Name: In Vitro Reconstituição de auto-organização padrões de proteína na Bilayers do Lipid suportados (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Aprenda a reconstituir padrões de auto-organização de proteínas MinD e MinE em bicamadas lipídicas suportadas usando microcompartimentos de PDMS. Este método permite controle preciso da formação de padrões em estudos de biologia celular e biofísica.

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Agradecemos a Michael Heymann e Frank Siedler para produção de silício wafers, Core Facility MPI-B para obter assistência na purificação de proteínas e Simon Kretschmer e Leon Harrington para comentários sobre o manuscrito.

<ol><li>Soh, S., Byrska, M., Kandere-Grzybowska, K., Grzybowski, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaction-diffusion+systems+in+intracellular+molecular+transport+and+control%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chemie+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Reaction-diffusion systems in intracellular molecular transport and control.</a> Angew Chemie Int Ed. 49 (25), 4170-4198 (2010).</li>
<li>Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ParA%2FMinD+family+puts+things+in+their+place%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The ParA/MinD family puts things in their place.</a> Trends Microbiol. 20 (9), 411-418 (2012).</li>
<li>Shih, Y. -L., Zheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+control+of+the+cell+division+site+by+the+Min+system+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Spatial control of the cell division site by the Min system in Escherichia coli.</a> Environ Microbiol. 15 (12), 3229-3239 (2013).</li>
<li>Halatek, J., Frey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+canalized+MinD+transfer+and+MinE+sequestration+explain+the+origin+of+robust+MinCDE-protein+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Highly canalized MinD transfer and MinE sequestration explain the origin of robust MinCDE-protein dynamics.</a> Cell Rep. 1 (6), 741-752 (2012).</li>
<li>Raskin, D. M., De Boer, P. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MinDE-dependent+pole-to-pole+oscillation+of+division+inhibitor+MinC+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">MinDE-dependent pole-to-pole oscillation of division inhibitor MinC in Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 181 (20), 6419-6424 (1999).</li>
<li>Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Ries, J., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+regulators+for+bacterial+cell+division+self-organize+into+surface+waves+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spatial regulators for bacterial cell division self-organize into surface waves in vitro.</a> Science. 320 (5877), 789-792 (2008).</li>
<li>Wu, F., van Schie, B. G. C., Keymer, J. E., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symmetry+and+scale+orient+Min+protein+patterns+in+shaped+bacterial+sculptures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Symmetry and scale orient Min protein patterns in shaped bacterial sculptures.</a> Nat Nanotechnol. 10 (June), 719-726 (2015).</li>
<li>Hu, Z., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topological+regulation+of+cell+division+in+E.+coli%3A+Spatiotemporal+oscillation+of+MinD+requires+stimulation+of+its+ATPase+by+MinE+and+phospholipid%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Topological regulation of cell division in E. coli: Spatiotemporal oscillation of MinD requires stimulation of its ATPase by MinE and phospholipid.</a> Mol Cell. 7 (6), 1337-1343 (2001).</li>
<li>Meinhardt, H., de Boer, P. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+in+Escherichia+coli%3A+A+model+for+the+pole-to-pole+oscillations+of+Min+proteins+and+the+localization+of+the+division+site%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Pattern formation in Escherichia coli: A model for the pole-to-pole oscillations of Min proteins and the localization of the division site.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (25), 14202-14207 (2001).</li>
<li>Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+self-organizing+protein+gradients+as+spatial+cues+in+cell-free+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of self-organizing protein gradients as spatial cues in cell-free systems.</a> Elife. 3, e03949(2014).</li>
<li>Roberts, M. A. J., Wadhams, G. H., Hadfield, K. A., Tickner, S., Armitage, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ParA-like+protein+uses+nonspecific+chromosomal+DNA+binding+to+partition+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">ParA-like protein uses nonspecific chromosomal DNA binding to partition protein complexes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (17), 6698-6703 (2012).</li>
<li>Vecchiarelli, A. G., Mizuuchi, K., Funnell, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfing+biological+surfaces%3A+Exploiting+the+nucleoid+for+partition+and+transport+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Surfing biological surfaces: Exploiting the nucleoid for partition and transport in bacteria.</a> Mol Microbiol. 86 (3), 513-523 (2012).</li>
<li>Thanbichler, M., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MipZ%2C+a+spatial+regulator+coordinating+chromosome+segregation+with+cell+division+in+Caulobacter%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MipZ, a spatial regulator coordinating chromosome segregation with cell division in Caulobacter.</a> Cell. 126 (1), 147-162 (2006).</li>
<li>Lim, H. C., Surovtsev, I. V., Beltran, B. G., Huang, F., Bewersdorf, J., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+DNA-relay+mechanism+in+ParABS-mediated+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Evidence for a DNA-relay mechanism in ParABS-mediated chromosome segregation.</a> Elife. 3, e02758(2014).</li>
<li>Mileykovskaya, E., Fishov, I., Fu, X., Corbin, B. D., Margolin, W., Dowhan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+phospholipid+composition+on+MinD-membrane+interactions+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Effects of phospholipid composition on MinD-membrane interactions in vitro and in vivo.</a> J Biol Chem. 278 (25), 22193-22198 (2003).</li>
<li>Renner, L. D., Weibel, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiolipin+microdomains+localize+to+negatively+curved+regions+of+Escherichia+coli+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cardiolipin microdomains localize to negatively curved regions of Escherichia coli membranes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (15), 6264-6269 (2011).</li>
<li>Ivanov, V., Mizuuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+modes+of+interconverting+dynamic+pattern+formation+by+bacterial+cell+division+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Multiple modes of interconverting dynamic pattern formation by bacterial cell division proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8071-8078 (2010).</li>
<li>Caspi, Y., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+out+Min+protein+patterns+in+fully+confined+fluidic+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Mapping out Min protein patterns in fully confined fluidic chambers.</a> Elife. 5, e19271(2016).</li>
<li>Vecchiarelli, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-bound+MinDE+complex+acts+as+a+toggle+switch+that+drives+Min+oscillation+coupled+to+cytoplasmic+depletion+of+MinD%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Membrane-bound MinDE complex acts as a toggle switch that drives Min oscillation coupled to cytoplasmic depletion of MinD.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), E1479-E1488 (2016).</li>
<li>Kretschmer, S., Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+modulation+of+reconstituted+Min+protein+patterns+and+gradients+by+defined+mutations+in+MinE%27s+membrane+targeting+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Large-scale modulation of reconstituted Min protein patterns and gradients by defined mutations in MinE's membrane targeting sequence.</a> PLoS One. 12 (6), e0179582(2017).</li>
<li>Schweizer, J., Loose, M., Bonny, M., Kruse, K., Monch, I., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometry+sensing+by+self-organized+protein+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Geometry sensing by self-organized protein patterns.</a> Proc Natl Acad Sci. 109 (38), 15283-15288 (2012).</li>
<li>Martos, A., Raso, A., Jiménez, M., Petrášek, Z., Rivas, G., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FtsZ+polymers+tethered+to+the+membrane+by+ZipA+are+susceptible+to+spatial+regulation+by+min+waves%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">FtsZ polymers tethered to the membrane by ZipA are susceptible to spatial regulation by min waves.</a> Biophys J. 108 (9), 2371-2383 (2015).</li>
<li>Vecchiarelli, A. G., Li, M., Mizuuchi, M., Mizuuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+affinities+of+MinD+and+MinE+to+anionic+phospholipid+influence+Min+patterning+dynamics+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Differential affinities of MinD and MinE to anionic phospholipid influence Min patterning dynamics in vitro.</a> Mol Microbiol. 93 (3), 453-463 (2014).</li>
