individuais, escolha aqueles que morfologia boa exposição. Durante a placa de 96 poços, passagem de eventos, verifique clones para morfologia e descontinuar os que têm crescido, pois isso pode levar a diferenciação ou ser uma indicação de instabilidade genética.
Permite a geração de linhas de células clonais para confirmação genética da edição precisa, que é importante porque induzida por Cas9 dupla vertente quebra no genoma são muitas vezes reparados imprecisa apesar de incorporação da marca para o local desejado. Ensaios de PCR-based descritos anteriormente mostraram que cumulativamente através de dez únicas genomic loci muitos (45%) dos clones FP-expressando sofria de integração de espinha dorsal de plasmídeo de doador para o locus alvo ou (raramente) aleatoriamente no genoma12. Além disso, 23% de GFP-positivo clones (n = 177) através de dez únicos loci foram encontrados para abrigar mutações no ou perto do local de corte antecipado crRNA no alelo não marcado, provavelmente devido a NHEJ12. Esta análise genética de muitas linhas clonais (~ 100 clones/editar) destacou a importância da validação genética que não é possível em uma população celular desde que FP-expressão e localização da proteína de fusão esperada sozinho não garante a edição precisa12 . Além disso, estes ensaios baseados em PCR não podem ser executados em uma população enriquecida de células com alguma certeza, justificando a necessidade de geração clonal linha antes análise significativa pode ser concluída. Confirmação genética da marca FP inserida e verificação da integridade genética do alelo inédito (em um clone de mono-alélico editado) são necessárias para uma edição precisa no locus alvo além da expressão marca.
Uma baixa taxa de edições bi-alélica e falta de mutações fora do alvo (como analisado por Sanger e sequenciamento exome) foram observados para data usando este método (dados não publicados)12. Isto é consistente com estudos anteriores descrevendo o uso da RNP de curta duração para CRISPR/Cas9 experimentos26,27. A falta de linhas de células clonais com edições bi-alélica também pode ser o locus específico ou devido à incapacidade da célula de tolerar dois marcados cópias de uma proteína essencial como sugerido de experimentos publicados anteriormente onde eram células editadas bi-alélico putativos observado para um locus (LMNB1), mas não outro (TUBA1B)12. Linha celular clonal totalmente validado bi-alélico foi gerada usando esse método para marca ST6 beta-galactoside alfa-2, 6-1 sialyltransferase (ST6GAL1) e membro RAB5A família de oncogene RAS (RAB5A) com mEGFP19.
Além de confirmar a precisão do Editar no genoma, há uma variedade de ensaios de controle de qualidade que pode ser usado para mais caracterizar a linha clonal e identificar clones que cumprir todas as células-tronco, genoma, e critérios biológicos de celular para usam em futuros estudos . Ensaios biológicos e funcionais de celular podem ser usados para confirmar a expressão adequada, localização e função das proteínas fusão12. A comparação com os controles parentais não editadas ajudará a avaliar a influência do processo de edição na localização, dinâmica e função. Outros ensaios tais como análise de crescimento e ensaios de estabilidade genômica podem também ajudar a determinam se a proteína etiquetada é perturbadora para a célula. Ao usar o hiPSC no presente protocolo, avaliação de marcadores de pluripotência e potencial de diferenciação pode ser crítica na determinação de um clone que é valioso para a jusante estuda12. Porque estendeu a cultura de hiPSC foi mostrado para provocar instabilidade genética, a taxa de crescimento de monitoramento e cariótipo de linha celular clonal é também importante12,,37. No entanto, a final se destina uso das células editados irá determinar o nível e a amplitude de análise de controle de qualidade e irá variar com base na aplicação.

