Name: Lumíforo formação em várias conformações de albumina de soro bovino por ligação de Gold(III) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Aprenda a investigar a formação de fluoróforos vermelhos na albumina de soro bovino (BSA) por ligação de Au(III), analisando mudanças conformacionais dependentes de pH e sítios de ligação específicos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

S.E. reconhece o apoio do fundo especial iniciativa Duke, Wells Fargo fundo, PhRMA Foundation, bem como fundos de inicialização da Universidade da Carolina do Norte, Charlotte.

1. síntese do complexo de BSA-Au(III)
<ol><li>Dissolva 25 mg de BSA em 1 mL de água de grau de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) em um frasco de reação de 5 mL. Nota: A solução deve aparecer claramente.</li>
	<li>Dissolva o ouro (III) cloreto trihidrato (ácido chloroauric) a uma concentração de 5 mM em água de grau HPLC. Nota: A solução deve aparecer amarela. Solução de Ácido cloroáurico preparada nessa concentração resultará em uma BSA, à relação entre Au 01:13.<ol>
<li>Em alternativa, preparar uma solução de Ácido cloroáurico com uma concentração de em qualquer lugar entre 0,38 mM (BSA:Au = 1:1) de 20 mM (BSA:Au = 01:50) em HPLC grau água. Nota: Diferentes rácios de BSA de ouro irão resultar em padrões de fluorescência vermelha drasticamente diferente do mapa de excitação-emissão.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque o frasco de reação da BSA em banho maria a 37 ° C e agitar vigorosamente a 750 rpm utilizando um agitador magnético.</li>
	<li>Imediatamente após a agitação começa, adicione 1 mL de Ácido cloroáurico à solução. A cor da solução deve se transformar de clear para amarelo.</li>
	<li>Agite a mistura por 2 min a 37 ° C e a 750 rpm utilizando um agitador magnético.</li>
	<li>Dentro do frasco de reação, adicione 100 μL de 1 M de NaOH à solução para trazer o pH para 12. Nota: Imediatamente depois de NaOH é adicionado, a solução deve escurecer ligeiramente para um amarelo-marrom e então entregue-se ao amarelo.</li>
	<li>Continuar a agitar a 750 rpm por 2 h e a 37 ° C. A solução deve lentamente mudar de amarelo para cor amarelo/marrom escura. Esta mudança de cor indica a formação da BSA-Au(III) fluorescentes vermelhas complexas.</li>
	<li>Permitir que a amostra sentar-se à temperatura ambiente por 2 dias e a solução continuará a escurecer para um marrom âmbar e irá aumentar a intensidade de fluorescência.<ol>
<li>Como alternativa, deixe a amostra continuar a agitar a 37 ° C por 12 h mais como a cor da solução evolui para um âmbar marrom.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. síntese de BSA-Cu(II)-Au(III)
<ol><li>Dissolva 25 mg de BSA em 1 mL de água de grau HPLC. A solução deve aparecer claramente.</li>
	<li>Dissolva o cobre (II) cloreto hidratado em água de grau HPLC para uma concentração de 5 mM. A solução deve aparecer a luz azul.</li>
	<li>Adicione 1 mL da solução aquosa BSA para um frasco de reação de 5 mL e colocar em banho maria a 37 ° C. Agite a mistura em 750 rpm.</li>
	<li>Imediatamente Adicione 0,5 mL da solução de-hidratado cobre (II) cloreto ao frasco de reação e misture por 2 min. A solução permanecerá luz azul.</li>
	<li>Adicione 75 μL de 1 M NaOH para trazer o pH para 12 e permitem misturar por 2 h. A solução se tornará roxa.</li>
	<li>Dissolva o Ácido cloroáurico em água de grau HPLC para uma concentração de 5 mM.</li>
	<li>Adicionar 0,5 mL de Ácido cloroáurico aquosa ao frasco de reação e ajustar o pH volta a 12 usando 1 M de NaOH.</li>
	<li>Agite a mistura de reação para h 2. Nota: A solução deve evoluir para uma cor marrom.</li>
