Name: Uso de transplante de células-tronco hematopoiéticas para avaliar a origem da síndrome mielodisplásica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: Aprenda a usar transplante de células-tronco hematopoiéticas para avaliar a malignidade de células geneticamente modificadas em modelos de síndrome mielodisplásica. Este método permite identificar células iniciadoras da doença e analisar células-tronco cancerígenas.

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Este trabalho foi financiado pelo programa de pesquisa Intramural do Instituto Nacional de câncer, National Institutes of Health (conceder números ZIA SC 010378 e BC 010983).

Os animais procedimentos descritos neste artigo foram aprovados pelo Instituto Nacional de câncer, no Comité de uso e cuidado do Animal de Bethesda e estão em conformidade com as políticas contidas a política de serviço de saúde pública no cuidado humano e uso de animais de laboratório, o Ato do bem-estar animal e o guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório.
1. preparação da pilha
<ol><li>Colheita da medula óssea célula nucleada (BMNC)<ol>
<li>Use apenas o material esterilizado. Esterilize instrumentos reutilizáveis usando uma autoclave a vapor. Compra de agulhas, seringas e utensílios plásticos em recipientes estéreis de uso único. Execute todas as manipulações de animal e a célula em uma classe II, tipo A2 local de segurança microbiológica.</li>
		<li>Prepare-se BMNCs em um mL 14 redondo tubo inferior contendo 3 mL de HF2 (Hank está equilibrada solução salina suplementada com 2% de soro fetal bovino).</li>
		<li>Eutanásia C57Bl6 ratos do doador (positivos para CD45 alelo CD45.2), idade normalmente de 2 a 6 meses, utilizando uma câmara de2 CO.</li>
		<li>Esterilize a carcaça do mouse em etanol a 70% de pulverização por todo o corpo com um frasco de spray. Tirar a pele das pernas, desde a pelve até o tornozelo.</li>
		<li>Remova os fêmures e tíbias da carcaça usando uma tesoura esterilizada (em linha reta, sharp/sharp, 11,5 cm) e fórceps (Graefe, serrilhada, largura da ponta de 0.8 mm). Apare os músculos anexados claramente.</li>
		<li>Corte as extremidades proximais e distais da tíbia com a tesoura. Segura a tíbia com fórceps, inserir uma seringa de 3 mL de calibre 27 contendo 2,5 mL de HF2 na cavidade da medula tibial na extremidade distal da tíbia (tornozelo). Retirar as células da medula óssea da tíbia usando uma pressão suave para a 14 mL redonda tubo inferior.<ol>
<li>Repita para o outro tibia.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Corte as extremidades proximais e distais do fêmur com uma tesoura. Resplendor da cavidade de medula do fêmur através da inserção de uma agulha de calibre 20 anexado a uma seringa de 3 mL contendo 2,5 mL de HF2 na extremidade distal da cavidade de medula de fêmur e aplicando uma pressão suave para a seringa.<ol>
<li>Repita para o outro fêmur, coletando todas as da medula óssea de ambas as tíbias e os fêmures no mesmo 14 mL tubo de fundo redondo.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Disperse a massa da medula por aspiração para cima e para baixo várias vezes com a mesma agulha de calibre 20 anexada para a seringa de 3 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mancha do anticorpo de BMNC<ol>
<li>BMNC de contagem. Adicione 20 µ l de uma solução de ácido acético de 3% a 20 µ l da suspensão BMNC gerada na etapa 1.1.8. Então, conta usando um hemocytometer e um microscópio invertido.</li>
		<li>Pelota a BMNC por centrifugação suave a 450 x g por 5 min a 4 ° C. Resuspenda o pellet com HF2 usando 90 µ l por 107 células e adicionar 10 µ l de biotinilado antilinhagem cocktail à suspensão de células.</li>
		<li>Após incubação por 20 min a 4 ° C, lave as células coradas com 3 mL de tampão fosfato salino (PBS).</li>