O uso de estratégias de edição de genoma, especialmente CRISPR/Cas9, para estudar processos celulares está se tornando cada vez mais acessível e valioso1,2,3,4,5, 6 , 7. uma das muitas aplicações de CRISPR/Cas9 é a introdução (através de reparação de homologia dirigida (HDR)) de grandes sequências exógenas como GFP em específico loci genômicos que então serve como repórteres para a atividade de um gene ou a proteína produto8 . Esta técnica pode ser usada para associar uma sequência da proteína fluorescente a um frame de leitura aberto endógeno onde a proteína de fusão endogenamente regulada a resultante pode ser usada para visualizar a Localização subcellular e a dinâmica da proteína de interesse5 ,6,9,10,11. Enquanto proteínas endogenamente etiquetadas oferecem muitos benefícios em comparação com sistemas de superexpressão, inserindo grandes sequências do genoma humano é um processo ineficiente, normalmente exigindo uma seleção ou estratégia de enriquecimento para obter uma população de células que podem ser facilmente estudados5,12.
Este protocolo descreve a inserção de uma sequência de DNA, a codificação de uma proteína fluorescente (FP) em um locus genômico desejado. O protocolo inclui design e entrega de plasmídeo de modelo o doador e o ribonucleoprotein (RNP) complexo (proteína selvagem tipo S. pyogenes Cas9 combinada com sintético CRISPR RNA (crRNA) e ativando o trans crRNA (tracrRNA)). Também descrito é o enriquecimento das células presumidamente editados via celular de fluorescência ativada (FACS) de classificação e o processo de geração de linha celular clonal. Até à data, este método tem sido usado para gerar linhas de hiPSC com monoallelic ou etiquetas (raramente) bi-alélico proteína verde fluorescente (GFP) rotulagem 25 proteínas representando as principais estruturas celulares. As células editadas resultantes destes esforços foram confirmadas para ter a inserção genética esperada, expressar uma proteína de fusão localização corretamente e manter pluripotência e um cariótipo estável12 (e dados não publicados). Esse método também tem sido usado para gerar vários outros single e dual (duas proteínas diferentes, marcadas na mesma célula) edição de populações de hiPSCs (dados não publicados).
IPSCs humanas derivadas de um doador saudável foram escolhidos para estes esforços de genoma-edição porque, ao contrário de muitas linhas de celulares convencionais, são diploides, dos estável, não-transformadas e proliferativa. Essas propriedades fornecem um modelo atraente para estudar Biologia celular fundamentais e modelagem de doença. Além disso, o potencial de diferenciação de hiPSCs fornece a oportunidade de estudar vários estádios de desenvolvimento em paralelo em várias linhagens e tipos de célula usando células isogénicas, incluindo organoids, tecidos e modelos de "doença em um prato"13 de14, ,15. Enquanto este protocolo foi desenvolvido para hiPSCs (linha do WTC), pode ser informativo para o desenvolvimento de protocolos utilizando outras linhas de células de mamíferos.

<table><tbody><tr><td>Geneious R9</td><td>Biomatters, ou software de</td> bioinformática semelhante <td></td><td>para in silico projeto de plasmídeo doador</td></tr><tr><td>TE Buffer pH 8.0</td><td>IDT, ou similar</td><td>11-01-02-05</td><td></td></tr><tr><td>HERAcell VIOS 160i CO2 incubadora, ou similar</td><td>ThermoFisher Scientific, ou similar</td><td>51030408</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas (1000 &micro; L, 200 &micro; L, 20 &micro; L, 10 &micro; L, 2 e micro; L)</td><td>Rainin, ou pontas de</td> pipeta semelhantes <td></td><td></td></tr><tr><td>(1000 &micro; L, 200 &micro; L, 20 &micro; L)</td> <td>Rainin, ou similar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Multicanal (200 &micro; L)</td> <td>Rainin ou pipetas sorológicas semelhantes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(25 mL, 10 mL, 5 mL)</td> <td>Costar ou</td> coletor de 8 canais de MARCA semelhante <td></td><td></td></tr><tr><td>para Quiksip,</td><td>Millipore Sigma</td> autoclavável ou <td>uso semelhante BR704526-1EA</td><td>com pontas de pipeta não filtradas, como pontas de pipeta de baixa retenção da Molecular BioProducts, Pure 10, abaixo</td></tr> das <tr><td>pontas de pipeta de baixa retenção da Molecular BioProducts, Pure 10</td><td>Thermo Fisher, ou semelhante</td><td>3501-05</td><td></td></tr><tr><td>XP2 Controlador de pipeta</td><td>Drummond, ou similar</td><td>4-000-501</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur descartáveis</td><td>VWR, ou similar</td><td>53300-567</td><td></td></tr><tr><td>Classe II, Tipo A2 Gabinete de Segurança Biológica</td><td>CELLGARD, ou similar</td><td>NU-481</td><td></td></tr><tr><td>Matriz Matrigel, Fator de Crescimento Reduzido</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>lote testado antes do uso com hiPSC</td></tr><tr><td>DMEM/F12 (vermelho de fenol)</td><td>Gibco</td><td>11039-021</td><td>frio, para diluir Matrigel 1:30</td></tr><tr><td>mTeSR1 Mídia completa</td><td>StemCell Technologies</td><td>85850</td><td>mídia de crescimento recomendada para a linha WTC hiPSC</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>WTC linha hiPSC</td><td>Coriell</td><td>GM25256</td><td>a linha hiPSC usada neste protocolo está disponível através da Coriell</td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos 100 mm</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de células de 6 poços</td><td>CELLSTAR</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase</td><td>Gibco</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) sem cálcio, sem magnésio</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>15 mL de poliestireno cônico</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.100</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 ( Inibidor de ROCK)</td><td>StemCell Technologies</td><td>72308</td><td></td></tr><tr><td>Edit-R CRISPR-Cas9 CrRNA sintético, não modificado (sequência personalizada)</td><td>Dharmacon</td><td>Custom0247</td><td></td></tr><tr><td>Edit-R CRISPR-Cas9 TracrRNA sintético</td><td>Dharmacon</td><td>U-002005-05</td><td></td></tr><tr><td>Streptococcus pyogenes Proteína purificada Cas9-NLS, 40 &micro; M</td><td>Universidade da Califórnia-Berkeley QB3 Macrolab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmídeo doador personalizado (PriorityGENE)</td>O design da inserção do doador <td>Genewiz</td><td></td><td>foi sintetizado e clonado no backbone pUC57 pelo tubo Genewiz</td></tr><tr><td>DNA LoBind 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Maxi EF</td><td>Clontech</td><td>740424.50</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Transfecção de Néon</td><td>ThermoFisher Sistema de</td><td></td> Transfecção de Neon MPK5000 <td></td>Scientific</tr><tr><td>, 100 &micro; Kit L</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK10096</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 mL com tampa do filtro de células</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cônico de polipropileno de alta clareza de 15 mL</td><td>Falcon</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>FACSAriaIII Fusion</td><td>BD Biosciences</td><td>656700</td><td></td></tr><tr><td>FACSDiva software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>versão FlowJo 10.2</td> Banco de Sangue <td>TreeStar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NERL Saline</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>8504</td><td>usado como amortecedor FACS sem conservantes Microscópio</td></tr><tr><td>Estéreo Olympus SZX7, ou</td><td>similar Olympus, ou</td> similar <td></td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos, 96-well</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>96 well Placa de Cultura de Células, V-Bottom</td><td>CELLSTAR</td><td>351180</td><td></td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>Sigma</td><td>C2874-100ML</td><td>usado como tampão de criopreservação para células em formato de placa de 96 poços</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura celular de 24 poços</td><td>CELLSTAR</td><td>662160</td><td></td></tr></tbody></table>

