Name: Quantificação de Efferocytosis por microscopia de fluorescência de célula única (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: Aprenda a quantificar a eferocitose por microscopia de fluorescência de célula única usando macrófagos humanos e células Jurkat apoptóticas. Este método permite avaliar vias de sinalização e a captação parcial de células.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este estudo foi financiado pelos institutos canadenses de saúde (CIHR) de pesquisa operacional Grant MOP-123419, ciências naturais e engenharia pesquisa Conselho de Canadá Discovery Grant 418194 e um Ontario Ministério da investigação e inovação início Research Award para BH. DGW contribuiu com algumas das imagens apresentadas, para a otimização dos protocolos e a escrita do manuscrito; Ele foi financiado por um subsídio de escorva da bomba da Universidade de Liverpool. CY é financiado por uma bolsa de pós-graduação de Vanier e CIHR MD/PhD Studentship. Agências de fomento não tinham qualquer papel no projeto de estudo, coleta de dados e análise, a decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

Os autores declaram não haverá conflito de interesses.

Os métodos descritos neste protocolo permitem que a imagem e a quantificação do processo de efferocytic dinâmico, com abordagens tanto fixo-célula e célula viver. Essas abordagens oferecem diversas vantagens sobre os métodos baseados em citometria de fluxo comumente empregados23,24. O uso de coloração de dentro para fora com amostras fixas fornece uma quantificação mais robusta e precisa da taxa e a extensão da efferocytosis — de fato, muitos métodos baseados em ...