		<li>Ressuspender o BMNC com 100 µ l de HF2 por 107 células. Adicione 2 µ l de allophycocyanin (APC) conjugado anticorpo antibiotina à suspensão de células, seguida de incubação a 4 ° C por 20 min.</li>
		<li>Enxágue o BMNC manchada com 3 mL de PBS e ressuspender o BMNC com HF2 suplementado com 0,2 µ g/mL de iodeto de propidium (PI) por citometria de fluxo celular classificação.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fluxo cytometry célula classificação de BMNC<ol>
<li>Calibre o classificador de pilha de citometria de fluxo. Otimizar todos os tubos fotomultiplicadores (PMTs), dispersão e parâmetros de fluorescência usando células imaculadas e definir dentro da escala linear de cada detector.</li>
		<li>Preparar imaculado, PI-manchada, e APC rotulado linhagem cocktails células em paralelo da etapa 1.2. Analise espectral da indemnização.</li>
		<li>Discriminar as células dubleto pelo gating sequencial de FSC-H vs CCD-H 640-SSC-A vs 640-SSC-H e 640-SSC-S vs 640-SSC-W.</li>
		<li>Exclua células viáveis usando PI animado a 561 nm e emissão coletados com um filtro passa-banda 614/20. Excite a linhagem APC rotulada células em 640 nm e coletar a emissão com um filtro passa-banda 671/30.</li>
		<li>Gravar valores de fluorescência como altura de tensão e coletar pelo menos 100.000 eventos em arquivos de dados de modo de lista para visualizar as populações a serem classificados.</li>
		<li>Calcular a compensação espectral após a aquisição de três amostras de 10.000 células para o seguinte: unlabeled células, PI rotulado células e cocktail de antianticorpo linhagem conjugado com APC rotulada de células.</li>
		<li>Conjunto de três regiões para classificar a linhagem negativa (LN), linhagem positivo (LP) com intensidade de fluorescência ofuscante (LP1) e a população de LP com fluorescência (LP2) para tubos de 5 mL contendo 0,5 mL de mídia FBS de 10%.</li>
		<li>Células de tipo usando uma uma gota envolvem e purificam o modo de anular.</li>
		<li>Execute análise de tipo post com 1.000 células totais em cada amostra classificada para confirmar a pureza e a viabilidade das células classificadas.</li>
		<li>Recolher pilhas classificadas por centrifugação a 450 x g por 5 min a 4 ° C e resuspenda o pellet de células com 0,5 mL de HF2.</li>
		<li>Confirme celular classificada número com hemocytometer e azul Trypan. Ajuste o número de células com HF2 para transplante. Nota: Um amplo espectro de populações BMNC pode ser isolado para transplante usando combinações adicionais de anticorpos conjugados a fluorocromo na etapa 1.2.2 acima.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. destinatário ratos preparação e transplante de células-tronco hematopoéticas (TCTH)
<ol><li>Preparação de transplantados<ol>
<li>Manter a veterinária e pecuária conta congenic ratos destinatário (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) em uma instalação animal livre de patógeno específico (SPF).</li>
		<li>Para descontaminação profilática da faixa gastrointestinal, fornecer água estéril contendo 100 mg/L de ciprofloxacina aos destinatários por 7 dias antes da irradiação de dose letal (Gy 9) e manter durante 14 dias após a irradiação.</li>
		<li>Fornece uma irradiação de dose letal (Gy 9) de uma fonte de Cs da seguinte maneira. Use um operador treinado e certificado do Cs. Defina o instrumento de fonte de Cs para entregar 70 irradiação de gama de corpo total cGy/min. Coloque 10 ratos em um suporte personalizados e encaixe o suporte da câmara difusora. Entregar a irradiação de corpo total 9 Gy em 13 min e retornar os ratos de suas gaiolas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transplante de células-tronco hematopoiéticas<ol>