</ol>3. síntese de BSA-Ni(II)-Au(III)
<ol><li>Dissolva 25 mg de BSA em 1 mL de água de grau HPLC. A solução deve aparecer claramente.</li>
	<li>Dissolva o cloreto de níquel (II) hexaidratado em água de grau HPLC para uma concentração de 5 mM. A solução deve aparecer a luz verde.</li>
	<li>Adicione 1 mL da solução aquosa BSA para um frasco de reação de 5 mL e coloque num banho de água em 37 oC. agitar a mistura em 750 rpm.</li>
	<li>Imediatamente Adicione 0,5 mL da solução de hexaidrato cloreto de níquel (II) para o frasco de reação e misture por 2 min. Nota: A solução permanecerá luz verde.</li>
	<li>Adicione 75 μL de 1 M NaOH para trazer o pH para 12 e permitem misturar por 2 h. Nota: A solução se tornará amarelo escuro.</li>
	<li>Dissolva o Ácido cloroáurico em água de grau HPLC para uma concentração de 5 mM.</li>
	<li>Adicionar 0,5 mL de Ácido cloroáurico aquosa ao frasco de reação e ajustar o pH volta a 12.</li>
	<li>Agite a mistura de reação para h 2. Nota: A solução deve evoluir para uma cor marrom.</li>
</ol>4. síntese de [Cys34-capped-BSA]-Au(III)
<ol><li>Dissolva 2 mg de N-proteÃ (NEM) em 1 mL de salina tamponada fosfato (PBS, pH 7,4).</li>
	<li>Dissolva 2 mg de BSA em 1 mL de solução de PBS-NEM.</li>
	<li>Transferir a solução para um frasco de reação de 5 mL e agitar a 20 ° C a 500 rpm por 1h.</li>
	<li>Dialize a solução usando 12 kDa tubulação da diálise em 500 mL de PBS, agitando a 50 rpm com um agitador magnético durante a noite para remover NEM não tenha reagido.</li>
	<li>Dissolva o Ácido cloroáurico em PBS a uma concentração de 0,4 mM. Nota: A solução será um amarelo fraco.</li>
	<li>Transferência do frasco de reação para um banho de água a 37 ° C. Misture a 750 rpm.</li>
	<li>Imediatamente adicione 1 mL da solução de Ácido cloroáurico ao frasco de reação e permitir a mistura por 2 min.</li>
	<li>Adicione 75 μL de 1 M de NaOH no frasco de reação para trazer o pH para 12 e permitem misturar por 2 h.</li>
</ol>5. síntese de [all-thiol-capped-BSA]-Au(III)
<ol><li>Prepare uma solução de 2 M 50 milímetros e ureia bicarbonato de amónio (NH4HCO3, pH 8.0) em água de grau HPLC.</li>
	<li>Dissolva a 3,3 mg de BSA em 1 mL da solução acima e transferir para um frasco de reação de 5 mL.</li>
	<li>Fazer uma solução stock de 0,25 M tris(2-carboxyethyl) fosfina (TCEP) pela dissolução de 62,5 mg de TCEP em 1 mL de água HPLC.</li>
	<li>Adicione a solução-mãe de TCEP ao frasco de reação até que a concentração final de TCEP é de 8 mM.</li>
	<li>Incubar a solução em um banho de água durante 1 h a 50 ° C. Misture a 500 rpm utilizando um agitador magnético.</li>
	<li>Deixe a solução arrefecer completamente à temperatura ambiente.</li>
	<li>Prepare uma solução stock de 100mm NEM pela dissolução de 12,5 mg de NEM em 1 mL de água de grau HPLC.</li>
	<li>Adicione a solução stock de NEM ao frasco de reação até que a concentração final de NEM é 16 milímetros.</li>
	<li>Permitir que a solução combinar para 2 h a 20 ° C. Misture a 500 rpm.</li>
	<li>Dialize a solução usando um tubo de diálise 12 kDa, agitando a solução a 50 rpm com um agitador magnético durante a noite em 500 mL de 50mm NH4HCO3 para remover o excesso TCEP, NEM e ureia.</li>
	<li>Mover o frasco de reação para um banho-maria a 37 ° C e agitar a 750 rpm.</li>
	<li>Dissolva o Ácido cloroáurico em água de grau HPLC para uma concentração de 0,66 mM.</li>
	<li>Imediatamente adicione 1 mL da solução de Ácido cloroáurico ao frasco de reação e permitir a mistura por 2 min.</li>
	<li>Adicionar 1 M de NaOH até que o pH da solução é 12 e permitir que a solução continuar a misturar por 2 h.</li>
</ol>

