Modelo de pulmão acelular e celular para estudar o Tumor metástase

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave relacionadas à progressão do tumor. O modelo pulmonar acelular e celular ex vivo permite a formação de tumor primário que cresce com o tempo e forma células tumorais circulantes e lesões metastáticas. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite o estudo da progressão do câncer em um tempo abreviado e o crescimento de diferentes tipos de células cancerígenas.

As implicações dessa técnica se estendem à nossa terapia personalizada, pois as células tumorais dos pacientes podem ser usadas no modelo para avaliar a eficácia de medicamentos terapêuticos, incluindo células imunológicas. Comece com um rato profundamente anestesiado. Depile o tórax e o abdômen e limpe a pele com um cotonete de clorexidina.

Depois de abrir a cavidade torácica, faça uma toracotomia bilateral cortando o lado anterior da caixa torácica à esquerda no lado direito do diafragma. Segure a caixa torácica e injete dois mililitros de 1000 unidades por mililitro de heparina no ventrículo direito do coração batendo usando uma agulha de calibre 27 para evitar a formação de coágulos sanguíneos no pulmão. Depois de remover a caixa torácica, coloque uma agulha de calibre 18 no ventrículo esquerdo como um respiradouro para permitir a saída de sangue e, em seguida, use uma agulha de calibre 25 para injetar 15 mililitros de 12,5 unidades por mililitro de PBS heparinizado no ventrículo direito.

Em seguida, corte a traqueia na base da tireoide e remova cuidadosamente a aorta descendente ao nível da veia hemiázigos e ramos da aorta no arco. Depois de remover o bloqueio coração-pulmão da cavidade torácica, corte metade dos ventrículos direito e esquerdo e, em seguida, coloque uma cânula de agulha de aço inoxidável de calibre 18 feita sob medida através do ventrículo direito na artéria pulmonar principal. Prenda a cânula com o laço de seda 2-0 e exponha cuidadosamente o ventrículo direito e o átrio.

Comece executando PBS heparinizado a uma pressão de perfusão fisiológica de 30 milímetros de mercúrio até que ele flua livremente para o frasco da unidade de descelularização e, em seguida, conecte o bloco coração-pulmão à unidade de descelularização na extremidade da artéria pulmonar através da cânula da artéria pulmonar. Após 15 minutos de lavagem com PBS heparinizado, substitua o frasco de PBS heparinizado por um contendo dodecil sulfato de sódio a 0,15% e água deionizada e perfunda o pulmão por duas horas para descelularização. Após a descelularização, perfundir água autoclavada deionizada através do andaime pulmonar por 15 minutos, seguida de detergente não iônico a 1% em água deionizada por 10 minutos.

Por fim, substitua o frasco por 500 mililitros de PBS autoclavado suplementado com antibióticos. Ligue a bomba a seis mililitros por minuto e perfunda os pulmões por 72 horas, após o que o pulmão acelular está pronto para uso imediato. Pulverize etanol 70% no cartucho da bomba e configure o oxigenador conectando a extremidade de saída do oxigenador ao tubo da bomba e a outra extremidade a um tubo de 1,5 pé no biorreator.

Instale o frasco do biorreator em um gabinete de biossegurança em condições assépticas. Conecte uma torneira de três vias à cabeça de uma trava Luer fêmea para controlar o fluxo através da artéria pulmonar e, em seguida, conecte uma torneira unidirecional a outra antepara fêmea Luer lock para semeadura celular através da traqueia. Conecte um tubo de duas polegadas do lado de fora e um tubo de seis polegadas do lado de dentro da garrafa para circular o meio.

Prepare a tubulação para conectar o frasco do biorreator ao oxigenador. Encaixe uma trava Luer macho em um tubo de dois pés e prenda uma luer fêmea estilo T para fornecer acessibilidade e prenda uma trava Luer macho e uma trava Luer fêmea em dois tubos de pé. Adicione o meio de cultura celular e transfira o biorreator para a incubadora.

Conecte o tubo do oxigenador às duas extremidades abertas para torná-lo um biorreator de circuito fechado. Pré-ligue a bomba a seis mililitros por minuto para encher o oxigenador e os tubos com meio de cultura para que não existam bolhas de ar na tubulação. Assim que os tubos estiverem cheios de meio, feche a torneira e desconecte os oxigenadores de ambas as extremidades do frasco do biorreator.

Coloque o frasco do biorreator no gabinete de biossegurança, passe o meio de cultura pela torneira e conecte a cânula pulmonar do andaime pulmonar. Se estiver trabalhando com o modelo de pulmão celular, pule a descelularização. O pulmão colhido pode ser definido diadicamente no biorreator.

Passe o meio de cultura pela torneira unidirecional novamente para remover o ar e amarre a cânula traqueal com um fio de seda à traqueia e, em seguida, feche a tampa do frasco do biorreator. Transfira o biorreator para a incubadora e ligue a bomba. Execute o meio de cultura por 10 a 15 minutos para garantir que todos os lobos sejam inflados e que o pulmão pareça em boa forma.

Modifique o andaime pulmonar acelular ou celular da seguinte forma para o modelo metastático. Abra a tampa do biorreator com o andaime pulmonar suspenso e use uma seringa Luer lock para passar cinco mililitros de meio de cultura pela traqueia. Use uma pinça angular para passar seda 2-0 pela traqueia no ponto de bifurcação.

Amarre a traqueia indo para o pulmão direito no ponto de bifurcação e verifique o fluxo livre de meio através da traqueia para o pulmão esquerdo passando o meio de cultura. Prepare um volume de 50 mililitros de células de câncer de pulmão, como A549 ou H1299 em meios de cultura completos RPMI 1640, a uma concentração de dois a três milhões de células por mililitro. Coloque uma seringa Luer lock de 20 mililitros em cima da cânula traqueal e adicione 15 mililitros de células à seringa.

Permita que a suspensão celular passe pelos lobos pulmonares por gravidade. Adicione o resto das células antes que qualquer bolha de ar passe. Depois de semeada, remova a seringa e aguarde 15 minutos, depois adicione meio fresco ao biorreator.

Devolva-o à incubadora e, após remover as bolhas de ar, perfunda o andaime pulmonar a seis mililitros por minuto. A histopatologia de um pulmão íntegro mostra os alvéolos e pneumócitos. Como visto aqui, a descelularização leva à remoção completa das células pulmonares, e a histopatologia dos pulmões acelulares revela uma membrana basal intacta.

A coloração pentacromática e elastina de Movat de um pulmão descelularizado revela a presença de colágeno, fibrina e elastina com vasculatura e brônquios íntegros. A análise de DNA do pulmão descelularizado mostra uma redução no conteúdo de DNA de mais de 99%O pulmão acelular pode ser usado diretamente no biorreator para cultura de células. Uma análise histológica mostra a presença de crescimento tumoral.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de injetar a heparina no ventrículo direito do coração. Após esse desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da pesquisa do câncer explorarem as alterações genéticas e epigenéticas que levam à metástase de células tumorais no câncer de pulmão.