In Vitro Reconstituição de auto-organização padrões de proteína na Bilayers do Lipid suportados

Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre a organização e as membranas das células, por exemplo, qual o papel que as pistas geométricas desempenham no processo. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite um controle preciso sobre todos os aspectos que influenciam a formação de padrões, como as concentrações de proteínas. Para começar, gere vesículas multilamelares conforme descrito no protocolo de texto.

Agora, congele e descongele os lipídios por sete a 10 ciclos, preparando primeiro um béquer com água a 70 a 99 graus Celsius em uma placa quente, bem como um recipiente contendo nitrogênio líquido. Segure o frasco para injetáveis em nitrogênio líquido com uma pinça grande até que o nitrogênio pare de ferver. Em seguida, transfira o frasco para água quente até que a solução esteja completamente descongelada.

Repita essas etapas até que a mistura lipídica pareça clara aos olhos, dependendo da mistura. Em seguida, monte uma extrusora de lipídios e pré-enxágue o sistema com tampão Min. Extrusão da mistura lipídica entre 35 e 41 vezes através de uma membrana de poros de 50 nanômetros.

Certifique-se de terminar com um número ímpar de passagens para evitar agregados que nunca atravessaram a membrana. Distribua lamínulas de vidro em uma placa de Petri de vidro invertido ou outra superfície inerte. Com uma pipeta de vidro, adicione sete gotas de ácido sulfúrico concentrado no centro de cada lamínula.

Em seguida, adicione duas gotas de peróxido de hidrogênio a 50% no meio das gotas de ácido. Cubra a reação e incube por pelo menos 45 minutos. Agora, pegue as lamínulas individualmente com uma pinça e enxágue o ácido com água ultrapura.

Coloque as lamínulas lavadas em suportes antiaderentes ou em um dispositivo de transporte semelhante. Agora enxágue cada lamínula extensivamente com água ultrapura e seque a superfície com gás pressurizado. Marque o lado limpo da lamínula com marcador permanente.

Para montar a câmara, primeiro corte e descarte a tampa e a parte cônica de um tubo de reação de 0,5 mililitro com uma tesoura afiada. Em seguida, aplique cola UV na borda superior do tubo e distribua a cola uniformemente usando uma ponta de pipeta. Cole o tubo de cabeça para baixo no lado limpo da lamínula.

Finalmente, cure a cola UV colocando várias câmaras sob uma lâmpada de 360 nanômetros ou LED por cinco a 15 minutos. Para a formação de bicamada lipídica suportada, pré-aqueça um bloco de calor a 37 graus Celsius e incube dois tubos de reação de mililitros com tampão Min ou SLB em um tubo por câmara. Sopre nitrogênio nas câmaras montadas e curadas para remover qualquer poeira ou outras partículas que possam ter se depositado durante a cura e montagem UV.

Em seguida, coloque as câmaras no bloco de calor. Dilua uma alíquota de 20 microlitros de lipídios claros com 130 microlitros de tampão Min, construindo uma concentração de trabalho de 0,53 miligramas por mililitro. Adicione 75 microlitros da mistura lipídica a cada câmara.

Agora, defina um cronômetro para três minutos. Durante o tempo de incubação, as vesículas estouram na superfície do vidro hidrofílico e se fundem para formar um SLB coerente. Depois de 60 segundos, adicione 150 microlitros de buffer mínimo a cada câmara.

Após os 120 segundos restantes, lave cada câmara adicionando 200 microlitros de tampão Min ou SLB, pipetando cuidadosamente para cima e para baixo algumas vezes, removendo e adicionando mais 200 microlitros. Uma vez que cada câmara tenha sido lavada uma vez, lave bem a primeira câmara até que os dois mililitros de tampão se esgotem. A lavagem de bicamadas lipídicas suportadas requer alguma experiência para aperfeiçoar a extensão dos movimentos na câmara e encontrar a intensidade de lavagem correta.

Para produzir microestruturas PDMS a partir de wafers de silício padronizados, primeiro use um copo de plástico para pesar 10 gramas de base PDMS e um grama de reticulador PDMS. Use um dispositivo de mistura para misturar e desgaseificar a mistura PDMS. Agora, use uma ponta de pipeta para colocar uma pequena quantidade de PDMS diretamente na estrutura do wafer de silício.

Coloque imediatamente uma lamínula 1 na gota PDMS e pegue a extremidade superior de uma ponta de pipeta limpa para pressionar suavemente a lamínula no wafer de silício. O PDMS deve espalhar-se finamente entre a lamínula e a pastilha de silício. Coloque o wafer com as lamínulas em um forno e cure o PDMS por três a quatro horas, ou durante a noite, a 75 graus Celsius.

Em seguida, retire o wafer do forno e deixe esfriar até a temperatura ambiente. Com uma lâmina de barbear, remova cuidadosamente a lamínula com o PDMS anexado do wafer de silício. Agora, conecte uma câmara de plástico ao PDMS conforme descrito anteriormente para o vidro.

Pegue as lamínulas com a câmara anexada e coloque no limpador de plasma com oxigênio como gás de processo. Limpe as lamínulas com plasma. Neste trabalho, foi utilizada potência de 30% e pressão de oxigênio de 0,3 milibar por um minuto.

Agora, prepare um SLB na câmara conforme descrito anteriormente no vidro. Para realizar o ensaio de auto-organização, ajuste o volume do tampão na câmara para 200 microlitros de tampão Min, menos a quantidade de proteína e solução de ATP. Em seguida, adicione MinD, rotulado como MinD, MinE e, se desejar, MinC, e misture delicadamente os componentes pipetando.

Agora, adicione 2,5 milimolares de ATP para iniciar a auto-organização do MinDE. Nos próximos 10 a 30 minutos, verifique a formação regular de padrões MinDE e microestruturas formadas adequadamente em um microscópio de fluorescência. Quando os padrões regulares de MinDE se formarem, pipete suavemente para cima e para baixo duas vezes para misturar os componentes.

Remova a grande quantidade de tampão usando uma pipeta de 100 microlitros e, em seguida, remova cuidadosamente o restante usando uma pipeta de 10 microlitros. Para permitir tempos de imagem mais longos, conecte um pedaço de esponja umedecida dentro da câmara. Certifique-se de que a esponja não entre em contato com a superfície da lamínula.

Feche imediatamente a câmara com uma tampa para evitar a secagem do tampão residual nas microestruturas. Antes de obter imagens das microestruturas, confirme se a auto-organização do MinDE é interrompida no topo da microestrutura do PDMS enquanto as proteínas nas microcavidades estão oscilando. Neste vídeo representativo, a imagem em duas cores mostra como MinD e MinE se auto-organizam em ondas superficiais viajantes que conformam padrões espirais em bicamadas lipídicas suportadas.

Aqui, a imagem de cor única mostra MinD e MinE realizando oscilações pólo a pólo em microestruturas PDMS. As oscilações estabelecem um gradiente de concentração MinD médio no tempo com concentração máxima nos pólos do compartimento e concentração mínima no meio do compartimento. Após este procedimento, outros métodos, como rastreamento de partícula única, podem ser realizados para determinar a cinética de ligação à membrana e os tempos de residência.

Não se esqueça de que trabalhar com solução de piranha pode ser extremamente perigoso, e precauções como equipamentos de proteção individual devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.