<li>Glock, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+control+of+a+biological+reaction-diffusion+system%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chemie+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Optical control of a biological reaction-diffusion system.</a> Angew Chemie Int Ed. 57 (9), 2362-2366 (2018).</li>
<li>Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+pole-to-pole+oscillations+of+min+proteins+in+microengineered+polydimethylsiloxane+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chemie+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of pole-to-pole oscillations of min proteins in microengineered polydimethylsiloxane compartments.</a> Angew Chemie Int Ed. 52 (1), 459-462 (2013).</li>
<li>Miyagi, A., Ramm, B., Schwille, P., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Speed+Atomic+Force+Microscopy+Reveals+the+Inner+Workings+of+the+MinDE+Protein+Oscillator%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">High-Speed Atomic Force Microscopy Reveals the Inner Workings of the MinDE Protein Oscillator.</a> Nano Lett. 18 (1), 288-296 (2017).</li>
<li>Ramirez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treadmilling+analysis+reveals+new+insights+into+dynamic+FtsZ+ring+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Treadmilling analysis reveals new insights into dynamic FtsZ ring architecture.</a> PLoS Biol. 16 (5), e2004845(2018).</li>
<li>Vogel, S. K., Petrasek, Z., Heinemann, F., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+motors+fragment+and+compact+membrane-bound+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Myosin motors fragment and compact membrane-bound actin filaments.</a> Elife. 2, e00116(2013).</li>
<li>Zieske, K., Schweizer, J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+topology+assisted+alignment+of+Min+protein+waves%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Surface topology assisted alignment of Min protein waves.</a> FEBS Lett. 588 (15), 2545-2549 (2014).</li>
<li>Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Herold, C., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Min+protein+patterns+emerge+from+rapid+rebinding+and+membrane+interaction+of+MinE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Min protein patterns emerge from rapid rebinding and membrane interaction of MinE.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (5), 577-583 (2011).</li>
<li>Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+geometry-modulated+protein+patterns+in+membrane+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reconstituting geometry-modulated protein patterns in membrane compartments.</a> Methods Cell Biol. 128, 149-163 (2015).</li>
<li>Gruenberger, A., Probst, C., Heyer, A., Wiechert, W., Frunzke, J., Kohlheyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+picoliter+bioreactor+for+microbial+single-cell+analysis%3A+fabrication%2C+system+setup%2C+and+operation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microfluidic picoliter bioreactor for microbial single-cell analysis: fabrication, system setup, and operation.</a> J Vis Exp. (82), e50560(2013).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Loose, M., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21545286">Protein self-organization: Lessons from the min system.</a> Annu Rev Biophys. 40, 315-336 (2011).</li>
<li>Arumugam, S., Petrašek, Z., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MinCDE+exploits+the+dynamic+nature+of+FtsZ+filaments+for+its+spatial+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MinCDE exploits the dynamic nature of FtsZ filaments for its spatial regulation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), E1192-E1200 (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Descrevemos um protocolo para a reconstituição em vitro de auto-organização MinCDE em planar suportadas bilayers do lipid e em lipídios BICAMADA coberto estruturas 3D, usando o exemplo de microestruturas PDMS de forma cilíndrica. A fim de obter dados valiosos destes ensaios, os fatores mais importantes para o controle são proteínas e membrana de qualidade.
Para garantir a qualidade da proteína, proteína em massa deve ser confirmada usando SDS-PAGE e espectrometria de massa. Além disso, deve ser verificado que as proteínas são solúveis e não agregados, usando analítico gel filtração ou difusão dinâmica da luz. Filtração de gel pode ser usada para remover qualquer fração de agregados de proteínas. Ajuste do pH cuidado e qualidade de nucleotídeos adicionados é crítico, como a adição de nucleótidos não-ajustadas ou parcialmente degradados à proteína estoques ou ensaios de auto-organização é suficiente para eliminar a atividade da proteína, abolindo, portanto auto-organização.
Ao lado da qualidade de proteína, qualidade da membrana é mais crítica e formação inadequada da membrana é frequentemente a causa para a auto-organização defeituosa e a origem das estruturas de superfície artefactual.
Ao executar o protocolo pela primeira vez, é útil rotular os bilayers do lipid suportados, incluindo lipídios rotulados como Atto-655-DOPE ou DiI em baixas percentagens de molares (0.05%). Assim, as propriedades e a qualidade da membrana podem ser julgados diretamente. Usando o FRAP, a fluidez da membrana pode ser avaliada. Além disso, um diretamente pode avaliar a qualidade da lavagem do SLB, pois lá será demais vesículas, sem membrana fluida ou sem membrana, se ele foi lavado. A abordagem de câmara aberta permite lavar rigorosamente a membrana e, portanto, também para remover as vesículas que estão furando na superfície do SLB. Os fatores mais cruciais para a obtenção de fluido e homogénea com suporte lipid bilayers são a limpeza e a Hidrofilia da superfície de apoio e o tamanho correto e homogeneidade de SUvs pode ser útil verificar o tamanho SUV e distribuição de tamanho usando Difusão dinâmica da luz. Para distribuições de tamanho estreito, recomendamos expulsando as vesículas ao invés de sonicating-los. Outros métodos de limpeza de lamelas, por exemplo, tratamentos com bases fortes, detergentes básicos ou usando lamelas diretamente após a lavagem com água, podem produzir bons resultados, dependendo da mistura do aplicativo e lipídios.
A primeira metade do protocolo apresentado aqui, em vitro reconstituição na bilayers planar lipid suportados nas câmaras de aberto, tem a vantagem de renderização da superfície acessível para microscopies ópticas, tais como TIRF microscopia30, FRAP análise6,34, bem como técnicas de sonda de superfície tais como a microscopia de força atômica26de rastreamento único-partícula. A grande área homogênea permite melhores estatísticas em concentrações definidas. Além da abordagem câmara aberta permite para controlar com precisão a concentração de proteína e uma adição rápida e simples de mais componentes, permitindo, portanto, para dosear a concentração de proteína em uma única câmara de20. O ensaio também pode ser expandido através da adição de outros componentes, divisome bacteriana como FtsZ22,35, ZipA22 ou o quimérico proteína FtsZ-YFP-MTS10,35.
Outros grupos têm tido uma abordagem similar para reconstituir o Min sistema em vitro, mas o uso de um fluxo de células em vez de uma câmara aberta17,18,19. Fluxo-as células têm certas vantagens, em especial quando um ambiente 3D totalmente fechado é necessário18, a influência do fluxo17,19,23 ou membrana composição23 sobre os padrões de MinCDE investigado, ou se os padrões de proteína devem ser observados sob proteína limitar condições19. No entanto, o controle local das concentrações moleculares é mais difícil. Componentes de proteínas, especialmente a mente, fortemente ligam à membrana encontram primeiro18,19. Em nossa experiência, as proteínas frequentemente exibem inespecificas de tubulação, enseadas, seringas e outras partes de microfluidic. Daí, as concentrações de proteína locais diferem das concentrações de entrada18 e também variam ao longo do comprimento da célula-fluxo, resultando em uma variedade de padrões diferentes de proteína na membrana entre entrada e saída, como observado por outros19.
A segunda metade do protocolo apresentado aqui, a reconstituição em vitro em microestruturas de forma cilíndrica, re-utilizando a abordagem de câmara aberta num suporte modelado coberto por lipídios bilayers permite uma simples mímica de comportamento de proteína na vivo controle preciso sobre as concentrações de proteína, embora seja perdido devido à remoção de tampão. Observe que porque o comprimento de onda de MinDE é sobre uma ordem de magnitude maior em vitro do que in vivo as microcompartments em forma de haste são também sobre uma ordem de magnitude maior (10 x 30 µm) do que uma haste em forma de e. coli célula.
Em geral, este protocolo permite o controle preciso de todas as condições, incluindo a concentração de proteína, composição de tampão e propriedades da membrana. O uso do 3D suporta estruturada permite que a reação a ser estudado sob confinamento espacial, imitando o comportamento na vivo sem a necessidade de equipamento de microfluídica complexo.