<ol><li>Xie, J., Zheng, Y., Ying, J. Y. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja806804u">Protein-Directed Synthesis of Highly Fluorescent Gold Nanoparticles.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 888-889 (2009).</li>
<li>Saha, K., Agasti, S. S., Kim, C., Li, X., Rotello, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+Nanoparticles+in+Chemical+and+Biological+Sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Gold Nanoparticles in Chemical and Biological Sensing.</a> Chemical Reviews. 112, 2739-2779 (2012).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Gold+Nanostructures+for+Sensor+Applications%3A+A+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">New Gold Nanostructures for Sensor Applications: A Review.</a> Materials. 7, 5169-5201 (2014).</li>
<li>Chen, L. -Y., Wang, C. -W., Yuan, Z., Chang, H. -T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Gold+Nanoclusters%3A+Recent+Advances+in+Sensing+and+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Gold Nanoclusters: Recent Advances in Sensing and Imaging.</a> Analytical Chemistry. 87 (1), 216-229 (2015).</li>
<li>Cai, W., Gao, T., Hong, H., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+Gold+Nanoparticles+in+Cancer+Nanotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%2C+Science+and+Applications%22%5BJournal%5D)">Applications of Gold Nanoparticles in Cancer Nanotechnology.</a> Nanotechnology, Science and Applications. 1, 17-32 (2008).</li>
<li>Nune, S. K., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19743894">Nanoparticles for Biomedical Imaging.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 6, 1175-1194 (2009).</li>
<li>Dorsey, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+Nanoparticles+in+Radiation+Research%3A+Potential+Applications+for+Imaging+and+Radiosensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Gold Nanoparticles in Radiation Research: Potential Applications for Imaging and Radiosensitization.</a> Translational Cancer Research. 2, 280-291 (2013).</li>
<li>Daniel, M. -C., Astruc, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+Nanoparticles%3A+Assembly%2C+Supramolecular+Chemistry%2C+Quantum-Size-Related+Properties%2C+and+Applications+toward+Biology%2C+Catalysis%2C+and+Nanotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Gold Nanoparticles: Assembly, Supramolecular Chemistry, Quantum-Size-Related Properties, and Applications toward Biology, Catalysis, and Nanotechnology.</a> Chemical Reviews. 104 (1), 293-346 (2004).</li>
<li>Ferrari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+Nanotechnology%3A+Opportunities+and+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer Nanotechnology: Opportunities and Challenges.</a> Nature Reviews Cancer. 5, 161-171 (2005).</li>
<li>Huang, X., Jain, P. K., El-Sayed, I. H., El-Sayed, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+Nanoparticles%3A+Interesting+Optical+Properties+and+Recent+Applications+in+Cancer+Diagnostics+and+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Gold Nanoparticles: Interesting Optical Properties and Recent Applications in Cancer Diagnostics and Therapy.</a> Nanomedicine. 2, 681(2007).</li>
<li>Arvizo, R., Bhattacharya, R., Mukherjee, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+Nanoparticles%3A+Opportunities+and+Challenges+in+Nanomedicine%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Delivery%22%5BJournal%5D)">Gold Nanoparticles: Opportunities and Challenges in Nanomedicine.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 7, 753-763 (2010).</li>
<li>Doane, T. L., Burda, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Unique+Role+of+Nanoparticles+in+Nanomedicine%3A+Imaging%2C+Drug+Delivery+and+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">The Unique Role of Nanoparticles in Nanomedicine: Imaging, Drug Delivery and Therapy.</a> Chemical Society Reviews. 41, 2885(2012).</li>
<li>Egusa, S., Ebrahem, Q., Mahfouz, R. Z., Saunthararajah, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand+Exchange+on+Gold+Nanoparticles+for+Drug+Delivery+and+Enhanced+Therapeutic+Index+Evaluated+in+Acute+Myeloid+Leukemia+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ligand Exchange on Gold Nanoparticles for Drug Delivery and Enhanced Therapeutic Index Evaluated in Acute Myeloid Leukemia Models.</a> Experimental Biology and Medicine. 239, 853(2014).</li>
<li>Qu, X., et al. <a target="_blank" href="https://www.hindawi.com/journals/jnm/2015/784097/">Fluorescent Gold Nanoclusters: Synthesis and Recent Biological Application.</a> Journal of Nanomaterials. (784097), (2015).</li>
<li>Chakraborty, I., Pradeep, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomically+Precise+Clusters+of+Noble+Metals%3A+Emerging+Link+between+Atoms+and+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Atomically Precise Clusters of Noble Metals: Emerging Link between Atoms and Nanoparticles.</a> Chemical Reviews. 117, 8208-8271 (2017).</li>
