Name: Um método de cultura Proximal para estudar a parácrina sinalização entre as células (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Aprenda a usar o método de cultura proximal para estudar sinalização parácrina entre células de câncer de ovário e HPMCs. Esta técnica simples e reprodutível isola efeitos parácrinos sem contato direto celular.

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Estamos em dívida para com os pacientes para a sua participação na coleção de tecidos para estas experiências. Um prêmio de academia do DoD OCRP ovário câncer (W81XWH-15-0253) e um piloto prêmio da Fundação de sonho de Colleen para Anirban K. Mitra apoiaram esta pesquisa.

O protocolo segue as diretrizes do Conselho regulamentação institucional da Indiana University.
1. preparação da pilha
<ol><li>
Isolamento e cultura de células mesoteliais primárias de
	<ol>
<li>Isolado primárias mesoteliais células humanas (HPMCs) de omento humana como descrito anteriormente,17,18 e cultivá-las em completar o meio de crescimento [modificado águia de Dulbecco médio (DMEM) contendo 10% de soro bovino fetal, 1% penicilina-estreptomicina, 1% não aminoácidos essenciais e vitaminas 1%] a 37 ° C e 5% de CO2. Nota: Os HPMCs são normalmente cultivadas para a confluência de 100% (figura 1A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Condições de crescimento de células de câncer de ovário
	<ol>
<li>Desenvolvem-se células de câncer de ovário HeyA8 meio de crescimento completa em 37 ° C e 5% de CO2. Nota: Uso HeyA8 células cultivadas para cerca de 80% confluência (figura 1B).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. cultura de pilha
<ol><li>
Set-up cultura proximal
	<ol>
<li>Uso Transwell insere para placas boas 6 com uma membrana de policarbonato μm de espessura de tecido-cultura-tratados 10 com 0,4 μm poros (108 poros/cm2) e uma área de crescimento 4,67 cm2 . Se necessário, otimize para inserção de diferentes tamanhos, dimensionando o número de células semeado de acordo com a área de superfície de crescimento. Meio quente completo crescimento, tripsina e fosfato salino (PBS) a 37 ° C antes do uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparando as inserções
	<ol>
<li>Para propagar as células HeyA8 na superfície da membrana da inserção inferior, remova o encaixe de sua embalagem utilizando Pinças esterilizadas e coloque-invertida em um prato de cultura estéril de 15 cm.</li>
		<li>Use um prato de 15 cm, pois tem a profundidade para acomodar a inserção invertida, ou substituí-lo com qualquer recipiente estéril apropriado. Dependendo do experimento, coloque o número necessário de inserções no prato 15 cm.</li>
		<li>Rotule os três controles e três condições experimentais em conformidade com um marcador na borda das pastilhas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparando as células cancerosas
	<ol>
<li>Para trypsinize as HeyA8 células cultivadas na confluência de 80% em um balão de2 25 cm (~ 2 x 106 células), adicionar 1 mL de tripsina (0,25%) para 40-60 s e neutralizar a tripsina com 6 mL de meio de cultura completo.</li>
		<li>Centrifugar as células a 500 x g , à temperatura ambiente (RT) por 3 min, desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em 5 mL de meio de cultura completo. Conte as células ao vivo usando o método de exclusão do corante azul de Tripan.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Semeando as células cancerosas
	<ol>
<li>Suspenda a 100.000 células/mL de células de HeyA8 ao vivo no meio de crescimento completo. Cuidadosamente semente 80.000 HeyA8 células suspendidas em 800 μL de meio de cultura completo na parte inferior da inserção (que está agora virada para cima, uma vez que está invertida).</li>
		<li>As sementes das células para formar uma forma de cúpula, como assim as células permanecem na pastilha (Figura 1). Iniciar a partir do centro da membrana e mover-se para fora em círculos concêntricos ao Pipetar lentamente. Evite passar mais de 3 mm da borda para prevenir qualquer derramamento de médio porte. Nota: O número de células semeadas dependerá da taxa de crescimento das células e a duração do experimento. O número de células HeyA8 semeado para esta cultura proximal foram otimizado e as células será confluente 80 – 90% no final do terceiro dia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Acessório de células de câncer
	<ol>
<li>Cubra o prato de 15 cm e cuidadosamente mover o prato contendo as inserções para a incubadora de CO2 . É fundamental para que não perturbe a gota de médio e células na pastilha nesta etapa. Embora as células a 37 ° C por 4 h permitir que as células cancerosas anexar para a inserção.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparando as células mesoteliais
	<ol>
<li>Após cerca de 4 h, trypsinize as HPMCs crescidos na confluência de 100% em um balão de2 75cm (~ 4 x 106 células) com 2 mL de tripsina (0,25%) por 1 – 2 min e neutralizar a tripsina com 12 mL de meio de crescimento completo.</li>
		<li>Centrifugar as células a 500 x g em RT por 3 min, Ressuspender as células em 10 mL de meio de cultura completo e contagem de células vivas, usando o método de exclusão do corante azul de Tripan.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Semeando as células mesoteliais