proteína endógena de marcação em humanos induzida por células-tronco pluripotentes usando crispr/cas9

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Um protocolo é apresentado para a geração de células-tronco pluripotentes induzidas humana (hiPSCs) que expressam endógenas proteínas fundidas para etiquetas fluorescentes N - ou C-terminal em-frame. O sistema CRISPR/Cas9 procariótico (regularmente intercalado curto clusterizado palíndromo 9 repetições/CRISPR-associado) pode ser usado para introduzir grandes sequências exógenas em Genômica loci através de reparação homologia dirigida (HDR). Para alcançar o desejado bater-em, este protocolo emprega o ribonucleoprotein (RNP)-onde selvagem tipo Streptococcus pyogenes Cas9 proteína, sintético-parte 2 guia RNA (gRNA) e um plasmídeo de modelo do doador são entregues para as células através de abordagem baseada na eletroporação. Presumidamente editadas celulas que expressam as proteínas fluorescente etiquetadas são enriquecidas pela célula de fluorescência ativada classificação (FACS). Clonais linhas então são geradas e podem ser analisadas para resultados precisos de edição. Introduzindo a tag fluorescente no locus genômico do gene de interesse, a Localização subcellular resultante e a dinâmica da proteína de fusão pode ser estudada sob controlo regulamentar endógeno, uma melhoria fundamental sobre superexpressão convencional sistemas. O uso de hiPSCs como um sistema modelo para gene tagging oferece a oportunidade de estudar as proteínas etiquetadas em células diploides, nontransformed. Desde que o hiPSCs pode ser diferenciada em vários tipos de células, essa abordagem oferece a oportunidade de criar e estudar proteínas etiquetadas em uma variedade de contextos isogénicas de celulares.

