Um método de cultura Proximal para estudar a parácrina sinalização entre as células

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo das comunicações intercelulares sobre interações parácrinas recíprocas versus justacrinas entre dois tipos de células. A principal vantagem deste método é que é uma técnica muito simples e reprodutível que captura com precisão a sinalização parácrina em condições típicas de cultura e, ao mesmo tempo, evita a sinalização justacrina eficaz. As implicações dessa técnica se estendem a uma melhor compreensão do mecanismo da diafonia entre as células cancerígenas e o microambiente tumoral.

Embora esse método possa fornecer informações sobre as interações entre as células cancerígenas e o estroma tumoral, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como cicatrização de feridas e angiogênese. Comece destacando as células cancerígenas do ovário de uma mistura 80% confluente com um mililitro de 0,25% de tripsina por 40 a 60 segundos, seguido pela neutralização da reação com seis mililitros de meio de crescimento completo. Colete as células por centrifugação e ressuspenda o pellet em cinco mililitros de meio de crescimento completo fresco.

Após a contagem, dilua as células para 100.000 células de câncer de ovário por mililitro de concentração completa do meio de crescimento e coloque três inserções de cultura de células de membrana de policarbonato tratadas com cultura de tecidos de poros invertidos de 0,4 micrômetro por condição experimental em uma placa de cultura de tecidos estéreis de tamanho apropriado. Rotule as inserções de acordo com a condição experimental e pipete cuidadosamente as células cancerígenas na parte inferior de cada inserção em círculos concêntricos, começando no meio da membrana e movendo-se para fora para formar uma cúpula de 800 microlitros. Seja extremamente cuidadoso ao semear as células na superfície inferior do inserto para que a cúpula do meio contendo células não escorra das bordas do inserto durante a incubação.

Quando todas as inserções tiverem sido semeadas, cubra o prato e coloque-as cuidadosamente na incubadora de cultura de células. Após cerca de quatro horas, destacar o HPMC com dois mililitros de 0,25% de tripsina por um a dois minutos, seguido de neutralização da reação com 12 mililitros de meio de crescimento completo. Colete o HPMC por centrifugação e ressuspenda o pellet em 10 mililitros de meio de crescimento completo para contagem.

Dilua as células a 300.000 HPMC por mililitro de meio de crescimento completo e adicione 2,5 mililitros de meio de crescimento completo fresco a cada poço de uma placa de cultura de seis poços. Usando uma pinça estéril, coloque cada inserção com o lado direito para cima em cada poço da placa de seis poços para que as superfícies inferiores das células cancerígenas do ovário fiquem imersas no meio. Em seguida, semeie 1,5 mililitros de HPMC no poço de cada inserto.

Em seguida, coloque a placa na incubadora de cultura de células por 72 horas. No final da incubação, remova cuidadosamente as inserções de cada poço e enxágue os dois lados das inserções com PBS. Coloque cada inserto em uma nova placa de seis poços e adicione 0,5 mililitros de tripsina aos poços de inserção e dois mililitros de tripsina aos poços inferiores.

Após dois minutos a 37 graus Celsius, adicione um mililitro de meio de crescimento completo a cada inserção e pipete cuidadosamente a solução algumas vezes sem rasgar a membrana ou derramar a suspensão celular no poço abaixo. Durante a pipetagem, deve-se tomar cuidado para evitar a contaminação cruzada das células de uma câmara com as outras. Transfira as células ressuspensas para um tubo de coleta rotulado e neutralize ainda mais a tripsina com mais dois mililitros de meio de crescimento completo.

Para coletar as células no fundo das inserções, lave o fundo das membranas duas a três vezes com os dois mililitros de tripsina do poço correspondente da placa de seis poços, de modo que as células destacadas fiquem presas no fundo do poço apropriado. Quando todas as células tiverem sido destacadas, neutralize a tripsina em cada poço com seis mililitros de meio de crescimento fresco e transfira as suspensões celulares para tubos de coleta rotulados. Em seguida, colete todas as células por centrifugação e ressuspenda os pellets em 0,7 mililitros de reagente de lise à base de tiocianato de fenol e guanidina por tubo para extração e isolamento de RNA de acordo com protocolos padrão.

A cultura proximal de HPMC com células de câncer de ovário resulta em um aumento da expressão de fibronectina e Fator de Crescimento Transformador ou TGF beta em comparação com o HPMC de controle semeado em inserções na ausência de células cancerígenas. A expressão de fibronectina e TGF beta one também aumenta significativamente em células de câncer de ovário após cultura proximal com HPMCs em comparação com células ovarianas de controle cultivadas na ausência de HPMC. Por outro lado, as células de câncer de ovário tratadas com meio condicionado HPMC demonstram uma expressão de fibronectina significativamente reduzida sem alteração na expressão de TGF beta one.

O bloqueio do TGF beta um com um anticorpo neutralizante, no entanto, resulta em uma diminuição significativa na expressão de TGF beta um em células de câncer de ovário em cultura proximal com HPMCs. Curiosamente, um ligeiro aumento na expressão de TGF beta um é observado em células de câncer de ovário de controle não cultivadas proximalmente, provavelmente como uma resposta compensatória. A cultura proximal com células de câncer de ovário aumenta ligeiramente a expressão de E-caderina em HPMCs, enquanto uma diminuição acentuada na E-caderina é observada em células de câncer de ovário cultivadas nas proximidades de HPMCs em comparação com controles, demonstrando ainda mais a eficácia do sistema de cultura proximal para estudar a sinalização parácrina entre células de câncer de ovário e células normais no local da metástase.

Ao tentar este procedimento, é importante otimizar o número de células semeadas e a duração da cultura proximal. Após este procedimento, outros métodos, como immunoblotting, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre as mudanças na expressão de proteínas e a ativação das vias de sinalização de processamento a jusante durante a co-cultura de células mesoteliais de células tumorais. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo do microambiente tumoral, imunologia e biologia do desenvolvimento explorarem interações parácrinas recíprocas entre células por meio de fatores secretados.