	<ol>
<li>Suspenda a 300.000 células/mL de HPMCs ao vivo no meio de crescimento completo. Adicione 2,5 mL de meio fresco completo de crescimento para cada poço de uma placa de 6. Cuidadosamente trazer o prato de 15 cm, contendo as inserções para fora para o bairro de biossegurança. Usando pinça estéril, a inserção da aleta e colocá-lo no poço da placa de 6-bem para que fique na posição vertical, com as células de HeyA8 ligadas à superfície inferior imergida no meio de crescimento completo (Figura 1).</li>
		<li>Semente de 450.000 HPMCs suspendidos em 1,5 mL do meio de crescimento no interior dos implantes com as células de HeyA8 ligadas à superfície, virado para o fundo do poço (Figura 1) ou para inserções sem quaisquer células HeyA8 para os controles HPMC. Adicione 1,5 mL de meio de crescimento sem pilhas para os controles HeyA8.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Crescer a cultura proximal
	<ol>
<li>Deixe a cultura proximal crescem a incubadora de CO2 a 37 ° C e 5% de CO2 por 72 h. Se necessário, o meio pode ser reposto da seguinte forma.<ol>
<li>Para o interior da inserção, remover 750 µ l e adicionar 750 µ l de meio fresco crescimento completo.</li>
			<li>Para o exterior da inserção (a 6 placa), retire 1 mL e adicionar 1 mL de meio fresco crescimento completo. O 1 mL foi escolhido para a conveniência de mudar o meio em uma única etapa. Se desejado, 1,25 mL pode ser removido e substituído em vez disso.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Recolha as células
	<ol>
<li>Recolha as células após 72 h da cultura proximal. Tome especial cuidado nesta etapa para evitar a contaminação cruzada de células HeyA8 e HPMCs. Trypsinize as células, centrifugue-los e lyse a pelota em vez de Lise das células na membrana para evitar uma contaminação cruzada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Trypsinizing as células
	<ol>
<li>Enxágue ambos os lados da inserção com PBS 1x.</li>
		<li>As inserções de transferência para um novo poço e adicionar a tripsina. Adicionar 0,5 mL de tripsina no interior da inserção e adicionar 2 mL de tripsina para a placa de 6 para trypsinize as células de câncer ligadas à superfície inferior da inserção. Incubar a placa por 2 min a 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Neutralizando a tripsina
	<ol>
<li>Adicione 1 mL de meio de cultura completo no interior da inserção para neutralizar a tripsina, Pipetar para cima e para baixo e depois levar as células e transferi-los para um tubo de recolha rotulado. Adicione um adicional 2 mL do meio de crescimento completo de uma neutralização completa. Tenha cuidado para não perfurar a membrana enquanto pipetagem para evitar uma contaminação cruzada das células.</li>
		<li>Para coletar as células na parte inferior da inserção, pipete a tripsina 2ml que foi adicionada na etapa 12.2 para a superfície inferior 2 – 3 x para que as células cair na parte inferior da placa 6-poços. Neutralizar a tripsina na parte inferior da placa com 6 mL de meio de crescimento e transferir o conteúdo da placa para um tubo de recolha rotulado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Coletando e lise das células
	<ol>
<li>Centrifugar as células a 500 x g por 3 min e Aspire os meios de comunicação. Resuspenda e lyse as pelotas de célula com 0,7 mL de reagente de Lise fenol e guanidina tiocianato-baseada para a extração de RNA. Isole o RNA usando qualquer kit apropriado.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa
Nota: As etapas a seguir descrevem uma reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa (qPCR) para estudar as mudanças de expressões do gene como resultado a cultura proximal.
<ol><li>Prepare o cDNA de amostras de RNA para qPCR. Usar qualquer apropriado transcriptase reversa com um buffer correspondente e primers aleatórios para garantir a transcrição reversa do mRNA todos (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Avaliar as alterações dos níveis de expressão de RNAm de fibronectina (FN1) e E-caderina (CDH1) e transformar o fator de crescimento beta 1 (TGFβ1) por qPCR com gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) como um controle interno. É possível usar padronizados ensaios de expressão de gene comercialmente disponíveis (ver Tabela de materiais) ou para projetar primers.</li>
	<li>Compare as HeyA8 células crescidas na cultura proximal com HPMCs com os controles HeyA8 e as HPMCs crescidos em cultura proximal com os controles HPMC.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Compreender o mecanismo de parácrina e justácrina sinalização entre as células é essencial para o desenvolvimento de um melhor conhecimento do tecido normal homeostase e doença condições7,8. Parácrina a maioria dos estudos são conduzidos através da recolha de sinalização condicionado médio de uma célula tipo e usá-lo para tratar o outro tipo de célula. Este método tem uma vantagem em sua simplicidade inerente. No entanto, isso não com precisão recapitular as conc...