O objetivo deste experimento foi fundir mEGFP (GFP reforçada monomérico) à proteína nuclear de B1 lamina introduzindo a sequência de mEGFP para o fim de 5ʹ do gene LMNB1 (N-terminal da proteína). Um vinculador (sequência de aminoácidos SGLRSRAQAS) foi escolhido com base no anterior construções de cDNA da coleção de proteína fluorescente Michael Davidson21. Porque a região de ligação crRNA em plasmídeo de modelo o doador para crRNA cada candidato foi interrompida após a inserção no silico de mEGFP e a sequência de vinculador, sem mutações de ponto foi necessária para interromper o potencial crRNA de reconhecimento e clivagem pela Cas9 da sequência de doador (Figura 1). A sequência de doador continha armas de homologia de 1KB flanqueando a ambas as extremidades da sequência mEGFP-linker. O resultante 2.734 bp de DNA foi clonado em um backbone de pUC57, sequência verificada, e o plasmídeo de modelo doador resultante foi purificado usando um livre de endotoxinas maxi prep. O plasmídeo de modelo do doador e o complexo RNP foram transfectadas, presumidamente editadas células foram enriquecidas e a localização da proteína de fusão nuclear-mEGFP lamina B1 foi confirmada por microscopia de fluorescência (Figura 2). Apenas os resultados do transfection crRNA1 são descritos aqui, embora ambas as sequências de crRNA produziram populações presumidamente editado12.
Quando comparado com o controle negativo, que continha sem gRNA, proteína Cas9 ou plasmídeo de modelo doador na reação de eletroporação (reserva apenas), o crRNA1 LMNB1 transfectadas células continham células de mEGFP-positivo de 0,95% representando o presumidamente editado população de B1 lamina mEGFP-nuclear (Figura 3a). Este resultado foi dentro do intervalo de batida-em eficiência observada através de muitos loci genômicos usando este método, como relatado anteriormente,12.
As células mEGFP-positivo foram isoladas por FACS e fotografadas por microscopia ao vivo para confirmar a localização esperada da proteína de fusão de B1 lamina mEGFP nucleares para o envelope nuclear. Após o enriquecimento de FACS, aproximadamente 90% das células classificadas da população crRNA1 LMNB1 foram mEGFP-positivo (conforme determinado pela microscopia), sugerindo que algumas células de mEGFP-negativo co purificadas com as células GFP-positivo durante o procedimento de classificação. Isto foi um nível aceitável de enriquecimento que permitiu para a colheita de 96 clones que poderia então ser geneticamente selecionados para edição de sucesso. Geralmente, um recorte para o enriquecimento de sucesso é de 50% positivo GFP.
A maioria da população classificada celular exibida fluorescência para o envelope nuclear (nuclear periferia) nas células nondividing e para uma lâmina nuclear estendida no citoplasma durante a confiança fornecendo mitose na correcta genômica editar ao LMNB1 Locus. A população enriquecida continha células com sinal luminosa ou fraca. Esta diferença de intensidade de sinal pode refletir uma combinação de correto e incorreto, resultados e destaques a utilidade de gerar uma linha clonal geneticamente validada para mais estudos (ver discussão) de edição (Figura 3b)12. Após a geração de linha clonal, validado geneticamente células mostrou intensidade uniforme de GFP em experimentos de microscopia (Figura 3C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58130/58130fig1.jpg"> Figura 1 . Desenha estratégia para marcação de GFP N-terminal do gene LMNB1. A tag GFP foi projetada para 5ʹ de inserção do N-terminal do primeiro exon de LMNB1 localizado no cromossoma 5. Homologia tanto 5ʹ e 3ʹ de armas são 1 kb cada encontro entre o códon de início (ATG) e o segundo codão (braços de homologia apenas parcialmente representados na figura). Dois candidatos crRNAs foram projetados para guiar Cas9 para trilhar o mais próximo do local de inserção pretendido quanto possível, enquanto ainda está sendo exclusivo no genoma. Sequência de mEGFP e um aminoácido vinculador foram inseridas apenas 3ʹ do códon de início (sequência de mEGFP e o vinculador não está à escala). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58130/58130fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58130/58130fig2.jpg"> Figura 2 . Fluxo de trabalho para produzir endogenamente marcou linhas clonal hiPSC. Componentes de transfeccao, incluindo o complexo RNP Cas9/crRNA/tracrRNA (mostrado em vermelho Cas9 proteína com crRNA de ouro e púrpura tracrRNA), o plasmídeo de modelo de doadores contendo os braços de homologia (HAs, mostrados em ouro) e FP + sequência de vinculador (mostrado em verde), foram electroporated. Após 4 dias, as células de FP-positivo presumidamente editada foram enriquecidas pela FACS e expandiu-se como uma população semeando todas as células classificadas em um único poço de uma placa de 96 poços (~ 1.000 células) e depois expandidas em cultura até uma população activa de vários milhões células podem ser analisadas como "população enriquecida" (ver protocolo passo 3.8). O rendimento das células FP-positivo difere pelo experimento devido a taxas variáveis de HDR12; um enriquecimento sucesso tipicamente pode incluir ~ 300-5.000 células após a transfeccao de aproximadamente 1,6 x 106 quadris. Estudos de imagiologia preliminares confirmaram o sinal e a localização da proteína de fusão na população enriquecida. Colônias foram escolhidas manualmente em uma placa de 96 poços para expansão e criopreservação. Mais seleção genômica de controle de qualidade usando gotículas digital PCR (ddPCR) e outros ensaios baseados em PCR foram utilizadas para identificar corretamente editados clones, como descrito anteriormente,12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58130/58130fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58130/58130fig3.jpg"> Figura 3 . Enriquecimento de populações de células presumidamente editado. (A) parcelas de citometria de fluxo da LMNB1 edição do transfection pós de quatro dias de células. O eixo y mostra a intensidade GFP e eixo x apresenta dispersão para a frente. Classificação portões foram definidas com baseadas no controle somente reserva. Desde que hiPSCs são sensíveis à perturbação, vivo/morto mancha foi omitida e um portão muito conservadora do FSC/SSC foi usado em vez disso. (B) após o enriquecimento, a população de Cr1 LMNB1 edição células mostrou ~ 90% de células com GFP localizando no envelope nuclear (esperado LMNB1 localização). A população continha células de intensidade variável de GFP, bem como algumas células GFP-negativo. Barras de escala são 10 mícrons. (C) após a geração de linha clonal, células mostraram uma intensidade uniforme de GFP, com algumas diferenças dependentes do ciclo celular. Barra de escala é 20 mícrons.