Apoptose, ou morte celular programada, é um processo fisiológico que ocorre na maioria dos organismos multicelulares e é crucial para seu desenvolvimento e homeostase1altamente regulamentados. Além de estar envolvido na renovação celular normal e o desenvolvimento embrionário, apoptose permite a eliminação de células infectadas ou danificadas de tecidos e pode ser acionado em resposta à infecção, inflamação, câncer e também por intervenções médicas como a radioterapia ou esteroides1. Células apoptóticas expõem "coma-me" sinais em sua superfície celular, que são reconhecidos pelos receptores em um intervalo de fagócitos profissionais e não profissionais, referidos coletivamente como "efferocytes". Engajamento desses receptores induz a absorção e a degradação da célula apoptótica pelo efferocyte através de um processo conhecido como efferocytosis2,3. A fosfatidilserina é o melhor caracterizadas comer-me sinal de condução efferocytosis. Normalmente é pequeno para o folheto interno da membrana plasmática, com apoptose ativando um scramblase de lipídios que interrompe esta assimetria da membrana, expondo assim a fosfatidilserina na superfície celular4. A fosfatidilserina é encontrada na superfície de algumas células não-apoptotic, tais como os macrófagos maduros extracelular e ativado plaquetas. No entanto, estas células não são efferocytosed devido à presença de sinais "não me coma", tais como CD47, na sua célula superfície5,6,7. Exposta a fosfatidilserina é reconhecida por uma matriz de receptores efferocytic expressado por efferocytes. Vinculação destes receptores de fosfatidilserina, directamente ou através da ajuda de opsoninas, ativa vias de sinalização que promovem a absorção da célula apoptótica em um vacuole membrana-limite denominado o efferosome8, 9 , 10 , 11 , 12. o efferosome funde-se sequencialmente com endossomos e lisossomos, que entregam a maquinaria molecular necessária acidificar o efferosome e degradar a apoptose de células carga13,14. Uma vez degradados, os materiais de derivado de células apoptóticas são traficados para o endossomo reciclagem — um processo que limita a respostas imunes aos antígenos de apoptotic derivado de células, e que podem permitir recuperação de nutrientes do apoptose celular13, 15. Uma falha no efferocytosis resulta em prejudicada afastamento de pilhas apoptotic; Estas células não compensadas eventualmente sofrem necrose secundária. Necróticas células versão pro-inflamatórios conteúdo citosólico, patógenos e auto-antigénios para o meio extracelular, assim, conduzir a uma gama de doenças infecciosas, inflamatórias e auto-imunes16,17. Juntos, apoptose e efferocytosis facilitar a remoção de células moribundos e mortas e permitir a manutenção da homeostase do tecido.
Investigar os mecanismos moleculares subjacentes efferocytosis requer métodos que fornecem uma clara quantificação da captação de células apoptóticas. Esta quantificação é complicada pelo fato de que, ao contrário de outra absorção mecanismos como endocitose e fagocitose18,19, efferocytosis não podem resultar no engulfment da célula-alvo intacta, tendo por resultado a absorção por etapas da célula apoptótica pelo efferocyte20. O protocolo descrito neste documento descreve um em vitro ensaio de efferocytosis que fornece a delimitação exata do interiorizado versus não-internalizada porções de pilhas apoptotic individuais e pode ser combinado com uma variedade de células fixas e abordagens de microscopia de viver-pilha. Ensaios de fagocitose tradicional Acrescente os anticorpos específicos para o destino fagocitária ao final do experimento para rotular alvos não-internalizada, onde, como nosso método diferem pela rotulagem o alvo de apoptotic com biotina covalentemente ligados21 , 22. enquanto os anticorpos específicos de apoptose celular podem ser usados neste ensaio, a abordagem biotinylation permite qualquer alvo de proteína-rolamento a ser rotulados e evita possíveis problemas com reactividade cruzada do anticorpo secundário se immunostaining é executada . Especificamente, descrevem a preparação de pilhas apoptotic Jurkat que foram dual-manchada com uma tintura de seguimento de célula e biotina. A célula de tintura de rastreamento permite apoptotic materiais derivados de célula a ser controlados durante a efferocytosis, Considerando que a superfície biotinylation permite a discriminação de internalizada de partes não-internalizada de pilhas apoptotic de efferocytosed. Também descrevemos a cultura e a preparação das linhas de células J774.2 e THP-1 para uso como efferocytes murino e humano, derivados de monócitos os macrófagos M2 como um exemplo de célula primária efferocytosis e células Jurkat para uso como alvos de efferocytic. Esses métodos podem ser facilmente aplicados para outras linhas de célula ou células primárias, submetidos a qualquer forma de morte celular (por exemplo, apoptose, necrose e necroptosis) nas células-alvo e imita micro-empresas que simulam células apoptóticas através de revestimentos de lipídios ou revestimento com ligantes específicos a um receptor de efferocytic de interesse.
O método descrito neste protocolo tem várias vantagens sobre os métodos de fluxo cytometry baseado comumente usados no campo23,24. Por imagem diretamente a interação da célula de fagócito-apoptotic, combinada com rotulagem clara de ambos material de célula apoptótica total e não-internalizada, medidas quantitativas de efferocytosis podem ser feitas. Além disso, o uso de pH-insensível fluorophores limita confundimento fatores tais como a supressão da fluorescência FITC e GFP no pH dos lisossomos que confunde alguns métodos alternativos de25. Por último, embora não descrito em detalhe, esses métodos podem ser empregados usando efferocytes expressar transgenes fluorescente-etiquetadas, ou com pós-fixação imunocoloração, para permitir a quantificação da atividade da molécula de sinalização e controlo da processos celulares durante efferocytosis.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640 Mídia</td><td>Wisent</td><td>3500-000-EL</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Mídia</td><td>Wisent</td><td>319-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>Soro Bovino Fetal (FBS)</td> <td>Wisent</td><td>080-150</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Wisent</td><td>311-010-CL</td><td></td></tr><tr><td>18 mm lamínulas de vidro circular # 1,5 espessura</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>72290-08</td><td>O tamanho e a forma da lamínula não são críticos, mas 18 mm se encaixam nos poços de uma placa padrão de 12 poços que simplifica a cultura de células</td></tr><tr><td>Staurosporine</td><td>Cayman Chemical</td><td>81590</td><td>Dissolva em DMSO a 1 mM (solução estoque 1.000x)</td></tr> <tr><td>Anexina V-Alexa 488</td><td>ThermoFisher</td><td>R37174</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link NHS-Biotina</td><td>ThermoFisher</td><td>20217</td><td>Armazene em um dessecador. Não prepare uma solução padrão.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace FarRed</td><td>ThermoFisher</td><td>C34572</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace Orange</td><td>ThermoFisher</td><td>C34851</td><td></td></tr><tr><td>Hoescht 33342</td><td>ThermoFisher</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Streptavadin</td><td>ThermoFisher</td><td>SA1001</td><td></td></tr><tr><td>Meio de separação de células linfólitas-poli</td><td>Cedarlane Labs</td><td>CL5071</td><td></td></tr><tr><td>M-CSF humano recombinante</td><td>Peprotech</td><td>200-04</td><td></td></tr><tr><td>IL-4 humano recombinante</td><td>Peprotech</td><td>300-25</td><td></td></tr><tr><td>J774.2 Linha celular de macrófagos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85011428-1VL</td><td></td></tr><tr><td>THP-1 Linha celular de monócitos humanos</td><td>ATCC</td><td>TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>Jurkat T Linha celular</td><td>ATCC</td><td>TIB-152</td><td></td></tr></tbody></table>