O papel de produtivas interações recíprocas entre as células cancerosas e o microambiente do tumor na progressão do tumor foi bem estabelecido e tornou-se um grande foco de pesquisa em câncer biologia1. Instâncias similares de sinalização bidirecional são cruciais durante o ferida cura, respostas imunes, angiogênese, nichos de células-tronco e desenvolvimento2,3,4,5,6 , 7 , 8. um tema comum em todos estes processos biológicos é que células respondem de várias maneiras para sinais extracelulares de seu microambiente que determinam o destino de celular, fisiologia do tecido e progressão da doença. Portanto, o foco tornou-se cada vez mais em direção a desenvolver uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos em tais comunicações célula-célula. A maioria de tais interações envolvem parácrina ou justácrina sinalização entre as células. Sinalização parácrina envolve a secreção de fatores específicos sinalização por uma célula que são percebidas pelos receptores correspondentes na outra célula na vizinhança, desencadeando uma resposta dentro de9,10, Considerando que justácrina sinalização requer o contato direto entre os componentes celulares das duas células envolvidas11,12.
Essa sinalização é um componente crucial na homeostase do tecido, bem como o microambiente do tumor. As células cancerosas beneficiam parácrina e justácrina fatores de células do estroma do tumor, incluindo cancro associado fibroblastos (CAFs), células do sistema imunológico e adipócitos13,14,15,16. A sinalização pode ser mediada por fatores de crescimento, citocinas, quimiocinas, etc., enquanto a sinalização justácrina envolve justapostos ligantes e receptores como sinalização Notch, ou interações entre integrinas e seus respectivos parácrina proteínas da matriz extracelular. Nós demonstramos a importância das interações recíprocas entre as células de câncer de ovário e CAFs no14, de progressão e metástase tumor. Da mesma forma, as interações de células de câncer de ovário metástase com as células mesoteliais, cobrindo o local da metástase regulam chave microRNAs e fatores de transcrição em células cancerosas que promovem a colonização metastático17, 18.
A maioria dos estudos na sinalização parácrina envolvem o uso de um meio condicionado coletado de tipo de uma célula para tratar o segundo tipo de célula com. Enquanto esta abordagem tem sido amplamente utilizada, ele não Replica eficazmente os níveis de alta concentração localizados do fator secretado no microambiente da célula receptora. Também não consegue reproduzir a cinética do fluxo contínuo do fator secretado sendo produzido por uma célula e recebido pela célula vizinha. Parácrina é eficaz em distâncias curtas, como os fatores secretados são nas concentrações necessárias apenas nas imediações da célula de origem e tendem a difundir e diluir para fora à medida que aumenta a distância de sinalização. Esta alta concentração localizada do fator secretado é essencial para desencadear uma resposta na célula do receptor. Além disso, a resposta nas células destinatários também é dependente o equilíbrio dos fatores secretados recentemente e seu esgotamento contínuo através de degradação, vinculação e internalização no destinatários células e difusão longe da célula de origem. Meio condicionado pode ser concentrado a conta para as altas concentrações localizadas presentes no microambiente, mas que exatamente não pode replicar as concentrações exatas. Além disso, ele não pode imitar a cinética natural de produção e depleção do fator envolvido. Para mais precisão replicar sinalização parácrina e separá-lo de justácrina mecanismos de sinalização, criámos um método de cultura proximal romance, que envolve os tipos de duas células em qualquer superfície de uma membrana porosa a crescer. Os poros são pequenos o suficiente para evitar interações justácrina e ainda permitir a troca de fatores secretados em concentrações elevadas localizadas. Dessa forma, este sistema retém a cinética da produção e depleção dos fatores parácrina.