Spatiotemporal padrões são essenciais na natureza, regulação de tarefas complexas no nível celular e multicelular, da morfogênese regulamentado divisão celular1,2. Sistemas de reação-difusão desempenham um papel importante no estabelecimento desses padrões, mas são ainda não bem compreendidos. Um exemplo de um sistema de reação-difusão e o melhor sistema biológico caracterizado até agora é a Escherichia coli MinCDE sistema3,4,5,6,7. O sistema MinCDE oscila de polo de célula para polo de célula em Escherichia coli para determinar o meio da célula, como o site da divisão futura. Este sistema baseia-se na mente da ATPase, a activação da proteína, mina e a membrana como uma reação espacial matriz8ATPase. MinC não é parte do mecanismo de formação do teste padrão, mas é o agente funcional real: um inibidor da divisome principal proteína FtsZ5,6. MinC vincula-se à mente e, portanto, segue as oscilações, resultando em um gradiente de concentração de proteína a média de tempo que é máxima nos polos da célula e mínimas, quando no meio da célula, permitindo apenas FtsZ polimerizar em midcell9,10 . O sistema MinCDE é parte da maior família de Walker A ATPases que são fundamentais para a organização spatiotemporal em bactérias2, de posicionamento e transporte de proteína complexos11 e plasmídeos12 e para a regulação da célula Divisão13 cromossomo segregação e14. Portanto, o sistema de reação-difusão de MinCDE não só representa um sistema de reação-difusão arquetípica, mas também tem atraído a atenção por causa de sua relevância para a organização spatiotemporal em bactérias.
Estudos detalhados de funcionais do MinCDE sistema na vivo são complicados, como manipulação de exclusão proteínas e gene normalmente resultar em defeitos de divisão celular. Além disso, alterando a composição da membrana ou as propriedades do citosol na vivo é muito desafiador15,16. Mudanças para o sistema e influenciando fatores são difíceis de interpretar no complexo ambiente da célula, ainda mais se ele é meio louco em uma função tão essencial como a divisão celular. Nós e os outros têm, portanto, virou-se para uma abordagem reconstituição in vitro , reduzindo o sistema para seus componentes principais: mente, minha, ATP como fonte de energia e a bicamada lipídica com suporte como uma reação matriz6,17, 18. esta abordagem bottom-up permite sondar o mecanismo de auto-organização em detalhes sem a complexidade de uma célula viva. A forma de proteínas viajando superfície ondas6 e outros tipos de padrões de17,19 sob essas condições, embora com um comprimento de onda, que é geralmente sobre uma magnitude maior do que na vivo. O uso de uma câmara aberta facilita um controle preciso sobre todos os aspectos que influenciam a formação do teste padrão: as concentrações de proteína6, proteína propriedades20, membrana composição10, composição de tampão e concentração de ATP 6, bem como a adição de outros factores como apinhamento agentes21 e outras proteínas de divisome22. Em comparação, a reconstituição em vitro do sistema em uma pilha de fluxo18,19,23 MinCDE pode ser usada para investigar a influência do fluxo17,23, proteína limitar as condições19, membrana composição19 e confinamento 3D completo18 em padrões de proteína, mas processa um controle exato da concentração de proteína/componente e componente sequencial adição muito mais complicado.
Usando esta câmara aberta, nós também modelado o apoio dos bilayers do lipid planar pelo qual um pode sondar como geométricos limites influência padrão formação21, um fenômeno que tem recentemente sido também investigados na vivo usando bactérias moldado em microestruturas7. Também utilizamos este ensaio para investigar as mutações como definidas no meu afeto padrão de formação do sistema20. Além disso, o mesmo formato básico do ensaio foi empregado para investigar como formação padrão pode ser controlada pela luz, apresentando um peptídeo de mina azobenzeno-quitosana para o ensaio e imagem latente com TIRF microscopia24.
Nós achamos que, a fim de replicar o padrão de MinDE formação observados na vivo em um confinamento de sistema, em vitro foi chave. Usar microcompartments de forma cilíndrica, com dimensões ajustadas para o maior comprimento de onda de MinDE em vitro (10 x 30 µm), folheados ou chapeados de uma bicamada lipídica com suporte permitiu a reconstituição das oscilações de polo a polo de MinDE e formação de gradiente de proteína 10,25. Neste ensaio, os bilayers do lipid suportados são depositados sobre um substrato PDMS padronizado que contém várias centenas réplicas de microcompartments de forma cilíndrica que permanecem abertos na parte superior. Por isso, a reação pode ser configurada numa câmara aberta, e posteriormente o buffer é abaixado até a borda do microcompartments, confinando, assim, a reação a um volume pequeno. Mesmo que estes compartimentos têm uma interface ar-tampão de um lado e, portanto, não representam um confinamento 3D por membrana, a dinâmica da proteína imitada no vivo oscilações10,25. Comparado ao confinamento totalmente 3D, que mostra muito semelhante resultados18, o ensaio aberto microestruturas é relativamente simples e fácil de manipular e também pode ser realizada por laboratórios que não estejam equipados com equipamentos especializados microfluídica e instalações de salas limpas.
Aqui, apresentamos um protocolo experimental para reconstituir MinCDE formação padrão em suporte lipid bilayers em vitro usando uma câmara aberta que permite o controle de todos os componentes e fácil acesso por microscopia óptica e, com menor modificações, também é adaptável para técnicas de superfície-sonda26. Ao lado de bilayers planar com suporte lipídico, mostramos também como o confinamento de proteína pode ser obtido usando bilayers simples estampados com suporte lipídico na forma de microestruturas PDMS. Estes ensaios, apesar de otimizado para o sistema de MinCDE, também podem ser transferidos para outros sistemas de proteínas que interagem de forma semelhante com a membrana, tais como FtsZ27 ou um mínimo de actina córtex28.