quantificação de efferocytosis por microscopia de fluorescência de célula única

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Estudar o Regulamento de efferocytosis requer métodos que são capazes de quantificar com precisão a absorção de pilhas apoptotic e sondar os processos de sinalização e celulares que controlam o efferocytosis. Esta quantificação pode ser difícil de executar como pilhas apoptotic são frequentemente efferocytosed fragmentada, necessitando de métodos que podem delinear com precisão entre a parte de efferocytosed de um alvo de apoptotic contra residual celular unengulfed fragmentos. A abordagem descrita neste documento utiliza abordagens dual-rotulagem para quantificar com precisão a dinâmica da capacidade de efferocytosis e efferocytic de efferocytes tais como macrófagos. O citoplasma da célula apoptótica é rotulado com uma tintura de seguimento-celular para habilitar o monitoramento de todos os materiais derivado de células apoptóticas, enquanto biotinylation superfície da célula apoptótica permite a diferenciação entre interiorizado e não-internalizada fracções de células apoptóticas. A capacidade de efferocytic de efferocytes é determinada pela tomada de imagens fluorescentes de células vivas ou fixas e quantificar a quantidade de limite contra alvos interiorizados, como diferenciados pela coloração de estreptavidina. Essa abordagem oferece diversas vantagens sobre os métodos tais como citometria de fluxo, ou seja a delimitação exata de não-efferocytosed contra efferocytosed apoptotic fracções de célula, a capacidade de medir efferocytic dinâmica por microscopia de viver-pilha e o capacidade para realizar estudos de sinalização celular em células expressando transgenes fluorescente-etiquetadas. Os métodos descritos neste protocolo combinado, servem como base para uma abordagem experimental flexível que pode ser usada para quantificar com precisão a atividade efferocytic e interrogar as vias de sinalização celulares ativas durante efferocytosis.

Uma noite de cultura de células Jurkat com resultados de staurosporine de 1 µM em apoptose de &gt; 95% das células, que podem ser confirmadas com anexina V coloração (Figura 1). Outros tipos de células podem ser usados para estas experiências, embora a concentração de staurosporine e a duração do tratamento staurosporine precisará ser otimizado para cada linha de celular. Para detecção confiável e quantificação de efferocytosis, &gt; 80% das células deve ser ...

Efferocytosis, a remoção fagocitária das células apoptóticas, é necessário para manter a homeostase e é facilitado por receptores e vias de sinalização que permitem o reconhecimento, a duração e internalização de pilhas apoptotic. Neste documento, apresentamos um protocolo de microscopia de fluorescência para a quantificação dos efferocytosis e a atividade das vias de sinalização de efferocytic.

Quantificação de Efferocytosis por microscopia de fluorescência de célula única

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Este método pode ser usado para responder a questões-chave no campo da eferocitose, como o papel das moléculas sinalizadoras na mediação da captação de células apoptóticas. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece uma quantificação clara da captação de células apoptóticas, incluindo captação parcial ou fragmentada de células apoptóticas, que nem sempre é aparente com outros métodos. Embora esse método possa fornecer informações sobre a eferocitose por células imunes, ele também pode ser aplicado a outros tipos de células, como células epiteliais ou cancerígenas.Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades devido à dificuldade em otimizar as configurações de aquisição do microscópio. Depois de preparar macrófagos humanos e células Jurkat apoptóticas, use um hemocitômetro para contar as células apoptóticas. Em seguida, transfira uma quantidade suficiente de células apoptóticas para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.Pulverize as células de Jurkat por centrifugação a 500 vezes g por cinco minutos. Em seguida, ressuspenda as células em 500 microlitros de PBS. Enquanto as células Jurkat estão na centrífuga, alíquota de 10 microlitros de DMSO em um no

quantification-of-efferocytosis-by-single-cell-fluorescence-microscopy

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Neste vídeo, demonstramos o ensaio de eferocitose para estudar a depuração de células apoptóticas usando microscopia confocal. A eferocitose é um processo de várias etapas em que as células apoptóticas são engolidas por fagócitos e degradadas dentro de vesículas chamadas eferrossomos. Este protocolo fornece um método para visualizar porções internalizadas e não internalizadas de células apoptóticas individuais e quantificar a eferocitose.