<table><tbody><tr><td>Suporte permeável Transwell de 24 mm com 0,4 &micro; m Inserção de Membrana de Policarbonato de Poros</td><td>Corning (Costar)</td><td>3412</td><td>&bull; 10 &micro; membrana de policarbonato translúcido de espessura m &bull; Tratado para fixação celular ideal &bull; Embalado 6 insertos em uma placa de 6 poços, 4 placas por caixa &bull; A membrana deve ser corada para visibilidade celular &bull; Esterilizado por radiação gama</td></tr><tr><td>Placa de 6 poços</td><td>Corning (Falcon)</td><td>353046</td><td>Fundo plano, tratado com TC, estéril, com tampa</td></tr><tr><td>Placa de cultura de 15 cm</td><td>Corning (Falcon)</td><td>353025</td><td>Estéril, placa de cultura de células tratada com TC</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning (Cellgro)</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>MEM Amino não essencial ácidos</td><td>Corning (Cellgro)</td> <td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>MEM Vitaminas</td><td>Corning (Cellgro)</td> <td>25-020-CI</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Tripsina, 2,21 mM EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas</td><td></td><td></td><td>Qualquer marca é boa</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td></td><td></td> de CO2 <td>Qualquer marca é boa</td></tr><tr>Gabinete <td></td><td></td><td>de nível II de biossegurança</td><td>Qualquer marca está bem</td></tr><tr><td>FN1 TaqMan Ensaio de Expressão Gênica</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Hs01549976_m1</td><td></td></tr><tr><td>TGFB1 Ensaio de Expressão Gênica TaqMan</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Hs00998133_m1</td><td></td></tr><tr><td>CDH1 Ensaio de Expressão Gênica TaqMan</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Hs01023895_m1</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH Expressão Gênica TaqMan Ensaio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Hs99999905_m1</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy mini kit de isolamento de RNA</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>Kit de transcrição reversa de cDNA de alta capacidade</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>43-688-13</td><td></td></tr><tr><td>Células de câncer de ovário HeyA8</td><td>Obtido do Laboratório Ernst Lengyel, Universidade de Chicago</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TGF&beta; Neutralizante R</td> & de anticorpos <td> D Sistemas</td><td>MAB1835-100</td><td></td></tr></tbody></table>

um método de cultura proximal para estudar a parácrina sinalização entre as células