<li>Misture tipo selvagem (WT) BMNC de um congenic destinatário mouse (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) na dose de 2 x 105 células por rato com 2 a 5 x 10 célula4 células do teste purificada que BMNC preparado com fluxo cytometry classificando como descrito em 1.3 acima. Misture as células na mesma seringa. Nota: O WT BMNC fornecem um radiação poupando-efeito para o destinatário mouse e permitir a sobrevivência do destinatário mouse se as células de teste não oferecem suporte a hematopoiese. A WT BMNC utilizados neste tipo de experimento expressa o alelo CD45.1 e, portanto, podem ser distinguido das células teste usando anticorpos que discriminam entre CD45.1 e CD45.2. As células de WT BM são referidas como "células helper", "células de poupadores de radiação" ou "células de concorrente".</li>
		<li>Ajuste o volume de mistura de célula a 200 µ l por destinatário usando o HF2 estéril para facilitar a injeção.</li>
		<li>Transplante as misturas de célula para a ratos destinatário letalmente irradiados através de cauda por via venosa veia injeção usando uma seringa de 1 mL e agulha de calibre 28, no prazo de 24 h de irradiação. Coloque a cauda de rato sob uma lâmpada de calor, como calor leva à dilatação da veia da cauda. Nota: Eutanásia em todos os ratos destinatários no final do estudo e avaliar a progressão da doença por necrópsia, histologia e citometria de fluxo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. enxertia ensaio usando citometria de fluxo
<ol><li>Para avaliar a enxertia de célula do doador, colete sangue periférico (PB) dos destinatários ratos na 6ª semana, 12 e 16 semana após o transplante.</li>
	<li>Aqueça os destinatários na gaiola com lâmpada de calor por cerca de 1 min e posicione o mouse em uma retenção.</li>
	<li>Cortar a veia da cauda com um bisturi (lâmina 10, alça para bisturi #3) e coletar 100 µ l de PB por destinatário usando um conta de tubo contendo EDTA como anticoagulante.</li>
	<li>Divida o PB coletado em duas alíquotas iguais colocando-se 50 µ l em um tubo estéril microcentrifuga. Use uma alíquota para uma automatizado hemograma completo (CBC) (realizada no núcleo de Histopatologia do ICN) e use a segunda alíquota para coloração de anticorpo e citometria de fluxo.</li>
	<li>Para detectar a enxertia de doador por citometria de fluxo, Lise os glóbulos vermelhos (RBC), adicionando 1 mL de tampão de Lise hipotónica RBC (8,29 g/L de NH4Cl, 1 g/L de KHCO3, 0,037 g/L de Na2EDTA, pH 7,2) a 50 µ l do PB coletado. Vórtice da amostra para misturar e incubar 10 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Centrifugue o PB lisado a 4.600 x g por 1,5 min. cuidadosamente Aspire o sobrenadante e descartar.</li>
	<li>Interromper parcialmente o centrifugado por suavemente tocando ou "sacudir" o fundo do tubo. Adicione 1,3 mL de PBS para a pelota localizado no tubo e centrifugar 4.600 x g por 1,5 min. cuidadosamente aspirado e descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Perturbar o centrifugado por tocar ou passar rapidamente e adicionar 200 µ l de HF2 suplementado com 5% de soro de rato para o centrifugado.</li>
	<li>Adicione o anticorpo anti-CD45.2 (1 µ l) conjugado com allophycocyanin (APC) para a suspensão de eritrócitos. Incube a 4 ° C, durante pelo menos 30 min e brevemente vórtice a mistura.</li>
	<li>Após a coloração, lavar as células duas vezes como descrito acima e ressuspender com 400 µ l de HF2 suplementado com 1 µ g/mL de PI.</li>
	<li>Detecta a enxertia usando um citômetro de fluxo de 4 cores. Obter informações adicionais sobre os tipos de células no sangue periférico pela adição de anticorpos adicionais para detectar tipos específicos de células, como linfócitos B ou T.</li>
	<li>Gravar dados de enxertia serial usando uma planilha para permitir a posterior análise de dados.</li>
</ol>