<li>Raut, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+energy+transfer+from+tryptophan+to+BSA%2FHSA+protected+gold+nanoclusters%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+and+Applications+in+Fluorescence%22%5BJournal%5D)">Evidence of energy transfer from tryptophan to BSA/HSA protected gold nanoclusters.</a> Methods and Applications in Fluorescence. 2, (2014).</li>
<li>Le Guével, X., Daum, N., Schneider, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+Characterization+of+Human+Transferrin-Stabilized+Gold+Nanoclusters%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Synthesis and Characterization of Human Transferrin-Stabilized Gold Nanoclusters.</a> Nanotechnology. 22 (27), (2011).</li>
<li>Kawasaki, H., Yoshimura, K., Hamaguchi, K., Arakawa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin-Stabilized+Fluorescent+Gold+Nanocluster+for+Sensitive+and+Selective+Hg2%2B+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Trypsin-Stabilized Fluorescent Gold Nanocluster for Sensitive and Selective Hg2+ Detection.</a> Analytical Sciences. 27 (6), 591(2011).</li>
<li>Lu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysozyme-Stabilized+Gold+Nanoclusters+as+a+Novel+Fluorescence+Probe+for+Cyanide+Recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Spectrochimica+Acta+Part+A%3A+Molecular+and+Biomolecular+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">Lysozyme-Stabilized Gold Nanoclusters as a Novel Fluorescence Probe for Cyanide Recognition.</a> Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 121, 77-80 (2014).</li>
<li>Dixon, J. M., Egusa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+Change-Induced+Fluorescence+of+Bovine+Serum+Albumin-Gold+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Conformational Change-Induced Fluorescence of Bovine Serum Albumin-Gold Complexes.</a> Journal of the American Chemical Society. 140, 2265-2271 (2018).</li>
<li>Peters, T. Jr <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPeters%2C+T+%22All+About+Albumin%22">All About Albumin</a>. , (1996).</li>
<li>Masuoka, J., Saltman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc%28II%29+and+Copper%28II%29+Binding+to+Serum+Albumin.+A+Comparative+Study+of+Dog%2C+Bovine%2C+and+Human+Albumin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Zinc(II) and Copper(II) Binding to Serum Albumin. A Comparative Study of Dog, Bovine, and Human Albumin.</a> Journal of Biological Chemistry. 269, 25557-25561 (1994).</li>
<li>Takeda, K., Wada, A., Yamamoto, K., Moriyama, Y., Aoki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+Change+of+Bovine+Serum+Albumin+by+Heat+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Protein+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Conformational Change of Bovine Serum Albumin by Heat Treatment.</a> Journal of Protein Chemistry. 8 (5), 653-659 (1989).</li>
<li>Klotz, I. M., Curme, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Thermodynamics+of+Metallo-protein+Combinations.+Copper+with+Bovine+Serum+Albumin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">The Thermodynamics of Metallo-protein Combinations. Copper with Bovine Serum Albumin.</a> Journal of the American Chemical Society. 70, 939-943 (1948).</li>
<li>Fiess, H. A., Klotz, I. M. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja01124a008">The Thermodynamics of Metallo-Protein Combinations. Comparison of Copper Complexes with Natural Proteins.</a> J. Am. Chem. Soc. 74, 887-891 (1952).</li>
<li>Rao, M. S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Study+of+the+Interaction+of+Nickel%28II%29+with+Bovine+Serum+Albumin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A Study of the Interaction of Nickel(II) with Bovine Serum Albumin.</a> Journal of the American Chemical Society. 84, 1788-1790 (1962).</li>
<li>Peters, T. Jr, Blumenstock, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper-Binding+Properties+of+Bovine+Serum+Albumin+and+Its+Amino-terminal+Peptide+Fragment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Copper-Binding Properties of Bovine Serum Albumin and Its Amino-terminal Peptide Fragment.</a> Journal of Biological Chemistry. 242, 1574-1578 (1967).</li>
<li>Xue, Y., Li, X., Li, H., Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Thiol-Gold+Interactions+towards+the+Efficient+Strength+Control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Quantifying Thiol-Gold Interactions towards the Efficient Strength Control.</a> Nature Communications. 5, 4348(2014).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Protein+Characteristics+in+the+Formation+and+Fluorescence+of+Au+Nanoclusters%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">The Role of Protein Characteristics in the Formation and Fluorescence of Au Nanoclusters.</a> Nanoscale. 6 (3), 1515-1524 (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Os compostos de BSA-Au(III) preparados em pH 12 apresentam fluorescência vermelha em um comprimento de onda de emissão de λem= 640 nm quando excitadas com ultravioleta (UV) luz λex= 365 nm (figura 1A). O aparecimento de fluorescência vermelha é um processo lento e levará alguns dias à temperatura ambiente para aumentar a uma intensidade máxima. Executando a reação a 37 ° C irá produzir os melhores resultados, apesar de temperatura mais elevada pode ser usada pa...