Aqui descrito é um protocolo para marcação endogenamente expressas proteínas com etiquetas fluorescentes em células-tronco pluripotentes induzidas humana usando CRISPR/Cas9. Células presumidamente editadas são enriquecidas por fluorescência ativada celular classificação e linhas celulares clonal são geradas.

Proteína endógena de marcação em humanos induzida por células-tronco pluripotentes usando CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

O objetivo deste protocolo é gerar células-tronco pluripotentes induzidas por humanos que expressam proteínas de fusão endógenas fundidas para placas fluorescentes terminais N ou C do quadro final. Para alcançar o knock in desejado, usamos o sistema CRISPR-Cas9 e uma abordagem baseada em ribonucleoproteína usando a proteína Cas9 de S.pyogenes do tipo selvagem e um RNA CRSPR sintético de duas partes e tracrRNA. Este RNP é co-entregue com a sequência de marcação fluorescente desejada como um plasmídeo doador via eletroporação.Células supostamente editadas que expressam a proteína marcada com fluorescência são enriquecidas por FACS. As linhas clonais são então geradas para análise de resultados de edição precisos. Este protocolo de edição de genes tem muitas vantagens sobre as construções tradicionais de superexpressão.Como uma marca fluorescente é introduzida no genoma, a localização subcelular e a dinâmica da proteína de fusão resultante podem ser estudadas sob controle regulatório endógeno. Aqui usamos células-tronco pluripotentes induzidas como um sistema modelo porque nos permite estudar as proteínas marcadas em células diploides não transformadas. Além disso, como as células podem ser diferenciadas em vários tipos de células, como as células cardiomiócitos mostradas aqui, essa abordagem oferece a oportunidade de criar e estudar proteínas marcadas em uma variedade de contextos celulares isogênicos.No entanto, com uma otimização cuidadosa, esse protocolo pode ser adaptado para editar os genomas de outros tipos de células de mamíferos. Olá, sou Amanda Haupt, faço parte da equipe de células-tronco e edição de genes aqui no Allen Institute for Cell Science. Hoje, usamos essa abordagem para gerar mais de 35 linhagens celulares diferentes que expressam proteínas de fusão endógenas.Nós os usamos para estudar uma ampla variedade de estruturas e processos celulares únicos. Essa abordagem foi bem-sucedida em até 95% dos loci tentados até o momento com nosso grupo. Este método será particularmente útil para biólogos celulares interessados em entender melhor a dinâmica de uma proteína em células vivas.No entanto, uma vez que as linhagens clonais editadas são geradas, as possibilidades de estudo são infinitas. Com este método, somos capazes de identificar consistentemente clones que possuem marcadores de proteína fluorescente monoalélica sem quaisquer outras interrupções na sequência genômica. Ocasionalmente, também podemos obter clones editados biaelicamente.Neste vídeo, mostraremos algumas das principais etapas na transfecção, enriquecimento de FACS e isolamento de linhagens celulares clonais que expressam proteínas de fusão fluorescentes reguladas endogenamente. Duas a três horas antes da transfecção, trate as hiPSCs com dez inibidores micromolares de ROCK suplementados em meios de crescimento. Isso promoverá a sobrevivência após a eletroporação.As células terão aparência pontiaguda após este tratamento. As células devem ser removidas da placa de fechamento do tecido usando uma única região de dissociação celular e a suspensão celular coletada em um tubo cônico antes da transfecção. Preparar uma alíquota de 1,84 vezes 10 elevado às seis células para cada condição experimental a ser transfectada.Prepare tubos complexos de ribonucleoproteína para cada transfecção adicionando 2,88 microlitros de RNA guia de 10 micromolares e 2,88 microlitros de Cas9 micromolar a um tubo de 1,5 mil. Incubar à temperatura ambiente durante um mínimo de 10 minutos, um máximo de uma hora. Granular a alíquota da célula preparada no passo anterior a 211 vezes G durante três minutos à temperatura ambiente.Em seguida, aspire o sobrenadante e corra para girar o pellet celular em 220 microlitros de tampão de eletroporação. Adicione 220 microlitros de células ressuspensas ao tubo complexo RNP de 1,5 mil previamente preparado. Adicione 4,6 microlitros de um micrograma por plasmídeo doador de microlitro.Use a ponta de nucleofecção e a pipeta para misturar os dois conteúdos duas a três vezes e, em seguida, transfira cem microlitros de suspensão para o dispositivo de eletroporação preparado. Evite introduzir bolhas na ponta. Aplique mil e trezentos volts por um pulso de trinta milissegundos.Transfira suavemente a suspensão para uma placa de seis poços com um movimento giratório. Disperse