<ol><li>Corey, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelodysplastic+syndromes%3A+the+complexity+of+stem-cell+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Myelodysplastic syndromes: the complexity of stem-cell diseases.</a> Nature Reviews Cancer. 7 (2), 118-129 (2007).</li>
<li>Garcia-Manero, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelodysplastic+syndromes%3A+2015+Update+on+diagnosis%2C+risk-stratification+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Myelodysplastic syndromes: 2015 Update on diagnosis, risk-stratification and management.</a> American Journal of Hematology. 90 (9), 831-841 (2015).</li>
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<li>Pedersen-Bjergaard, J., Christiansen, D. H., Desta, F., Andersen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+genetic+pathways+and+cooperating+genetic+abnormalities+in+the+pathogenesis+of+therapy-related+myelodysplasia+and+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Alternative genetic pathways and cooperating genetic abnormalities in the pathogenesis of therapy-related myelodysplasia and acute myeloid leukemia.</a> Leukemia. 20 (11), 1943-1949 (2006).</li>
<li>Uy, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+the+clonal+structure+of+MDS+and+AML+in+response+to+epigenetic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in the clonal structure of MDS and AML in response to epigenetic therapy.</a> Leukemia. 31 (4), 872-881 (2017).</li>
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<li>Thanopoulou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engraftment+of+NOD%2FSCID-beta2+microglobulin+null+mice+with+multilineage+neoplastic+cells+from+patients+with+myelodysplastic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Engraftment of NOD/SCID-beta2 microglobulin null mice with multilineage neoplastic cells from patients with myelodysplastic syndrome.</a> Blood. 103 (11), 4285-4293 (2004).</li>
<li>Kerbauy, D. M., Lesnikov, V., Torok-Storb, B., Bryant, E., Deeg, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engraftment+of+distinct+clonal+MDS-derived+hematopoietic+precursors+in+NOD%2FSCID-beta2-microglobulin-deficient+mice+after+intramedullary+transplantation+of+hematopoietic+and+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Engraftment of distinct clonal MDS-derived hematopoietic precursors in NOD/SCID-beta2-microglobulin-deficient mice after intramedullary transplantation of hematopoietic and stromal cells.</a> Blood. 104 (7), 2202-2203 (2004).</li>
<li>Benito, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOD%2FSCID+mice+transplanted+with+marrow+from+patients+with+myelodysplastic+syndrome+%28MDS%29+show+long-term+propagation+of+normal+but+not+clonal+human+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Research%22%5BJournal%5D)">NOD/SCID mice transplanted with marrow from patients with myelodysplastic syndrome (MDS) show long-term propagation of normal but not clonal human precursors.</a> Leukemia Research. 27 (5), 425-436 (2003).</li>
<li>Medyouf, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelodysplastic+cells+in+patients+reprogram+mesenchymal+stromal+cells+to+establish+a+transplantable+stem+cell+niche+disease+unit%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Myelodysplastic cells in patients reprogram mesenchymal stromal cells to establish a transplantable stem cell niche disease unit.</a> Cell Stem Cell. 14 (6), 824-837 (2014).</li>
<li>Chung, Y. J., Choi, C. W., Slape, C., Fry, T., Aplan, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+a+myelodysplastic+syndrome+by+a+long-term+repopulating+hematopoietic+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transplantation of a myelodysplastic syndrome by a long-term repopulating hematopoietic cell.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 14088-14093 (2008).</li>
<li>Pietras, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+Distinct+Subsets+of+Lineage-Biased+Multipotent+Progenitors+Control+Blood+Production+in+Normal+and+Regenerative+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Functionally Distinct Subsets of Lineage-Biased Multipotent Progenitors Control Blood Production in Normal and Regenerative Conditions.</a> Cell Stem Cell. 17 (1), 35-46 (2015).</li>
<li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab Animal. 40 (5), 155-160 (2011).</li>
<li>Chung, Y. J., Fry, T. J., Aplan, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloablative+hematopoietic+stem+cell+transplantation+improves+survival+but+is+not+curative+in+a+pre-clinical+model+of+myelodysplastic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Myeloablative hematopoietic stem cell transplantation improves survival but is not curative in a pre-clinical model of myelodysplastic syndrome.</a> PLoS One. 12 (9), e0185219(2017).</li>
</ol>