A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells

Interações intercelulares desempenham um papel importante em muitos processos biológicos, incluindo a progressão do tumor, respostas imunes, angiogênese e desenvolvimento. Parácrina ou sinalização justácrina Medeia tais interações. O uso de um meio condicionado e estudos coculture são os métodos mais comuns para discriminar entre estes dois tipos de interações. No entanto, o efeito de concentrações elevadas localizadas dos fatores secretados para o microambiente durante as interações parácrina não é instaurado com precisão por meio condicionado e, assim, pode levar a conclusões imprecisas. Para superar este problema, criámos um método de cultura proximal para estudar a sinalização parácrina. Os tipos de duas células são cultivados em qualquer superfície de uma membrana de policarbonato µm de espessura 10 com 0,4 µm de poros. Os poros permitem a troca de fatores secretados e, ao mesmo tempo, inibem a sinalização justácrina. As células podem ser coletadas e lysed no ponto de extremidade para determinar os efeitos da sinalização parácrina. Além de permitir para localizadas gradientes de concentração dos fatores secretados, este método é passível de experimentos que envolvem períodos prolongados de cultura, bem como o uso de inibidores. Enquanto nós usamos este método para estudar as interações entre as células de câncer de ovário e as células mesoteliais que encontram no local da metástase, pode ser adaptado para qualquer dois tipos de células aderentes aos pesquisadores estudar parácrina sinalização em vários campos, incluindo desenvolvimento, imunologia e microambiente do tumor.

Metástase de células de câncer de ovário encontram células mesoteliais no local da metástase dentro da cavidade peritoneal19. Produtivo parácrina e justácrina interações com a ajuda de células mesoteliais na indução de respostas adaptáveis nas células de câncer de ovário, que permitem sucesso metástase17,18,20,21 . Para testar a eficácia ...

Parácrina e justácrina interacções celulares desempenham um papel importante em muitos processos biológicos, incluindo a progressão do tumor, respostas imunes, angiogênese e desenvolvimento. Aqui, um método de cultura proximal é usado para estudar a sinalização parácrina onde as concentrações localizadas dos fatores secretados são mantidas, evitando o contato direto do celular.

Um método de cultura Proximal para estudar a parácrina sinalização entre as células