Um composto de BSA-Au exibindo uma radiação ultravioleta (UV)-fluorescência vermelha excitável, com notável stokes turno, tem sido sintetizado originalmente por Xie et al. 1. a fluorescência vermelha única e estável pode encontrar várias aplicações em campos como a detecção de3,2,4, imagem5,6,7ou nanomedicina8 ,9,10,11,12,13. Este composto tem sido estudado extensivamente por muitos pesquisadores no campo da nano-ciência em anos recentes14,15,16. O composto de BSA-Au tem sido interpretado como Au25 nanoclusters. O objetivo do método apresentado é para examinar este composto em detalhe e para compreender a origem da fluorescência vermelha. Seguindo a abordagem apresentada, a presença de vários sites de ligação do Au e a origem da fluorescência, alternativa para a nucleação de single-site de Au25 nanoclusters, podem ser ilustrados. A mesma abordagem pode ser utilizada para estudar como outras proteínas17,18,19 complexado com Au(III) pode alterar suas propriedades intrínsecas, fluorescentes.
A síntese do composto fluorescente vermelha BSA-Au requer um controle estreito dos rácios molares da BSA para Au (BSA:Au) para maximizar a intensidade da fluorescência e a localização dos picos a excitação-emissão de mapa (EEM)20. Pode-se demonstrar que vários sites de vinculação existem para Au(III) vincular, incluindo o fragmento de asparagina (ou fragmento de Asp, os primeiro de quatro resíduos de aminoácidos no N-terminal da BSA)21,22. O aminoácido 34th de BSA (Cys-34) também é mostrado para coordenar Au(III) e de estar envolvido no mecanismo do fluorescence([Cys34-capped-BSA]-Au(III)) vermelho20. Fendendo a todas as ligações de bissulfeto Cys-Cys e tampando todos fluorescência de tióis, vermelho não é produzido ([all-thiol-capped-BSA]-Au(III)). Isto indica a necessidade de ligações de bissulfeto Cys-Cys como o sítio de ligação do Au(III) para produzir a fluorescência vermelha.
Técnicas de química de proteínas não foram amplamente utilizadas para estudar os complexos de BSA-Au(III) na Comunidade de nano-ciência. No entanto, é importante empregar estas técnicas para entender alguns aspectos destes complexos, bem como para obter uma compreensão detalhada dos locais de ligação Au(III) da BSA. Este artigo pretende mostrar algumas dessas técnicas.