<table><tbody><tr><td><forte>Reagentes</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti Lipídios Polares</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>DOPG</td><td>Avanti Lipídios Polares</td><td>840475</td><td></td></tr><tr><td>extrato lipídico polar de E.coli</td><td>Avanti Lipídios</td><td>Polares 100600</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina 5&prime;-trifosfato sal dissódico trihidratado</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adenosina 5&prime;-difosfato monopotássio sal di-hidratado</td><td>Sigma</td><td>A5285-1G</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>VWR</td><td>27810.295</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>Roth</td><td>9277.1</td><td></td></tr><tr><td>TCEP-HCl</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>20491</td><td></td></tr><tr><td>Tetraacetato de Etileno Diamina</td><td>Merck Millipore</td><td>1.08418.1000</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Sulfúrico 98%</td><td>Applichem</td><td>173163.1611</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de Hidrogênio 50%</td><td>Applichem</td><td>147064.1211</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Biomol</td><td>05288.1</td><td></td></tr><tr><td>dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Merck</td><td>102950</td><td>Uvasol</td></tr><tr><td>Glicerol 86%</td> <td>Roth</td><td>4043,1</td><td></td></tr><tr><td>TB meio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropil &beta; -D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG)</td> <td>Roth</td><td>2316.x</td><td></td></tr><tr><td>Atto-655-DOPE</td><td>Atto Tec</td><td>AD 655-161</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA agarose</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>PDMS base</td><td>Dow Corning Corporation</td><td></td><td>SYLGARD 184</td></tr><tr><td>Reticulador PDMS</td><td>Dow Corning Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>Materiais</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV Cola</td><td>Norland Produtos</td><td>6801</td><td>#68 e #63 ambos funcionam bem</td></tr><tr><td>Lamínulas #1.5 24x24 mm</td><td>Menzel Gl&auml; Capa de</td> lamínula #<td></td><td></td></tr><tr><td>1 24x24 mm</td><td>Menzel Gl&auml; ser</td><td></td><td>usado apenas para microestruturas PDMS</td></tr><tr><td>Tubo de reação de 0,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>&nbsp; </td><td></td>Balão</tr><tr><td>de cultura 0030123301 2L</td><td>Corning</td><td>, por exemplo, 734-1905</td><td></td></tr><tr><td>His-Trap HP</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coluna de gelfiltração: HiLoad Superdex 75 PG ou 200 PG</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Econo-Pac 10DG coluna de dessalinização coluna pré-embalada</td><td>Biorad</td><td>7322010</td><td></td></tr><tr><td>dispositivo de diálise: de diálise Slide-A-Lyzer, 3,5K MWCO, 0,1 - 0,5 mL ou 0,5-3 mL</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>66333 ou 66330</td><td></td></tr><tr>lâmina <td></td><td></td><td></td><td>de barbear</td></tr><tr><td><forte>Instrumentos</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>água ultrapura: Milli-Q Tipo 1 Sistemas de Água Ultrapura</td><td>Sistema automatizado</td> de purificação de proteínas Merck<td></td><td></td></tr><tr><td>: &Auml; kta Pure</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sonicador de banho</td><td>Branson</td><td></td><td>, por exemplo, misturador Modelo 1510</td></tr><tr><td>ARE-250</td><td>Thinky Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Limpador de plasma Zepto</td><td>Diener oxigênio de uso eletrônico</td><td></td><td>como pipetas de deslocamento positivo de gás de processo</td></tr><tr><td></td> Modelos <td>da marca</td><td></td><td>Transferpettor com pontas</td></tr> <tr><td>de vidroMicroscópio confocal de varredura a laser LSM780</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Equipado com Zeiss C-Apochromat 40X/1.20 objetiva de imersão em água</td></tr><tr><td>Plasmídeos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET28a-His-MinD_MinE</td><td>Departamento de Biofísica Celular e Molecular, MPI de Bioquímica, plasmídeo Prof. Schwille</td><td></td><td>que codifica His-MinD e MinE não marcado para melhorar o rendimento</td></tr><tr><td>pET28a-His-MinE</td><td>Departamento de Biofísica Celular e Molecular, MPI de Bioquímica, plasmídeo Prof. Schwille</td><td></td><td>que codifica His-MinE</td></tr><tr><td>pET28a-His-EGFP-MinD</td><td>Departamento de Biofísica Celular e Molecular, MPI de Bioquímica, Plasmídeo Prof. Schwille</td><td></td><td>que codifica His-EGFP-MinD</td></tr><tr><td>pET28a-His-mRuby3-MinD</td><td>Departamento de Biofísica Celular e Molecular, MPI de Bioquímica, Codificação de plasmídeo Prof. Schwille</td><td></td><td> His-mRuby3-MinD</td></tr><tr><td>pET28a-His-MinC</td><td>Departamento de Biofísica Celular e Molecular, MPI de Bioquímica, Prof. Schwille</td><td></td><td>plasmídeo que codifica His-MinC</td></tr></tbody></table>