as células movendo suavemente a placa de um lado para o outro e da frente para trás. Depois de repetir para todas as condições experimentais e controles, incubar células transfectadas a 37 graus Celsius e 5% de CO2 por 24 horas, mudando o meio para meio de crescimento regular sem inibidor de ROCK em 24 horas.Em seguida, continue a alimentar os hiPSCs a cada 24 horas por 72 a 96 horas monitorando sua confluência. Quando os hiPSCs atingirem 68 a 80% de confluência, prossiga para o enriquecimento do FACS. Duas a três horas antes da transfecção, trate hiPSCs com inibidor de ROCK 10 micromolar suplementado no meio de crescimento para promover a sobrevivência após o enriquecimento de FACS.Para classificar as células, remova-as da placa usando o reagente de dissociação de célula única e, em seguida, filtre a suspensão hiPSC através de um filtro de malha de 35 mícrons em tubos de poliestireno de fundo redondo. Classifique as células usando dispersão direta e lateral, incluindo: altura versus largura, detritos de trigêmeos e dublês. Use células de controle somente de buffer ao vivo para definir a porta positiva do FP, de modo que menos de 1,1% das células somente de buffer caiam dentro da porta.Ao classificar as células-tronco, adapte as configurações do instrumento para promover a sobrevivência celular, conforme sugerido na seção de discussão. A batida típica nas eficiências, conforme determinado pela porcentagem de células positivas FP pelo FACS, pode variar de 0,1% a 5% Classifique as células em um tubo de polipropileno de 1,5 a 15 mil contendo 0,5 a 2 mils de meio de crescimento à temperatura ambiente suplementado com inibidor de ROCK de 10 micromolares. Centrifugar as células recolhidas a 211 vezes G durante três minutos à temperatura ambiente.Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 200 microlitros de meio de crescimento suplementado com inibidor de ROCK 10 micromolar. Transfira até três mil células variadas para um único poço de uma placa de 96 poços revestida com matrigel fresco. Incubar células classificadas a 37 graus Celsius em 5%CO2 por 24 horas, mudando o meio para meio de crescimento suplementado com inibidor de ROCK 5 micromolar em 24 horas.Em seguida, às 48 horas, continue alimentando as células com meios de crescimento regulares, sem inibidor de ROCK a cada 24 horas por 72 a 96 horas monitorando a confluência. Uma vez que as células estejam maduras o suficiente para serem passadas para fora da placa de 96 poços, recomendamos passá-las gradualmente para placas maiores. Então, por exemplo, de um poço de uma placa de 96 poços, mova-os para um ou dois poços de uma placa de 24 poços.E então de lá para uma placa de 6 poços, etc., até que você tenha células suficientes para fins a jusante. Geralmente três a quatro milhões de células no mínimo. Para gerar linhas clonais da população enriquecida FACS de células editadas punitivamente, passe para suspensão de célula única e coloque dez mil células em uma placa de 10 centímetros e permita que as colônias cresçam por cinco a sete dias.Quando as colônias são visíveis macroscopicamente, elas são grandes o suficiente para serem isoladas. Em um microscópio de dissecação, use uma pipeta P200 para raspar e aspirar suavemente colônias individuais da superfície da placa. Transfira o volume contendo a colônia para um único poço da placa de 96 poços.Depois que todas as colônias forem transferidas, incube a placa em uma incubadora de cultura de tecidos a 37 graus Celsius e 5% de CO2 por 24 horas. Troque o meio para meio de crescimento regular sem inibidor de ROCK em 24 horas. Em seguida, continue alimentando as células a cada 24 horas por 72 a 96 horas até que as colônias tenham aproximadamente triplicado de tamanho.As células precisarão ser cultivadas e passadas em placas de 96 poços para ter células suficientes para criopreservar antalise para extração de DNA genômico. Consulte o protocolo escrito para obter mais detalhes. Para passar em placas de 96 poços, use um aspirador de oito canais para remover e descartar a mídia da primeira coluna.Usando uma pipeta multicanal P200, adicione cerca de 200 microlitros de DPBS à primeira coluna da placa para lavar as células. Usando um aspirador de oito canais, remova e descarte a lavagem DPBS da primeira coluna. Em seguida, adicione 40 microlitros de reagente de dissociação à primeira coluna.Repita essas etapas trabalhando uma coluna de cada vez para até um total de seis colunas da placa de 96 poços. Troque as pontas para ter certeza de não contaminar os poços. Colocar a placa na incubadora durante três a cinco minutos a partir do momento em que o reagente de dissociação foi adicionado à primeira coluna.Quando as células na primeira coluna da placa começarem a se levantar do fundo, use