<table><tbody><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA), 96%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A5611</td><td></td></tr><tr><td>cloreto de ouro (III) tri-hidratado, 99,9%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>520918</td><td></td></tr><tr><td>cloreto de cobre (II) di-hidratado, 99,999%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>459097</td><td></td></tr><tr><td>cloreto de níquel (II) hexahidratado, 99,9%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>654507</td><td></td></tr><tr><td>N-etilmaleimida (NEM), >99,0%</td><td>Cloridrato de Tris</td> (2-carboxietil) fosfina Sigma-Aldrich <td>4259</td><td></td></tr><tr><td>(TCEP), >98,0%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio, > 98,0%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Uréia, 99,5%</td> <td>Chem-Implex Int'l</td><td>30142</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fospato (PBS)</td> <td>Corning</td><td>MT21040CV</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de amônio, 99,5%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>9830</td><td></td></tr></tbody></table>

lumíforo formação em várias conformações de albumina de soro bovino por ligação de gold(iii)

Luminophore Formation in Various Conformations of Bovine Serum Albumin by Binding of Gold(III)

O objetivo dos protocolos apresentados é estudar o processo de ligação de Au(III) a BSA, rendendo fluorescência vermelha induzida pela mudança de conformação (λem = 640 nm) de complexos de BSA-Au(III). O método ajusta o pH para mostrar que o surgimento da fluorescência vermelha está correlacionado com as transições de equilíbrio de pH-induzida de conformações da BSA. Fluorescente vermelha BSA-Au(III) complexos só podem ser formados com um ajuste de pH igual ou superior a 9,7, que corresponde a conformação de "Uma-forma" da BSA. O protocolo para ajustar a BSA a razão molar de Au e para monitorar o tempo-curso do processo de vinculação de Au(III) é descrito. O número mínimo de Au(III) por BSA, para produzir a fluorescência vermelha, tem menos de sete anos. Descrevemos o protocolo em etapas para ilustrar a presença de vários sites de ligação Au(III) em BSA. Primeiro, pela adição de cobre (Cu(II)) ou níquel (Ni(II)) cações seguidas por Au(III), este método revela um sítio de ligação para Au(III) que não é o fluoróforo vermelho. Em segundo lugar, modificando BSA tiol tampando agentes, outro sítio de ligação de Au(III) nonfluorophore-formando é revelado. Em terceiro lugar, alterando a conformação de BSA por clivagem e nivelamento das ligações de bissulfeto, Au(III) possível ligação site é ilustrado. O protocolo descrito, para controlar as conformações de BSA e Au(III) ligação, pode ser aplicado geralmente para estudar as interações de outras proteínas e cátions metálicos.

De fluorescência do complexo BSA-Au(III), tem sido observado que a conversão da fluorescência azul intrínseca de BSA (λem = 400 nm) para fluorescência vermelha (λem = 640 nm) ocorre no sobre pH 9,7 através de um equilíbrio transição (Figura 1). EEM de BSA-Au(III) no BSA diferente rácios molar Au é mostrado na Figura 2, e esses dados mostram como alterar as proporções molares produz o mesmo ...

Os protocolos para estudar a ligação de ouro cátions (Au(III)) para várias conformações de albumina de soro bovino (BSA), bem como para caracterizar a fluorescência de BSA-Au única dependente conformacional são apresentadas.

Lumíforo formação em várias conformações de albumina de soro bovino por ligação de Gold(III)