in vitro reconstituição de auto-organização padrões de proteína na bilayers do lipid suportados

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

Muitos aspectos da organização spatiotemporal fundamental das células são regidos por sistemas do tipo de reação-difusão. In vitro a reconstituição desses sistemas permite estudos detalhados de seus mecanismos subjacentes que não seria viáveis in vivo. Aqui, nós fornecemos um protocolo para a reconstituição em vitro do sistema MinCDE de Escherichia coli, que posiciona o septo de divisão celular no meio celular. O ensaio é projetado para fornecer apenas os componentes necessários para a auto-organização, ou seja uma membrana, as duas proteínas mente e minas e energia sob a forma de ATP. Nós, portanto, fabricar uma câmara de reação aberta sobre uma lamela, no qual é formada uma bicamada lipídica com suporte. O projeto aberto da câmara permite a preparação ideal da bicamada lipídica e manipulação controlada do conteúdo em massa. As duas proteínas, mente e minas, bem como ATP, é adicionado para o volume em massa acima da membrana. Imagem é possível por muitos microscopies ópticos, como o projeto suporta confocal, campo largo e microscopia TIRF igual. Em uma variação do protocolo, a bicamada lipídica é formada num suporte padronizado, na forma de célula microestruturas PDMS, em vez de vidro. Reduzindo a solução em massa até a borda desses compartimentos inclui a reação em um compartimento de menor e fornece os limites que permitem imitar na vivo comportamento oscilatório. Tomados em conjunto, descrevemos os protocolos para reconstituir o sistema de MinCDE com e sem confinamento espacial, permitindo que pesquisadores precisamente controlar todos os aspectos que influenciam a formação de padrão, tais como intervalos de concentração e adição de outros factores ou proteínas e sistematicamente aumentar a complexidade do sistema em uma instalação experimental relativamente simples.