Intercellular interactions play an important role in many biological processes, including tumor progression, immune responses, angiogenesis, and ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo das comunicações intercelulares sobre interações parácrinas recíprocas versus justacrinas entre dois tipos de células. A principal vantagem deste método é que é uma técnica muito simples e reprodutível que captura com precisão a sinalização parácrina em condições típicas de cultura e, ao mesmo tempo, evita a sinalização justacrina eficaz. As implicações dessa técnica se estendem a uma melhor compreensão do mecanismo da diafonia entre as células cancerígenas e o microambiente tumoral.Embora esse método possa fornecer informações sobre as interações entre as células cancerígenas e o estroma tumoral, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como cicatrização de feridas e angiogênese. Comece destacando as células cancerígenas do ovário de uma mistura 80% confluente com um mililitro de 0,25% de tripsina por 40 a 60 segundos, seguido pela neutralização da reação com seis mililitros de meio de crescimento completo. Colete as células por centrifugação e ressuspenda o pellet em cinco mililitros de meio de crescimento completo fresco.Após a contagem, dilua as células para 100.000 células de câncer de ovário por mililitro de concentração completa do meio de crescimento e coloque três inserções de cultura de células de membrana de policarbonato tratadas com cultura de tecidos de poros invertidos de 0,4 micrômetro por condição experimental em uma placa de cultura de tecidos estéreis de tamanho apropriado. Rotule as inserções de acordo com a condição experimental e pipete cuidadosamente as células cancerígenas na parte inferior de cada inserção em círculos concêntricos, começando no meio da membrana e movendo-se para fora para formar uma cúpula de 800 microlitros. Seja extremamente cuidadoso ao semear as células na superfície inferior do inserto para que a cúpula do meio contendo células não escorra das bordas do inserto durante a incubação.Quando todas as inserções tiverem sido semeadas, cubra o prato e coloque-as cuidadosamente na incubadora de cultura de células. Após cerca de quatro horas, destacar o HPMC com dois mililitros de 0,25% de tripsina por um a dois minutos, seguido de neutralização da reação com 12 mililitros de meio de crescimento completo. Colete o HPMC por centrifugação e ressuspenda o pellet em 10 mililitros de meio de crescimento completo para contagem.Dilua as células a 300.000 HPMC por mililitro de meio de crescimento completo e adicione 2,5 mililitros de meio de crescimento completo fresco a cada poço de uma placa de cultura de seis poços. Usando uma pinça estéril, coloque cada inserção com o lado direito para cima em cada poço da placa de seis poços para que as superfícies inferiores das células cancerígenas do ovário fiquem imersas no meio. Em seguida, semeie 1,5 mililitros de HPMC no poço de cada inserto.Em seguida, coloque a placa na incubadora de cultura de células por 72 horas. No final da incubação, remova cuidadosamente as inserções de cada poço e enxágue os dois lados das inserções com PBS. Coloque cada inserto em uma nova placa de seis poços e adicione 0,5 mililitros de tripsina aos poços de inserção e dois mililitros de tripsina aos poços inferiores.Após dois minutos a 37 graus Celsius, adicione um mililitro de meio de crescimento completo a cada inserção e pipete cuidadosamente a solução algumas vezes sem rasgar a membrana ou derramar a suspensão celular no poço abaixo. Durante a pipetagem, deve-se tomar cuidado para evitar a contaminação cruzada das células de uma câmara com as outras. Transfira as células ressuspensas para um tubo de coleta rotulado e neutralize ainda mais a tripsina com mais dois mililitros de meio de crescimento completo.Para coletar as células no fundo das inserções, lave o fundo das membranas duas a três vezes com os dois mililitros de tripsina do poço correspondente da placa de seis poços, de modo que as células destacadas fiquem presas no fundo do poço apropriado. Quando todas as células tiverem sido destacadas, neutralize a tripsina em cada poço com seis mililitros de meio de crescimento fresco e transfira as suspensões celulares para tubos de coleta rotulados. Em seguida, colete todas as células por centrifugação e ressuspenda os pellets em 0,7 mililitros de reagente de lise à base de tiocianato de fenol e guanidina por tubo para extração e isolamento de RNA de acordo com protocolos padrão.A cultura proximal de HPMC com células de câncer de ovário resulta em um aumento da expressão de fibronectina e Fator de Crescimento Transformador ou TGF beta em comparação com o HPMC de controle semeado em inserções na ausência de células cancerígenas. A expressão de fibronectina e TGF beta one também aumenta significativamente em células de câncer de ovário após cultura proximal com HPMCs em comparação com células ovarianas de controle cultivadas na ausência de HPMC. Por outro lado, as células de câncer de ovário tratadas com meio condicionado HPMC demonstram uma expressão de fibronectina significativamente reduzida sem alteração na expressão de TGF beta one.O bloqueio do TGF beta um com um anticorpo neutralizante, no entanto, resulta em uma diminuição significativa na expressão de TGF beta um em células de câncer de ovário em cultura proximal com HPMCs. Curiosamente, um ligeiro aumento na expressão de TGF beta um é observado em células de câncer de ovário de controle não cultivadas proximalmente, provavelmente como uma resposta compensatória. A cultura proximal com células de câncer de ovário aumenta ligeiramente a expressão de E-caderina em HPMCs, enquanto uma diminuição acentuada na E-caderina é observada em células de câncer de ovário cultivadas nas proximidades de HPMCs em comparação com controles, demonstrando ainda mais a eficácia do sistema de cultura proximal para estudar a sinalização parácrina entre células de câncer de ovário e células normais no local da metástase.Ao tentar este procedimento, é importante otimizar o número de células semeadas e a duração da cultura proximal. Após este procedimento, outros métodos, como immunoblotting, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre as mudanças na expressão de proteínas e a ativação das vias de sinalização de processamento a jusante durante a co-cultura de células mesoteliais de células tumorais. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo do microambiente tumoral, imunologia e biologia do desenvolvimento explorarem interações parácrinas recíprocas entre células por meio de fatores secretados.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Neste vídeo, desenvolvemos um modelo de co-cultura proximal de células de câncer de ovário e células mesoteliais humanas primárias. Este modelo fisiologicamente relevante permite o estudo da sinalização parácrina, onde as concentrações localizadas dos fatores secretados são mantidas enquanto evitam o contato celular direto.