Ensaio de Eferocitose de Células Fixas: Um Método para Estudar a Captação Eferocítica de Células Apoptóticas por Macrófagos Usando Microscopia de Fluorescência

Este vídeo demonstra um método para quantificar a fagocitose de esporos de fungos patogênicos marcados com FITC por leucócitos humanos. Os esporos fagocitados são discernidos dos esporos aderentes às células por meio de contracoloração, seguida de análise por citometria de fluxo.

Medição Quantitativa por Citometria de Fluxo de Fagocitose de Esporos Fúngicos por Fagócitos Humanos

O presente protocolo descreve um novo método para a identificação de uma população de enuclear eritroblastos ortocromaticos pelo fluxo de imagem multi-espectral citometria, proporcionando uma visualização do processo de enucleação dos eritroblastos.

Identificação de um Murino eritroblasto subpopulação enriquecido em enucleação Eventos da Multi-espectral de imagem de Citometria de Fluxo

Aqui apresentamos um protocolo para quantificar a fagocitose de partículas fluorescentes por linhagem celular de macrófagos aderentes usando um método fluorométrico. Este método facilita uma quantificação de alto rendimento da internalização de partículas, bem como a polimerização de actina resultante.

Técnica High Throughput Fluorometric de Avaliação da macrófago fagocitose e actina Polimerização

Estudos de biomoléculas in vivo são cruciais para a compreensão da função molecular em um contexto biológico. Aqui descrevemos um novo método que permite a internalização de biomoléculas fluorescentes, como DNA ou proteínas, em microrganismos vivos. A análise de dados in vivo registrados por microscopia de fluorescência também é apresentada e discutida.

Internalização e Observação de Fluorescent Biomoléculas em microorganismos vivos via Eletroporação

A quantificação precisa dos eventos de tráfego vesicular geralmente fornece informações importantes sobre os papéis de proteínas específicas e os efeitos das mutações. Este artigo apresenta métodos para o uso da pHluorina supereclíptica, uma variante de GFP sensível ao pH, como ferramenta para quantificação de eventos endocíticos em células vivas usando microscopia de fluorescência quantitativa e citometria de fluxo.

Aplicações de pHluorin para Quantitative, Kinetic e de alta capacidade: Análise de endocitose em brotamento Yeast

Vesículos extracelulares (EVs) contribuem para a biologia celular e comunicações intercelulares. Há necessidade de ensaios práticos para visualizar e quantificar a absorção de EVs pelas células. O protocolo atual propõe o ensaio de absorção de EV utilizando imagens de fluorescência tridimensional através de microscopia confocal, após o isolamento do EV por um dispositivo microfluido baseado em nanofilição.

Ensaio de absorção de vesícula extracelular via análise de imagens de microscópio confocal

Aqui apresentamos o protocolo para a reconstituição stepwise de células que apresentam antígenos sintéticos usando Bicamadas lipídicas apoiadas por contas e seu uso para interrogar a saída sináptica de células T ativadas.

Preparação de Bicamadas lipídicas apoiadas por contas para estudar a saída de partículas de sinapses imunes de células T

Aqui apresentamos dois protocolos para quantificar o engolfamento microglial de sinapses positivas para vGLUT1 e sinaptossomos brutos marcados com pHRodo Red usando citometria de fluxo.

Quantificação do engolfamento microglial de material sináptico usando citometria de fluxo

Para muitos estudos científicos que requerem uma análise biológica e química de populações de células as células devem estar em um alto estado de pureza. Separação de células ativadas por fluorescência (FACS) é um método superior para a obtenção de populações celulares puras.

Purificação da população de células específicas de separação de células de fluorescência Ativado (FACS)

Aprenda a quantificar a eferocitose por microscopia de fluorescência de célula única usando macrófagos humanos e células Jurkat apoptóticas. Este método permite avaliar vias de sinalização e a captação parcial de células.

Quantificação de Efferocytosis por microscopia de fluorescência de célula única

Explorar mais vídeos