uma pipeta multicanal P200 para adicionar 160 microlitros de DPBS à primeira coluna e triture suavemente as células nas posições de 12 horas, 3 horas, 6 horas e 9 horas de cada poço. Transfira todo o volume com suspensão de células para uma placa de 96 poços com fundo em V. Repita essas etapas para as colunas restantes que possuem reagente de dissociação, trocando as pontas para não contaminar os poços.Girar a placa de fundo em V na centrífuga a 385 vezes G durante três minutos à temperatura ambiente. Os sub mostrados até este ponto para 96 passagens de poços são realizados da mesma maneira sempre que as células são passadas neste formato de placa. A seguir, mostraremos como proceder se você estiver pronto para criopreservar as células no formato de 96 poços.Consulte o protocolo escrito para obter mais informações. Após a etapa de centrifugação mostrada na seção anterior, aspire o sobrenadante usando uma pipeta multicanal P200 e, em seguida, ressuspenda em 60 microlitros de meio de crescimento suplementado com inibidor de ROCK 10 micromolar. Repita para todos os poços, trocando as pontas para não contaminar cruzadamente.Transfira 30 microlitros de suspensão celular para uma placa de cultura de tecidos de 96 poços não revestida com matrigel. Transfira os 30 microlitros restantes de suspensão para uma placa irmã e, em seguida, adicione rapidamente 170 microlitros de tampão de congelamento a cada poço sem misturar. Observe que esse processo é feito em placas irmãs duplicadas, de modo que exista uma população de células de backup após o descongelamento de uma das placas individuais.Colocar células criopreservadas em apenas todas as outras colunas da placa de 96 poços permite um descongelamento mais rápido. Enrole o prato com parafilme e coloque-o em uma caixa de isopor em temperatura ambiente com tampa. Coloque a caixa inteira no freezer de 80 graus Celsius negativos.Após 24 horas, as placas podem ser transferidas para fora da caixa de isopor e classificadas a 86 graus Celsius negativos por até quatro semanas. A criopreservação de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos em formato de 96 poços permite uma quebra temporal na cultura de células. O pesquisador pode realizar ensaios de validação genômica nas minas clonais para identificar os clones geneticamente desejáveis para descongelar para estudos futuros.Quatro dias após a transfecção da linha WTC hiPSC com uma proteína Cas9 de RNA guia específico e um plasmídeo modelo de doador cuidadosamente projetado, observou-se que 0,95% das células expressavam GFP. O FACS foi usado para classificar todas as células positivas para GFP como uma população enriquecida. Estudos preliminares de microscopia revelaram a localização esperada da proteína de fusão da lâmina nuclear B1 mEGFP no envelope nuclear.A proteína marcada com fluorescência foi observada em cerca de 95% das células com intensidades variadas. Após a geração da linhagem clonal, clones com intensidade uniforme de mEGFP foram obtidos e posteriormente analisados para edição precisa. Para concluir, mostramos um método de transfecção para edição de genes de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos para a expressão de proteínas de fusão fluorescentes reguladas endogenamente.Como as ineficiências típicas de detonação são baixas, algumas estratégias de enriquecimento, como o método FACS mostrado aqui, resultam em uma população de células supostamente editadas expressando a proteína de fusão. A população enriquecida pode ser usada para estudos biológicos ou linhas clonais podem ser geradas conforme descrito neste método, tornando possível identificar linhas celulares que são editadas com precisão por genes. É importante lembrar que as quebras de fita dupla induzidas por Cas9 no genoma são frequentemente reparadas de forma imprecisa, apesar da incorporação da etiqueta no locus pretendido.Além disso, em clones editados monoalelicamente, o alelo não marcado freqüentemente contém indels provavelmente causados por reparo de junção de extremidade não homólogo. Essas descobertas ressaltam a importância da validação genética após uma batida de CRISPR Cas9 revelada apenas por meio da análise do genoma de linhagens celulares clonais. A expressão da proteína de fusão esperada por si só não garante uma edição precisa.Ao usar este protocolo para editar células-tronco pluripotentes induzidas por humanos, tome cuidado para seguir as recomendações detalhadas no protocolo escrito para garantir o manuseio suave das células para uma sobrevivência celular ideal e diferenciação espontânea mínima. Esperamos que este vídeo e a lista de protocolos e materiais associados ajudem você a realizar experimentos semelhantes em seu próprio laboratório com sua proteína favorita. Obrigado por assistir.