Sistema de Cultura Proximal: Uma Técnica de Cultura In Vitro para Estudar a Sinalização Parácrina entre Células

Adaptamos uma inserção de membrana microporosa permeável para mimetizar o microambiente tumoral (TME). O modelo consiste em uma cultura de células mistas, permite a geração simplificada de populações de células individuais altamente enriquecidas sem o uso de marcação fluorescente ou classificação de células e permite estudar a comunicação intercelular dentro do TME em condições normais ou de estresse.

A Mimic do microambiente do tumor: um método simples para geração de populações celulares enriquecidas e Investigando intercelular Comunicação

É descrito um modelo de cultura celular de artérias de resistência, permitindo a dissecção da sinalização de caminhos no endotélio, músculo liso, ou entre o endotélio e músculo liso (a junção de myoendothelial). A aplicação selectiva de agonistas ou isolamento da proteína, microscopia eletrônica ou imunofluorescência pode ser utilizada usando esse modelo de cultura celular.

Um modelo de cultura celular de artérias de resistência

Apresentamos um protocolo para investigar o crosstalk entre Caco-2 X-ray-irradiados e células mononucleares do sangue periférico (PBMC). O protocolo começa com a instalação e Caco-2 irradiação da cultura co com PBMC; posteriormente, resistência elétrica trans-epitelial é medida regularmente durante 48 h e ocidental do borrão realizados em PBMC e Caco-2.

Um método de co-cultura para investigar o Crosstalk entre raio-x irradiados PBMC e células Caco-2

Nós fornecemos os protocolos para avaliação de células-tronco mesenquimais isoladas de polpa dentária e interações de células de câncer de próstata baseadas em métodos diretos e indiretos co-cultura. Médio de condição e membranas de trans-bem são apropriadas analisar a atividade indireta parácrina. Semeando diferencialmente manchado células juntos é um modelo adequado para a interação célula-célula direto.

Isolamento de células-tronco mesenquimais de tecido pulpar e co-cultura com células cancerosas para estudar suas interações

Aqui, apresentamos um método usando suportes de membrana permeáveis para facilitar o estudo da sinalização paracrina sem contato usada pelas células tumorais para suprimir a resposta imune. O sistema é passível de estudar o papel dos fatores tumorados no amortecimento da ativação do macrófago.

Estudando os efeitos dos ligantes paracrinos tumorais na ativação do macrófago usando a co-cultura com suportes permeáveis da membrana

Descrevemos o isolamento, dispersão e revestimento de células primárias de polpa dentária (DP) com neurônios trigêmeos (TG) cultivados no topo de filtros transwell overover. As respostas celulares das células DP podem ser analisadas com imunofluorescência ou análise de RNA/proteína. A imunofluorescência dos marcadores neuronais com microscopia confocal permite a análise de respostas de crescimento neurite.

Um método de co-cultura para estudar o crescimento da neurita em resposta aos sinais de paracrina da polpa dentária

O presente estudo descreve um método altamente reprodutível e tratável para estudar eventos de sinalização Wnt não canônica parácrina in vitro.  Este protocolo foi aplicado para avaliar o impacto da sinalização parácrina Wnt5a em células da crista neural murina e mioblastos.

Modelagem de sinalização Wnt não canônica parácrina in vitro

Neste artigo, um novo inserto impresso em 3D é apresentado como um modelo de co-cultura e validado através do estudo da comunicação intercelular parácrina entre células endoteliais e queratinócitos.

Um inserto inovador impresso em 3D projetado para permitir culturas de células 2D e 3D diretas

Teste de sensibilidade visual em lagartos usando um paradigma de condicionamento operante, que emprega a reprodução de vídeo de random-dot kinematograms e computer-generated invertebrados.

Teste de sensibilidade visual para a velocidade e direção do movimento em Lagartos

Aprenda a usar o método de cultura proximal para estudar sinalização parácrina entre células de câncer de ovário e HPMCs. Esta técnica simples e reprodutível isola efeitos parácrinos sem contato direto celular.

Um método de cultura Proximal para estudar a parácrina sinalização entre as células

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