Nós não temos nada para divulgar.

Embora MDS são uma desordem clonal células-tronco hematopoiéticas, os MDS "tronco", ou células de iniciante, ainda não foram caracterizados. Demonstramos anteriormente que o MDS pode ser para transplante para camundongos WT usando a medula óssea de ratos NHD13 por TCTH, caracterizada por anemia macrocítica, leucopenia, neutropenia e evidências morfológicas de displasia15. Além disso, ensaios de repovoamento do competidor identificaram uma vantagem de crescimento de células de medula óssea NHD13 MD...

Síndromes Mielodisplásicas (MDS) representam um conjunto diverso de desordens de sangue clonal caracterizada pela hematopoiese ineficaz, evidências morfológicas de displasia e uma propensão para a transformação para leucemia mieloide aguda (LMA)1,2 ,3,4. Hematopoiese ineficaz é reconhecido como uma prisão de maturação na medula óssea, resultando em sangue periférico citopenias apesar de medula hipercelular1,3. A incidência de MDS foi estimada vària como 2-12 casos por 100.000 pessoas por ano nos Estados Unidos, e a incidência de MDS aumenta com a idade, tornando esta uma condição importante para entender tendo em conta o envelhecimento da população dos EUA3, 5. Embora a maioria dos casos de MDS tem sem etiologia, alguns casos de MDS são pensados para ser devido à exposição a agentes genotóxicos conhecidos, incluindo solventes tais como benzina e quimioterapia de câncer6.
Pacientes MDS normalmente adquiriram mutações no MDS células7. Embora relativamente incomum, um número de pacientes MDS adquiriram equilibradas translocações cromossômicas envolvendo genes tais como NUP98, EVI1, RUNX1 e MLL (http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman). Nosso laboratório tem um interesse de longa data em translocações cromossómicas, que envolvem o gene de NUP988. Ratos transgénicos que expressa um transgene NUP98-HOXD13 (NHD13), regulado pelo promotor Vav1 e elementos de potenciador exibem todos os principais recursos do MDS, incluindo citopenias de sangue periférico, evidências morfológicas de displasia e transformação para LMA9 .
Embora o MDS foram reconhecidos por mais de 60 anos,10e são considerados ser uma desordem clonal de células estaminais, os esforços para engraft célula humana do MDS em camundongos imunodeficientes foram pela maior parte mal sucedidos, porque as células MDS engraft mal11, 12,13,14 e os ratos não desenvolvem a doença clínica. Em um esforço para identificar quais células hematopoiéticas podem transmitir MDS, viramos para o modelo de NHD13 e mostrou que nós poderíamos engraft MDS como uma entidade de doença que mostrou todas as características cardinais da MDS humano, incluindo sangue periférico citopenias, displasia, e transformação para LMA15. Neste relatório, nós apresentamos os detalhes técnicos destas experiências, bem como abordagens para fracionar mais tronco hematopoiético e células precursoras (HSPC), em um esforço para identificar células MDS-iniciando.

<table><tbody><tr><td>Tubo inferior redondo de 14 mL</td><td>Solução</td><td></td> salina balanceada Falcon 352057 <td></td></tr><tr><td>Hank's</td><td>Anticorpo Lonza</td><td>10-527F</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45.2</td><td>Southern Biotech</td><td>1800-15</td><td>LOTE# A077-T044O</td></tr><tr><td>Seringa de 3 mL</td><td>Monoject</td><td>8881513934</td><td></td></tr><tr><td>agulha 27-G</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>agulha 20-G</td><td>BD</td><td></td><td></td>305176</tr><tr><td>Lineage Cocktail</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-858</td><td>LOTE# 5170418221</td></tr><tr><td>Anticorpos anti-biotina</td><td>Miltenyi</td><td>130-113-288</td><td>LOTE# 5171109046</td></tr><tr><td>Seringa de 1 mL</td><td>Excelint</td><td>26027</td><td>Seringa</td></tr> de <tr><td>Insulina Lâmpada de Aquecimento</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>E70001901</td><td></td></tr><tr><td>Máquina FACS Cytec</td><td></td><td>FACScan</td><td>2 lasers, 5 detectores de cores</td></tr><tr><td>Instrumento de classificação FACS</td><td>Beckman Coulter</td><td>MOFLO ASTRIOS</td><td>5 lasers, 23 parâmetros, 6 classificação de população simultaneamente</td></tr><tr><td>Iodeto de propídio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>Gamma Irradiator</td><td>Melhor Theratronics</td><td>Gammacell 40</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de coleta de sangue</td><td>RAM scientific</td><td>76011</td><td></td></tr><tr><td>Destinatário camundongos</td><td>Charles River</td><td>B6-LY5.1 / Cr, CD45.1</td><td></td></tr><tr><td>NUP98-HOXD13 camundongos</td><td>n / a</td><td>C57Bl / 6, CD45.2</td><td>Colônia mantida no NIH</td></tr><tr><td>5 mL tubo inferior redondo</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr></tbody></table>

uso de transplante de células-tronco hematopoiéticas para avaliar a origem da síndrome mielodisplásica