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Ferramentas de edição de genoma, como o sistema CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (associado a CRISPR), melhoraram muito a eficiência do direcionamento de genes em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs). Este manuscrito descreve um protocolo para geração de repórter hiPSC específico de linhagem usando recombinação homóloga assistida por sistema CRISPR/Cas.

Geração eficiente de hiPSC Neurais Lineage Repórteres Knockin específica usando o CRISPR / Cas9 e Cas9 Duplo Nickase Sistema

Protocolos para gerar linhagens mutantes HPSC usando a plataforma iCRISPR e diferenciar hPSCs em células ß-like glicose-responsivos são descritos. Combinando tecnologia de edição de genoma com a diferenciação HPSC-dirigida fornece uma plataforma poderosa para a análise sistemática do papel das determinantes da linhagem no desenvolvimento humano e progressão da doença.

Genoma Edição e Directed Diferenciação de hPSCs para interrogar Determinantes Lineage no desenvolvimento pancreático humano

Este protocolo descreve detalhadamente a geração de células-tronco livre pegada pluripotentes induzidas (iPSCs) de células do pâncreas humanas em condições de livre de alimentador, seguido pela edição usando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteínas e caracterização de modificado clones de célula única.

Eficiente geração e edição de IPSCs livre de alimentador de células pancreáticas humanas utilizando o sistema CRISPR-Cas9

Aqui, nós apresentamos um protocolo de apagamento exon23 baseado em Cas9 para restaurar a expressão de distrofina em iPSC de fibroblastos de pele derivados do mouseMDX DMD e diferenciar diretamente iPSCs em células progenitoras miogênicas (MPC) usando o sistema de ativação Tet-on MyoD.

Tecnologia CRISPR/Cas9 na restauração da expressão de distrofina em progenitores musculares derivados de iPSC

Este protocolo fornece um método para facilitar a geração de mudanças heterozygous ou homozygous definidas do nucleotide usando CRISPR-CAS9 em pilhas de haste pluripotentes humanas.

Geração de modificações genómicas definidas usando CRISPR-CAS9 em células-tronco pluripotentes humanas

Aqui, descrevemos um método detalhado para edição de genes sem costura em células-tronco pluripotentes humanas usando um plasmídeo doador baseado em piggyBac e o mutante Cas9 nickase. Duas mutações pontuais foram introduzidas no éxon 8 do locus do fator nuclear 4 alfa do hepatócito (HNF4α) em células-tronco embrionárias humanas (hESCs).

Introduzindo mutações pontuais em células-tronco pluripotentes humanas usando edição de genoma contínua

Este protocolo usa repórteres fluorescentes e classificação celular para simplificar experimentos de knock-in em linhas de células macrófagos e t. Dois plasmídeos são usados para esses experimentos simplificados de knock-in, ou seja, um plasmídeo de expressão CRISPR/Cas9 e DsRed2 e um plasmídeo de recombinação homólogo que expressa EBFP2, que está permanentemente integrado no lócus Rosa26 em células imunes.

Gene Knock-in por CRISPR/Cas9 e Classificação celular em linhas de células macrófagos e t

Aqui, apresentamos um protocolo simplificado de marcação gênica endógena para Drosophila, que utiliza uma técnica baseada em PCR para identificação livre de marcadores de modificações genéticas bem-sucedidas, facilitando o desenvolvimento de linhagens estáveis.

Estratégia baseada em CRISPR em uma etapa para marcação gênica endógena em Drosophila melanogaster

A Biotinilação Iluminada Restrita por Localização específica (ALIBi) é um método optogeneticamente ativado inovador desenvolvido para marcar e purificar populações subcelulares de ribossomos para sequenciamento a jusante e análise proteômica.

Isolamento de Subpopulações Subcelulares de Ribossomo Baseado em Biotinilação Iluminada Aprimorada por Localização Específica de Etiquetas Peptídicas Recombinantes

O método apresentado descreve a geração de um nocaute gênico mediado por CRISPR na linhagem H9 de células-tronco embrionárias humanas (hESC), que expressa de forma estável sgRNAs direcionados ao gene L2HGDH usando um sistema de entrega de genes mediado por lentivírus altamente eficiente.

Deleção gênica mediada por CRISPR-Cas9 em células-tronco pluripotentes humanas cultivadas em condições livres de alimentador

Um fluxo de trabalho de microinjeção CRISPR/Cas9 para marcação fluorescente endógena na linha germinativa de Caenorhabditis elegans , visando obter linhas homozigotas knock-in para análise in vivo de localização de proteínas.

Marcação Endógena Fluorescente Mediada por CRISPR/Cas9 de Genes Específicos da Linhagem Germântica em Caenorhabditis elegans

Aprenda a marcar proteínas endógenas em células-tronco pluripotentes humanas usando CRISPR/Cas9 e FACS. Este método permite estudar dinâmicas proteicas sob controle regulatório endógeno em células vivas.

Proteína endógena de marcação em humanos induzida por células-tronco pluripotentes usando CRISPR/Cas9

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