The purpose of the presented protocols is to study the process of Au(III) binding to BSA, yielding conformation change-induced red fluorescence (&#955;em ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da nanociência, como formação de fluoróforos e complexos de proteínas médias. A principal vantagem dessa técnica é que ela ajuda a ilustrar locais específicos de ligação de metais e proteínas. Primeiro, dissolva 25 miligramas de BSA em um mililitro de água de grau HPLC em um frasco de reação de cinco mililitros contendo uma barra de agitação magnética.Em seguida, prepare uma solução de cinco milimolares de ácido cloroáurico e água de grau HPLC. Coloque o frasco de reação contendo a solução de BSA em banho-maria a 37 graus Celsius e agite a 750 RPM usando um agitador magnético. Imediatamente após o início da agitação, adicionar um mililitro da solução de ácido cloroáurico à solução de BSA.Depois de mexer por dois minutos, adicione 100 microlitros de hidróxido de sódio molar à solução para trazer o PH para 12. Dissolver 25 miligramas de BSA num mililitro de água de qualidade HPLC num frasco para injetáveis de reacção. Em seguida, prepare uma solução de cinco milimolares de cloreto de cobre di-hidratado em água de grau HPLC.Adicione um mililitro da solução BSA a um frasco de reação de cinco mililitros contendo uma barra de agitação magnética e coloque-o em banho-maria a 37 graus Celsius. Agitar a solução a 750 RPM. Adicione imediatamente 0,5 mililitros da solução di-hidratada de cloreto de cobre ao frasco de reação.Depois de mexer por dois minutos, adicione 75 microlitros de hidróxido de sódio molar à solução para trazer o PH para 12 e mexa por duas horas. Em seguida, preparar uma solução de ácido cloroáurico de cinco milimolares em água para HPLC. Adicione 0,5 mililitros da solução de ácido cloroáurico ao frasco para injetáveis de reação.Em seguida, ajustar o PH para 12 utilizando um hidróxido de sódio molar e agitar a solução durante duas horas. Adicione um mililitro de solução BSA a um frasco de reação de cinco mililitros contendo uma barra de agitação magnética e coloque-o em banho-maria a 37 graus Celsius. Agitar a solução a 750 RPM.Adicione imediatamente 0,5 mililitros de uma solução hexahidratada de cloreto de níquel de cinco milimolares previamente preparada ao frasco de reação. Depois de mexer por dois minutos, adicione 75 microlitros de hidróxido de sódio molar para levar o PH a 12 e mexa por duas horas. Adicione 0,5 mililitros de solução de ácido cloroáurico de cinco milimolares ao frasco para injetáveis de reação.Em seguida, ajustar o PH para 12 utilizando um hidróxido de sódio molar e agitar a mistura de reacção durante duas horas. Dissolva dois miligramas de N-etilmaleimida em um mililitro de PBS. Em seguida, dissolva dois miligramas de BSA em um mililitro da solução de maleimida.Transferir a solução para um frasco de reação de cinco mililitros contendo uma barra de agitação magnética e agitar a 20 graus Celsius e 500 RPM durante uma hora. Após uma hora, dialisar a solução usando um tubo de diálise de 12 kilodalton em 500 mililitros de PBS. Agitar a 50 RPM com um agitador magnético durante a noite para remover a etilmaleimida não reagida.No dia seguinte, transfira o frasco de reação contendo a solução de maleimida para um banho-maria a 37 graus Celsius e agite a 750 RPM. Adicione imediatamente uma solução de ácido cloroáurico 0,4 milimolar previamente preparada ao frasco para injetáveis de reação. Depois de mexer por dois minutos, adicione 75 microlitros de hidróxido de sódio molar à solução para trazer o PH para 12 e mexa por duas horas.Preparar uma solução de ureia de dois molares e de bicarbonato de amónio 50 milimolares em água de qualidade HPLC. Em seguida, dissolva 3,3 miligramas de BSA em um mililitro da solução de ureia e transfira para um frasco de reação de cinco mililitros contendo uma barra de agitação magnética. Em seguida, prepare uma solução estoque de TCEP 0,25 molar dissolvendo 62,5 miligramas de TCEP e um mililitro de água de grau HPLC.Adicionar a solução-mãe ao frasco para injetáveis de reação até que a concentração final de TCEP seja de oito milimolares. Em seguida, incube a solução em banho-maria por uma hora a 50 graus Celsius com agitação a 500 RPM. Enquanto isso, prepare uma solução de estoque de 100 nanomolares de N-etilmaleimida dissolvendo 12,5 miligramas de N-etilmaleimida em um mililitro de água de grau HPLC.Adicionar a solução-mãe ao frasco para injetáveis de reação arrefecida até que a concentração final de N-etilmaleimida seja de 16 milimolares. Em seguida, mexa a 20 graus Celsius e 500 RPM por duas horas. Dialisar a solução usando 12 tubos de diálise kelodalton em 500 mililitros de bicarbonato de amônio 50 milimolar, mexendo a 50 RPM com um agitador magnético durante a noite para remover o excesso de reagentes.No dia seguinte, transfira o frasco de reação para um banho-maria a 37 graus Celsius e agite a 750 RPM. Adicione imediatamente um mililitro de solução de ácido cloroáurico 0,66 milimolar previamente preparada ao frasco para injetáveis de reacção. Depois de mexer por dois minutos, adicione um hidróxido de sódio molar à solução até que o PH seja 12 e mexa por duas horas.A partir da fluorescência do complexo BSA ouro três, observou-se que a conversão da fluorescência azul intrínseca da BSA em fluorescência vermelha ocorre em torno de PH 9,7 por meio de uma transição de equilíbrio. Os mapas de emissão de excitação de ouro três de BSA em diferentes proporções molares de BSA para ouro mostram como a alteração das razões molares produz o mesmo comprimento de onda de emissão em diferentes comprimentos de onda de excitação. Cobre, níquel e ouro ligam-se competitivamente a um local conhecido na BSA.A cisteína 34 BSA revestida mostra uma mudança nos padrões de pico do mapa de excitação-emissão após a ligação do ouro e esses resultados mostram como a alteração de locais de ligação específicos altera os padrões de fluorescência. O BSA totalmente coberto com tiol não mostra fluorescência vermelha e revela ligações dissulfeto cisteína-cisteína como possíveis locais de ligação para produzir o fluoróforo vermelho. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de ajustar o PH conforme descrito ou usar o tampão correto, pois a formação de fluoróforos depende da mudança induzida pelo PH das confirmações de proteínas.

luminophore-formation-various-conformations-bovine-serum-albumin

Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

Demonstramos FRET entre polydiacetylene polímero conjugado (PDA) e fluoróforo ligado à superfície dos lipossomas de PDA para a detecção de biomoléculas. PDA lipossomas também continha moléculas receptoras nas suas superfícies de biomoléculas a ser utilizados como sondas. Interacções ligando-receptor conduzir a alterações na eficiência de TERF entre o fluoróforo e o PDA, que é a base de mecanismo de detecção.