Purificação de proteínas, a seguir o nosso protocolo deve produzir proteínas Min de pureza adequada. Como referência, a Figura 1 fornece uma imagem de SDS-PAGE da mente, fluorescente rotulados mente, meu e do MinC. Os passos individuais do procedimento para realizar um ensaio de auto-organização de MinDE em bilayers não-modelados com suporte lipídico são descritos na Figura 2. Usando este protocolo, MinDE regular superfície ondas viajantes pode ser observado em toda a câmara (Figura 3). O comprimento de onda pode variar ligeiramente dentro da câmara, mas em geral os padrões parecem. As bordas da câmara não devem ser usadas para comparações quantitativas, como membranas que forma sobre a cola UV parece ter propriedades diferentes do que no vidro de superfície (ver Figura 3). As ondas de superfície itinerantes podem ser analisadas através da representação gráfica da intensidade ao longo da direção de propagação (Figura 3B). Enquanto mente fluorescência platôs bastante rápido da borda esquerda da onda e em seguida, diminui acentuadamente à aresta de fuga, mina fluorescência aumenta quase linearmente, desde o início da onda de mente e atinge o seu máximo depois mente à aresta de fuga, onde ele cai acentuadamente6.
Ao lado de qualidade de proteínas, a qualidade do bilayers do lipid suportados é mais crítica para uma self-Organização regular de MinCDE. Por um lado se a membrana é lavada também excessivamente ou a superfície subjacente foi limpada e, portanto, carregada também fortemente, buracos podem formar na membrana (figura 6A, topo). Por outro lado, se a membrana não é lavada corretamente ou a superfície subjacente não é limpo/hydrophilized, vesículas vão ficar com a membrana ou a fluidez da membrana pode ser comprometida (figura 6A, inferior). Embora não tão evidente como ao observar a membrana diretamente via rotuladas lipídios, estes problemas também podem ser detectados do sinal de fluorescência da mente, como os padrões não são regulares e a fluorescência no maxima não é homogênea, mas contém "buracos" ou pontos brilhantes como mostrado no painel médio da figura 6A.
Para a auto-organização de MinDE, em forma de microestruturas PDMS, o procedimento está resumido na Figura 4. Várias etapas de protocolo não precisam ser repetidos, como proteínas e lipídios podem ser reutilizados. Como em substratos não-padronizada, o substrato é limpo e hydrophilized (por plasma-limpeza), uma com suporte lipídica é formada sobre o PDMS e o ensaio de auto-organização é criado em um volume de 200 µ l. Para verificar que formou-se uma membrana apropriada e MinDE Self organiza na membrana, são imagens de câmaras. Quando uma membrana apropriada foi formada, formas de MinDE regular superfície ondas viajantes na superfície dos PDMS entre as microestruturas individuais e auto organiza também na parte inferior das microestruturas como as ondas podem livremente mover ao longo de todo superfície coberta de membrana (Figura 5A). Após a remoção do tampão, a superfície entre os compartimentos não deve apresentar qualquer propagação padrões de MinDE (Figura 5B), como deve ser totalmente seco. Se os padrões de MinDE são ainda em movimento, mais reserva precisa ser removido. As proteínas estão confinadas na microcompartments em forma de haste pela membrana-folheados PDMS e pelo ar na interface superior (Figura 5), no qual eles Self organizará.... Nestas condições as duas proteínas podem realizar oscilações de polo a polo, conforme mostrado na Figura 5. Como uma fração da mente e o meu é sempre membrana-limite, também durante a remoção do tampão, as concentrações após a remoção do tampão não são comparáveis às concentrações de entrada. Devido a este efeito as concentrações variam também entre microestruturas individuais na mesma lamela como eles dependem da posição dos padrões antes da remoção do tampão. Produção de bolacha de silício ou moldagem de PDMS do wafer de silício pode resultar em microestruturas incompletas que não podem ser usadas para análise (Figura 6B). Além disso, devido ao buffer de microestruturas de remoção podem secar durante o processo e, portanto, devem ser excluídas mais de análise (Figura 6B). Como resultado, apenas uma fração das microestruturas em uma câmara mostra as oscilações de polo a polo desejadas. Para analisar a dinâmica da proteína nas microestruturas, um kymograph pode ser obtido por uma seleção de desenho ao longo de toda a estrutura (Figura 5E). Quando MinCDE oscilar de polo a polo, MinC e mente mostrará um gradiente de concentração-a média de tempo com concentração máxima nos polos do compartimento e concentração mínima no meio do compartimento (Figura 5F).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig1.jpg"> Figura 1: mostrando os produtos finais de purificação da proteína de SDS-PAGE. Sua mente (33,3 kDa), His-eGFP-mente (60.1 kDa), His-mRuby3-mente (59,9 kDa), sua mina (13.9 kDa) e His-MinC (28,3 kDa) são mostradas em ordem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig2.jpg"> Figura 2: diagrama de fluxo de processo, mostrando os passos individuais e sincronismo do protocolo para a auto-organização na bilayers não-modelados com suporte lipídico (passos 1-6). Caixas tracejadas indicam que uma destas duas opções pode ser usada para a limpeza. Setas marcadas por círculos indicam onde o protocolo pode ser pausado e retomado mais tarde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig3.jpg"> Figura 3: imagem do ensaio de MinDE por microscopia confocal. A) Min Regular espiral, do qual velocidade de propagação da onda, a trama de intensidade e velocidade as medições podem ser obtidas. Concentrações utilizadas: 0,6 µM se importa (30% eGFP-mente), 1,8 µM sua mina-(30% sua-mina-Alexa647) B) enredo de intensidade normalizada de exemplo para a região marcada em r. C) visão geral da câmara de ensaio inteiro (barra de escala: 1 mm, as concentrações de proteína mesmo como acima). Espirais, transformando qualquer direção, bem como padrões de destino podem ser observados. A região ampliada mostra como padrões de onda diferem na UV-cola. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig4.jpg"> Figura 4: diagrama de fluxo de processo, mostrando os passos individuais e sincronismo do protocolo para auto-organização em microestruturas em forma de haste (passos 1-5, 7, 8). Caixas cinzentas indicam etapas onde os produtos podem ser reutilizados de protocolo na bilayers lipídico com suporte não-padronizada. Setas marcadas por círculos indicam onde o protocolo pode ser pausado e retomado mais tarde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig5.jpg"> Figura 5: formação em forma de PDMS microcompartments de padrão de resultados representativos para MinDE. A) MinDE se auto-organizar na superfície do PDMS formando ondas de superfície de viagem (se importa 1 µM (30% EGFP-mente), 2 µM meu e 2,5 mM ATP). B) após o buffer é reduzido para a altura das microestruturas, a auto-organização de proteína para na superfície planar entre o microcompartments. C) esquemático de um microcompartment de forma cilíndrica. D) imagens representativas das oscilações de polo a polo MinDE após a remoção do tampão. E) Kymograph das oscilações ao longo da linha realçada mostrada a D). F) imagem e perfil da intensidade média de fluorescência do tempo-série mostrada em D) mostrando claramente o gradiente de proteína que é máxima nos polos de microcompartment e mínima no meio do compartimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig6.jpg"> Figura 6: exemplos de resultados experimentais negativos. A) membranas over lavadas acumulam buracos, enquanto preparações suboptimal vesículas e composições lipídicas levam a degola de vesículas. Os painéis de dois centro mostram uma combinação de ambos os problemas e como eles se tornam visíveis quando observar oscilações de Min. Membranas foram rotuladas com 0.05% Atto655-DOPE. (barras de escala: 50 µm) B) painel superior: secou microcompartments pode ser causado por demasiado remoção de tampão ou quando o buffer evapora ao longo do tempo. Painel inferior: compartimentos incompletos podem ser formados durante a produção da bolacha ou moldagem de PDMS. (barras de escala: 30 µm) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Arquivo complementar 1: Mapa do plasmídeo para sua mente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/01_pET28a-MinD-MinE.gb%20" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo complementar 2: Mapa do plasmídeo para His-EGFP-mente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/02_pET28a-EGFP-MinD.gb" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo complementar 3: Mapa do plasmídeo para His-mRuby3-mente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/03_pET28a-mRuby3-MinD.gb" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo complementar 4: Mapa do plasmídeo para sua mina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/04_pET28a-MinE.gb" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo complementar 5: Mapa do plasmídeo para His-MinC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/05_pET28a-MinC.gb" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo complementar 6: Arquivo CAD para wafer de silício de microcompartments de forma cilíndrica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/JoVe_wafer_rod-like-structures_3x3.dwg" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Nós fornecemos um protocolo para in vitro ensaios de auto-organização da mente e da minha em uma bicamada lipídica suportados numa câmara aberta. Além disso, descrevemos como delimitar o ensaio em lipídios-folheados microcompartments PDMS para imitar as condições na vivo por confinamento de reação.