Use of Hematopoietic Stem Cell Transplantation to Assess the Origin of Myelodysplastic Syndrome

Síndromes Mielodisplásicas (MDS) são um grupo diverso de desordens de células-tronco hematopoiéticas são definidos pela hematopoiese ineficaz, sangue periférico citopenias, displasia e uma propensão para a transformação para leucemia aguda. NUP98-HOXD13 (NHD13) ratos transgénicos recapitular MDS humana em termos de citopenias de sangue periférico, displasia e transformação para leucemia aguda. Demonstramos anteriormente que a MDS poderão ser transferidos de um rato geneticamente modificado com MDS para destinatários do selvagem-tipo por transplante de células de medula óssea nucleated MDS (BMNC). A mais claramente compreender a célula MDS de origem, desenvolvemos abordagens específicas de transplante, immunophenotypically definidos hematopoiéticos subconjuntos. Neste artigo, descrevemos o processo de isolar e transplantar populações específicas de tronco hematopoiético e células progenitoras. Após transplante, descrevemos abordagens para avaliar a eficiência do transplante e a persistência das células MDS doador.

Nós mostramos figuras representativas para obter resultados de vários experimentos. A Figura 1 mostra uma citometria de fluxo representativo classificação experimento. Durante a diferenciação hematopoiética normal, como as células se tornam comprometidas com uma linhagem específica de hematopoiética, eles adquirem marcadores de superfície celular linhagem-definição e perdem o potencial de auto-renovação. Portanto, em ratos do selvagem-tipo, auto-renovação de ...

Nós descrevemos o uso do transplante de células-tronco hematopoéticas (TCTH) para avaliar o potencial maligno das células hematopoiéticas geneticamente modificados. TCTH é útil para avaliar várias células hematopoiéticas malignas na vivo , bem como gerar uma grande coorte de ratos com Síndromes Mielodisplásicas (MDS) ou leucemia para avaliar novas terapias.

Uso de transplante de células-tronco hematopoiéticas para avaliar a origem da síndrome mielodisplásica

Myelodysplastic syndromes (MDS) are a diverse group of hematopoietic stem cell disorders that are defined by ineffective hematopoiesis, peripheral blood ...