Monitoramento em tempo real de Ligante-receptor Interações com transferência de energia de ressonância de fluorescência

Neste vídeo, demonstramos a imunomarcação com ouro de biomarcadores localizados na região do lúmen de cortes exossômicos ultrafinos. Essa técnica permite o diagnóstico precoce de doenças pela visualização de moléculas-alvo dentro dos exossomos secretados pelas células doentes.

Imunomarcação de ouro de cortes exossômicos: uma técnica para visualizar marcadores diagnósticos no lúmen exossômico

Um protocolo para triagem de drogas moleculares pequenas baseado na síntese in-situ de nanoclusters de ouro fluorescentes ultrapequenos (Au NCs) usando proteína carregada de drogas como modelo é apresentado. Este método é simples para determinar a afinidade de ligação de drogas a uma proteína-alvo por um sinal fluorescente visível emitido pelos NCs de Au moldados por proteínas.

Uma rápida e quantitativa método fluorimétrico para-Targeting proteína pequena molécula Rastreio de drogas

Para obter informações básicas sobre a sorção e reciclagem de ouro de sistemas aquosos foi investigada a interação de nanopartículas de Au(III) e Au(0) em proteínas da camada S. A sorção de polímeros proteicos foi investigada por ICP-MS e a de monocamadas proteicas por QCM-D. O AFM subsequente permite a imagem latente das nanoestruturas.

Au-Interação de Slp1 Polímeros e monocamada de<em&gt; Lysinibacillus sphaericus</em&gt; JG-B53 - QCM-D, o ICP-MS e AFM como Ferramentas para Estudos biomolécula metal-

As sondas ópticas baseadas em nanopartículas foram projetadas como um veículo para detectar antígenos usando espectroscopia Raman e UV-Vis. Aqui descrevemos um protocolo para preparar tais sondas para um imunoensaio de espectroscopia UV-Vis / Raman de forma a incorporar futuros recursos de multiplexação.

A fabricação de um UV-Vis e espectroscopia Raman de plataforma Imuno

Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar a homogeneidade de rotulagem para cada espécie de proteína em uma amostra de proteína complexa a nível da molécula.

Quantificação de Proteome-largo de rotulagem homogeneidade a nível da molécula

Um método confiável e facilmente reprodutível para a preparação de nanoaglomerados de ouro fotoluminescentes funcionais e quase infravermelhos e sua detecção direta dentro das células HeLa por citometria de fluxo e microscopia de varredura a laser confocal é descrito.

Síntese de nanoaglomerados de ouro emissor próximos para aplicações biológicas

O presente protocolo descreve uma tecnologia de marcação por microscopia eletrônica clonável para detecção de proteínas marcadas com metalotioneína em células usando uma nova técnica de síntese de nanopartículas de ouro baseada em mecanismo de supressão de autonucleação.

Síntese Direta de Nanopartículas de Ouro EM-Visíveis em Células para Análise de Localização de Proteínas com Ultraestrutura Bem Preservada

Aqui, apresentamos um método sistemático que descreve a automontagem quase reversível dos agregados de ouro de 20 nm revestidos com beta amilóide 1-40 (Aβ 1-40). A rede quase reversível dependente do tamanho nanométrico entre os peptídeos foi correlacionada com aminoácidos específicos ou seções do monômero Aβ 1-40.

Caracterização da automontagem reversível dependente de pH de colóides de ouro revestidos com beta-amiloide 1-40

Proteínas de ligação de gelo (IBPS), também conhecidas como proteínas anticongelantes, inibir o crescimento do gelo e são um aditivo promissor para uso na criopreservação de tecidos. A principal ferramenta utilizada para investigar IBPS é o osmómetro nanolitro. Nós desenvolvemos uma casa projetada fase de arrefecimento montado em um microscópio óptico e controlados usando uma custom-built rotina LabVIEW. O osmómetro nanolitro descrito aqui manipulado a temperatura da amostra de forma...

LabVIEW operado Osmometer nanolitro Novel de Investigações de gelo ligação às proteínas

Aprenda a investigar a formação de fluoróforos vermelhos na albumina de soro bovino (BSA) por ligação de Au(III), analisando mudanças conformacionais dependentes de pH e sítios de ligação específicos.

Lumíforo formação em várias conformações de albumina de soro bovino por ligação de Gold(III)

Explorar mais vídeos