In Vitro Reconstituição de auto-organização padrões de proteína na Bilayers do Lipid suportados

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre a organização e as membranas das células, por exemplo, qual o papel que as pistas geométricas desempenham no processo. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite um controle preciso sobre todos os aspectos que influenciam a formação de padrões, como as concentrações de proteínas. Para começar, gere vesículas multilamelares conforme descrito no protocolo de texto.Agora, congele e descongele os lipídios por sete a 10 ciclos, preparando primeiro um béquer com água a 70 a 99 graus Celsius em uma placa quente, bem como um recipiente contendo nitrogênio líquido. Segure o frasco para injetáveis em nitrogênio líquido com uma pinça grande até que o nitrogênio pare de ferver. Em seguida, transfira o frasco para água quente até que a solução esteja completamente descongelada.Repita essas etapas até que a mistura lipídica pareça clara aos olhos, dependendo da mistura. Em seguida, monte uma extrusora de lipídios e pré-enxágue o sistema com tampão Min. Extrusão da mistura lipídica entre 35 e 41 vezes através de uma membrana de poros de 50 nanômetros.Certifique-se de terminar com um número ímpar de passagens para evitar agregados que nunca atravessaram a membrana. Distribua lamínulas de vidro em uma placa de Petri de vidro invertido ou outra superfície inerte. Com uma pipeta de vidro, adicione sete gotas de ácido sulfúrico concentrado no centro de cada lamínula.Em seguida, adicione duas gotas de peróxido de hidrogênio a 50% no meio das gotas de ácido. Cubra a reação e incube por pelo menos 45 minutos. Agora, pegue as lamínulas individualmente com uma pinça e enxágue o ácido com água ultrapura.Coloque as lamínulas lavadas em suportes antiaderentes ou em um dispositivo de transporte semelhante. Agora enxágue cada lamínula extensivamente com água ultrapura e seque a superfície com gás pressurizado. Marque o lado limpo da lamínula com marcador permanente.Para montar a câmara, primeiro corte e descarte a tampa e a parte cônica de um tubo de reação de 0,5 mililitro com uma tesoura afiada. Em seguida, aplique cola UV na borda superior do tubo e distribua a cola uniformemente usando uma ponta de pipeta. Cole o tubo de cabeça para baixo no lado limpo da lamínula.Finalmente, cure a cola UV colocando várias câmaras sob uma lâmpada de 360 nanômetros ou LED por cinco a 15 minutos. Para a formação de bicamada lipídica suportada, pré-aqueça um bloco de calor a 37 graus Celsius e incube dois tubos de reação de mililitros com tampão Min ou SLB em um tubo por câmara. Sopre nitrogênio nas câmaras montadas e curadas para remover qualquer poeira ou outras partículas que possam ter se depositado durante a cura e montagem UV.Em seguida, coloque as câmaras no bloco de calor. Dilua uma alíquota de 20 microlitros de lipídios claros com 130 microlitros de tampão Min, construindo uma concentração de trabalho de 0,53 miligramas por mililitro. Adicione 75 microlitros da mistura lipídica a cada câmara.Agora, defina um cronômetro para três minutos. Durante o tempo de incubação, as vesículas estouram na superfície do vidro hidrofílico e se fundem para formar um SLB coerente. Depois de 60 segundos, adicione 150 microlitros de buffer mínimo a cada câmara.Após os 120 segundos restantes, lave cada câmara adicionando 200 microlitros de tampão Min ou SLB, pipetando cuidadosamente para cima e para baixo algumas vezes, removendo e adicionando mais 200 microlitros. Uma vez que cada câmara tenha sido lavada uma vez, lave bem a primeira câmara até que os dois mililitros de tampão se esgotem. A lavagem de bicamadas lipídicas suportadas requer alguma experiência para aperfeiçoar a extensão dos movimentos na câmara e encontrar a intensidade de lavagem correta.Para produzir microestruturas PDMS a partir de wafers de silício padronizados, primeiro use um copo de plástico para pesar 10 gramas de base PDMS e um grama de reticulador PDMS. Use um dispositivo de mistura para misturar e desgaseificar a mistura PDMS. Agora, use uma ponta de pipeta para colocar uma pequena quantidade de PDMS diretamente na estrutura do wafer de silício.Coloque imediatamente uma lamínula 1 na gota PDMS e pegue a extremidade superior de uma ponta de pipeta limpa para pressionar suavemente a lamínula no wafer de silício. O PDMS deve espalhar-se finamente entre a lamínula e a pastilha de silício. Coloque o wafer com as lamínulas em um forno e cure o PDMS por três a quatro horas, ou durante a noite, a 75 graus Celsius.Em seguida, retire o wafer do forno e deixe esfriar até a temperatura ambiente. Com uma lâmina de barbear, remova cuidadosamente a lamínula com o PDMS anexado do wafer de silício. Agora, conecte uma câmara de plástico ao PDMS conforme descrito anteriormente para o vidro.Pegue as lamínulas com a câmara anexada e coloque no limpador de plasma com oxigênio como gás de processo. Limpe as lamínulas com plasma. Neste trabalho, foi utilizada potência de 30% e pressão de oxigênio de 0,3 milibar por um minuto.Agora, prepare um SLB na câmara conforme descrito anteriormente no vidro. Para realizar o ensaio de auto-organização, ajuste o volume do tampão na câmara para 200 microlitros de tampão Min, menos a quantidade de proteína e solução de ATP. Em seguida, adicione MinD, rotulado como MinD, MinE e, se desejar, MinC, e misture delicadamente os componentes pipetando.Agora, adicione 2,5 milimolares de ATP para iniciar a auto-organização do MinDE. Nos próximos 10 a 30 minutos, verifique a formação regular de padrões MinDE e microestruturas formadas adequadamente em um microscópio de fluorescência. Quando os padrões regulares de MinDE se formarem, pipete suavemente para cima e para baixo duas vezes para misturar os componentes.Remova a grande quantidade de tampão usando uma pipeta de 100 microlitros e, em seguida, remova cuidadosamente o restante usando uma pipeta de 10 microlitros. Para permitir tempos de imagem mais longos, conecte um pedaço de esponja umedecida dentro da câmara. Certifique-se de que a esponja não entre em contato com a superfície da lamínula.Feche imediatamente a câmara com uma tampa para evitar a secagem do tampão residual nas microestruturas. Antes de obter imagens das microestruturas, confirme se a auto-organização do MinDE é interrompida no topo da microestrutura do PDMS enquanto as proteínas nas microcavidades estão oscilando. Neste vídeo representativo, a imagem em duas cores mostra como MinD e MinE se auto-organizam em ondas superficiais viajantes que conformam padrões espirais em bicamadas lipídicas suportadas.Aqui, a imagem de cor única mostra MinD e MinE realizando oscilações pólo a pólo em microestruturas PDMS. As oscilações estabelecem um gradiente de concentração MinD médio no tempo com concentração máxima nos pólos do compartimento e concentração mínima no meio do compartimento. Após este procedimento, outros métodos, como rastreamento de partícula única, podem ser realizados para determinar a cinética de ligação à membrana e os tempos de residência.Não se esqueça de que trabalhar com solução de piranha pode ser extremamente perigoso, e precauções como equipamentos de proteção individual devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.