Este método pode ajudar a responder algumas perguntas no método de campo da malignidade sobre a caracterização de uma célula que inicia uma malignidade. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece uma base para a análise funcional dessas células-tronco cancerígenas. As implicações dessa técnica se estendem até onde a terapia de síndromes mielodsplásicas ou MDS, pois pode auxiliar na identificação da doença que inicia as células.Para preparar os receptores para transferência adotiva, uma semana antes do transplante fornecem água estéril suplementada com 100 miligramas por litro de ciprofloxacina para con receptor gênico ANIMAIS por sete dias em uma instalação animal específica e livre de patógenos. No sétimo dia, tenha um operador de césio 17 treinado e certificado que estabeleceu o instrumento de origem do césio para entregar 70 centigrayS de irradiação gama corporal total por minuto. Coloque 10 ratos em um suporte personalizado.Insira o suporte na câmara irradiadora, entregue 9 cinzas de irradiação total do corpo em 13 minutos. Então devolva os animais para suas gaiolas. Na manhã seguinte, pulverize 70% de etanol sobre um rato preto C57 preto c57 inteiro e use uma tesoura para remover a pele da pélvis até os tornozelos.Use fórceps com a tesoura para remover a femora e a tíbia. Aparar os músculos dos ossos. Corte as extremidades proximal e distal para a tíbia e pegue uma tíbia com fórceps.Insira uma seringa de três mililitros equipada com uma agulha de 27 gage na cavidade da medula óssea e coloque a medula óssea em um tubo de fundo redondo de 14 mililitros contendo 2,5 mililitros de solução salina tamponada hanks complementada com soro bovino fetal de 2% ou HF2. Quando toda a medula tiver sido coletada, aspire o tecido várias vezes através da ponta da agulha de 20 gage para dispersar a massa da medula em uma única suspensão para contar. Para rotular as células nucleadas da medula óssea, ou BMNC, para classificação de fluxo, coletar as células por centrifugação e suspender novamente a pelota em uma vez dez a dez para o sétimo BMNC por 90 microliters de concentração de HF2.Em seguida, adicione dez microliters de um coquetel de anticorpos anti-linhagem biotinilado à suspensão celular para incubação de 20 minutos a 4 graus Celsius. Seguido por uma lavagem centrífuga em três mililitros de PBS. Suspenda a pelota em 100 microliters de HF2 por uma vez dez a sete células.Em segundo lugar, rotule as células com dois microliters de anticorpo anti-biotina conjugado APC. Depois de 20 minuetos a quatro graus Celsius, protegidos da luz, lave as células em três mililitros de PBS fresco. Suspender a pelota em HF2 suplementada com 0,2 microgramas por mililitro de iodeto de propídio no gelo.Agora, calibrar o classificador de células de citometria de fluxo usando células não manchadas para otimizar todos os tubos fotomultiplier, dispersão e parâmetros de fluorescência dentro da faixa linear de cada detector. Adquira três amostras de 10.000 células para as células rotuladas APC não rotuladas, pi rotuladas e anti-linhagem. Ao final do tipo, analise 1.000 células de cada amostra para confirmar a pureza e viabilidade das células classificadas.Gire as amostras na centrífuga. Em seguida, suspenda novamente as pelotas em 0,5 mililitros de HF2 para contagem. Para transferência adotiva das células classificadas, misture 100 microlitadores de duas vezes o quinto BMNC do tipo selvagem de um animal receptor con gênico em HF2 estéril.Com 100 microlitadores de duas a cinco vezes dez para o quarto o doador classificado BMNC de interesse em HF2 estéril em um tubo de micro centrífugas por animal receptor. Carregue uma seringa mililitro, equipada com 28 gage por receptor com 200 microliters de células. Em seguida, coloque os camundongos receptores sob uma lâmpada de calor para induzir a dilatação da veia da cauda.Entregue as misturas celulares a cada animal receptor letalmente irradiado através da veia da cauda. Como a auto-renovação das células-tronco se limita à linhagem negativa do tipo selvagem BMNC, as células negativas de linhagem negativa, positivas de linhagem baixa e alta linhagem são classificadas e transplantadas em receptores do tipo selvagem para determinar a capacidade de autoconexão de cada população celular. Adotivamente transplantado doador trans genético BMNC de animais modelo MDS pode ser distinguido ex vivo por sua expressão de marcador de superfície celular CD45.2.Por 16 semanas após o transplante de linhagem negativa BNMC, ou BMNC não consorciado de animais doadores transgênicos de MDS, as células transgênicas competem com as células do tipo selvagem, como evidenciado por uma porcentagem crescente de células doadoras positivas de CD45,2, observadas no sangue periférico dos animais receptores letalmente irradiados. Aqui são mostradas células de uma transformação leucêmica de um rato transplantado com células transgênicas de MDS. Note a presença de numerosas explosões e formas imaturas.Ao tentar o procedimento, é importante lembrar de limitar o tempo de manipulação ex vivo, pois pode colocar estresse indevido nas células, resultando em morte celular ou perda funcional. Após seu desenvolvimento, essa técnica abre caminho para os pesquisadores do programa de campo, para colocar em malignidade explorar a origem da doença em camundongos geneticamente modificados.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este protocolo detalhes a derivação de células-tronco hematopoéticas para transplante de células-tronco embrionárias de rato (ESC) e sua posterior injeção em camundongos letalmente irradiados destinatário. Brevemente, ESC são diferenciados como corpos embrióides, que depois são infectadas com HoxB4 retroviral e co-cultivados com células do estroma OP9 e citocinas hematopoiéticas.

Derivação de Células-Tronco Hematopoéticas murino de Células-Tronco Embrionárias

Um método para analisar a distribuição de células progenitoras hematopoiéticas da medula óssea em citometria de fluxo, bem como para isolar eficazmente altamente purificados de células estaminais hematopoiéticas (HSCs) é descrito. O processo de isolamento é essencialmente baseado no enriquecimento de células magnética c-kit + e classificação celular para purificar HSCs para estudos celulares e moleculares.