in-vitro-reconstitution-self-organizing-protein-patterns-on-supported

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este vídeo demonstra uma técnica in vitro para estudar a formação de sinapses imunes entre células T humanas primárias e bicamadas lipídicas suportadas (SLB). As proteínas da superfície das células T interagem com os respectivos ligantes imobilizados no SLB para formar uma sinapse imune, seguida pelo movimento dos grânulos líticos em direção à sinapse, que é visualizado por meio de microscopia de fluorescência.

Uma técnica in vitro para estudar a interação de células T com bicamadas lipídicas planares suportadas

Apresenta-se um protocolo para funcionalizar vidro com manchas proteicas nanométricas rodeado por uma bicamada lipídica fluida. Estes substratos são compatíveis com microscopia óptica avançado e espera-se para servir como plataforma para estudos de adesão celular e de migração.

Matrizes ligando Nano-fragmentação em uma bicamada lipídica Compatível

Aqui nós apresentamos dois protocolos ultra rápidos para reconstituição das proteínas de membrana em fusogenic proteoliposomes e fusão de tais proteoliposomes com bilayers do lipid alvo para detergente livre entrega destas proteínas de membrana para a BICAMADA postfusion. A combinação dessas abordagens permite montagem rápida e facilmente controlada de sistemas complexos de membrana multi-componentes.

Livre de detergente ultra reconstituição das proteínas de membrana em lípidos Bilayers usando Fusogenic Proteoliposomes complementares carregada.

Com suporte sólido, isento de proteína, dobro fosfolipídeo BICAMADA membranas (DLBM) podem ser transformadas em redes de nanotubo de lipídios complexos e dinâmicos e podem servir como modelos 2D de baixo para cima do retículo endoplasmático.

Formação espontânea e rearranjo das redes de nanotubo lipídica Artificial como um modelo de baixo para cima para o retículo endoplasmático

A fusão mitocondrial é uma importante reação homeostática subjacente à dinâmica mitocondrial. Descrito aqui é um sistema de reconstituição in vitro para estudar a fusão mitocondrial de membrana interna que pode resolver amarração de membrana, acoplamento, hemifusão e abertura de poros. Discute-se a versatilidade dessa abordagem na exploração de sistemas de membrana celular.

Uma plataforma de membrana modelo para reconstituir a dinâmica da membrana mitocondrial

Este protocolo descreve a formação de células imitando vesículas uni-lipídicas e multi-lipídicas, bicamadas lipídicas suportadas e bicamadas lipídicas suspensas. Estes modelos in vitro podem ser adaptados para incorporar uma variedade de tipos lipídes e podem ser usados para investigar várias interações de moléculas e macromoléculas.

Montagem de Modelos de Bicamadas lipídicas apoiadas e suspensas para o estudo de interações moleculares

Este protocolo descreve a formação de bicamadas lipídicas suportadas e a adição de filamentos citoesqueléticos e proteínas motoras para estudar a dinâmica de redes citoesqueléticas reconstituídas e ligadas à membrana usando microscopia de fluorescência.

Reconstituição de Córtices de Actina Mínima Amarrados à Membrana em Bicamadas Lipídicas Suportadas

Neste manuscrito, demonstramos as técnicas experimentais para encapsular o citoesqueleto F-actin em vesículas lipídicas unilamellar gigantes (também chamadas lipossomos), e o método para formar uma camada de F-actin de córtex biomimicing no folheto interno da membrana lipossosome.

In vitro Reconstituição do Actin Cytoskeleton Dentro de Vesículos Gigantes Unilamellar

A reconstituição livre de células tem sido uma ferramenta fundamental para entender a montagem do citoesqueleto, e o trabalho na última década estabeleceu abordagens para estudar a dinâmica dos septins em sistemas mínimos. Aqui apresentados estão três métodos complementares para observar a montagem de septina em diferentes contextos de membrana: bicamadas planares, suportes esféricos e suportes de hastes.

Reconstituição da Assembleia septina em membranas para estudar propriedades e funções biofísicas

Aqui, é descrito um protocolo para gerar padrões proteicos regulados por luz e reversíveis com alta precisão espaço-temporal em membranas lipídicas artificiais. O método consiste na fotoativação localizada da proteína iLID (dímero induzível por luz melhorado) imobilizada em membranas modelo que, sob luz azul, se liga à sua proteína parceira Nano (SspB do tipo selvagem).

Padrões dinâmicos de proteínas induzidas por luz em membranas modelo

Aprenda a reconstituir padrões de auto-organização de proteínas MinD e MinE em bicamadas lipídicas suportadas usando microcompartimentos de PDMS. Este método permite controle preciso da formação de padrões em estudos de biologia celular e biofísica.

In Vitro Reconstituição de auto-organização padrões de proteína na Bilayers do Lipid suportados

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