Análise fenotípica e Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas Murino e Lineage comprometidos Progenitores

Este protocolo fornece diretrizes passo a passo para a criação de experimentos competitivos de transplante de medula óssea de camundongos para estudar a função das células-tronco/progenitoras hematopoiéticas sem purificação prévia de células-tronco por classificação de células.

Transplantes competitivos para avaliar hematopoéticas aptidão Stem Cell

Quantificação de doador-derivado de células é necessária para monitorar a enxertia após transplante de células-tronco em pacientes com hemoglobinopatias. Uma combinação de classificação de celulares baseados em citometria de fluxo, ensaio de formação de colônia e posterior análise do tandem curta repetições podem ser utilizadas para avaliar a proliferação e diferenciação dos progenitores no compartimento eritroide.

Deteção de doador Residual eritroide progenitoras após transplante de células-tronco hematopoéticas para pacientes com hemoglobinopatias

Detecção de doença residual mínima ou mensurável (MRD) é um biomarcador prognóstico importante para avaliação do risco de refinação e predizer a recaída em leucemia mieloide aguda (LMA). Estas orientações abrangentes e recomendações com as melhores práticas para consistente e exata identificação e detecção de MRD, pode ajudar na tomada de decisões de tratamento eficazes AML.

Protocolo abrangente de amostra e da medula óssea do processo de medição de doença Residual mensurável e células leucêmicas em leucemia mieloide aguda

Nós esboçamos um protocolo para detectar a expressão simultânea de marcadores de células estaminais de leucemia em células de leucemia mieloide aguda primária por citometria de fluxo. Nós mostramos como quantificar três populações de progenitor e uma população de LSC putativa com crescente grau de maturação. Confirmamos a presença dessas populações no correspondentes paciente-derivada-xenografts.

Fluxo Cytometry para estimar leucemia células-tronco na leucemia mieloide aguda primária e no paciente-derivada-xenografts, diagnóstico e segue até

O diagnóstico do MDS é difícil na ausência de critérios morfológicos ou não-informativo citogenética. MFC poderia ajudar a refinar o processo de diagnóstico do MDS. Para se tornar útil para a prática clínica, a análise MFC deve ser baseada em parâmetros com sensibilidade e especificidade suficientes, e dados devem ser reprodutíveis entre diferentes operadores.

Orientada para o banco de dados-citometria de fluxo para avaliação da maturação de células mieloides de medula óssea

Aqui, descrevemos um protocolo simples para o isolamento e coloração de células murinas da medula óssea para fenótipo de células-tronco hemopoéticas e progenitoras, juntamente com células-tronco endoteliais e mesenquimais de nicho de suporte. Um método para enriquecer células localizadas em áreas endosteal e medula óssea central também é incluído.

Análise por Citometria de Fluxo de Medula Óssea Purina, Células-Tronco e Progenitoras Hematopoéticas e Células de Nicho Estromal

Este é apresentado um protocolo detalhado para isolar e caracterizar populações microambientais da medula óssea de modelos murinos de síndromes mielodisplásicas e leucemia mieloide aguda. Esta técnica identifica alterações no nicho da medula óssea não hematopoiética, incluindo as células endoteliais e estromais mesenquimais, com a progressão da doença.

Identificação de Populações Microambientais de Medula Óssea na Síndrome Mielodisplásica e Leucemia Mielóide Aguda

As injeções intrafemorais permitem o enxerto de um pequeno número de células-tronco e progenitoras hematopoiéticas (HSPCs), colocando as células diretamente na cavidade da medula óssea. Aqui descrevemos um protocolo experimental de injeção intrafemoral de HSPCs humanos em camundongos imunodeficientes.

Injeção intrafemoral de células-tronco hematopoiéticas humanas e progenitoras em camundongos imunocomprometidos 

Aprenda a usar transplante de células-tronco hematopoiéticas para avaliar a malignidade de células geneticamente modificadas em modelos de síndrome mielodisplásica. Este método permite identificar células iniciadoras da doença e analisar células-tronco cancerígenas.

Uso de transplante de células-tronco hematopoiéticas para avaliar a origem da síndrome mielodisplásica

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