Quantificação de Efferocytosis por microscopia de fluorescência de célula única

Este método pode ser usado para responder a questões-chave no campo da eferocitose, como o papel das moléculas sinalizadoras na mediação da captação de células apoptóticas. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece uma quantificação clara da captação de células apoptóticas, incluindo captação parcial ou fragmentada de células apoptóticas, que nem sempre é aparente com outros métodos. Embora esse método possa fornecer informações sobre a eferocitose por células imunes, ele também pode ser aplicado a outros tipos de células, como células epiteliais ou cancerígenas.

Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades devido à dificuldade em otimizar as configurações de aquisição do microscópio. Depois de preparar macrófagos humanos e células Jurkat apoptóticas, use um hemocitômetro para contar as células apoptóticas. Em seguida, transfira uma quantidade suficiente de células apoptóticas para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.

Pulverize as células de Jurkat por centrifugação a 500 vezes g por cinco minutos. Em seguida, ressuspenda as células em 500 microlitros de PBS. Enquanto as células Jurkat estão na centrífuga, alíquota de 10 microlitros de DMSO em um novo tubo de microcentrífuga.

Em seguida, dissolva uma quantidade mínima de NHS-Biotina no DMSO. Depois disso, transfira 500 microlitros da célula apoptótica e a suspensão de PBS para o tubo contendo DMSO e NHS-Biotina. Em seguida, dilua um corante de rastreamento de células apropriado de acordo com as instruções do fabricante.

Incubar a suspensão celular à temperatura ambiente durante 20 minutos no escuro. Em seguida, adicione um volume igual de RPMI 1640 com 10% de FBS e incube a suspensão em temperatura ambiente no escuro por mais cinco minutos. Depois disso, pulverize as células por centrifugação a 500 vezes g por cinco minutos.

Em seguida, descarte o sobrenadante e ressuspenda as células coradas em 100 microlitros de RPMI 1640 com 10% de FBS. Adicione 100 microlitros de suspensão de células coradas gota a gota a cada poço de macrófagos. Em seguida, centrifugue a placa a 200 vezes g durante um minuto.

Incubar a placa a 37 graus Celsius com 5%CO2 em uma incubadora de cultura de tecidos. Após o período de incubação apropriado, remova as células da incubadora. Em seguida, lave as células duas vezes com um mililitro de PBS.

Depois disso, adicione estreptavidina conjugada com FITC diluída a cada poço. E incube o prato por 20 minutos no escuro. Lave as células três vezes com um mililitro de PBS e agite suavemente as amostras por cinco minutos após cada enxágue.

Em seguida, fixe as células com 4% de paraformaldeído em PBS por 20 minutos em temperatura ambiente. Enxágue as células uma vez com PBS para remover qualquer excesso de PFA. Monte lamínulas em uma lâmina de imagem e transfira a lâmina para um microscópio de fluorescência.

Capture pilhas Z de um número suficiente de células para quantificação. É fundamental definir a distância entre essas seções de forma que todo o material apoptótico engolfado seja detectado. A distância máxima entre essas seções não deve ser maior que a profundidade focal de sua lente objetiva, normalmente de 0,5 a um micrômetro.

Carregue uma das pilhas Z no software usando o recurso Importar. Em seguida, selecione Densidade integrada como uma opção de medição no painel Definir medidas. A análise é mais fácil de realizar se os canais de estreptavidina e corante de rastreamento celular forem exibidos como uma sobreposição.

Qualquer objeto com coloração de estreptavidina em qualquer lugar ao longo de uma circunferência deve ser considerado positivo para estreptavidina e, portanto, não deve ser quantificado como estreptavidina negativa. Depois que a imagem for carregada, usando a estreptavidina e a ferramenta de seleção à mão livre, ou polígono, circule todo o material negativo de estreptavidina positivo do corante de rastreamento de células em um único plano da pilha Z. Em seguida, meça a intensidade integrada do corante de rastreamento celular na região.

Na mesma seção Z, use a coloração de estreptavidina e a ferramenta de seleção à mão livre ou polígono para circular todo o material positivo de estreptavidina positivo para corante de rastreamento de células. Finalmente, meça a intensidade integrada desta região. Usando este procedimento, mais de 95% das células Jurkat tratadas com estaurosporina passaram por apoptose.

Na maioria dos experimentos, a fração de células apoptóticas que são eferocitadas aumentou de forma dependente do tempo. Ao otimizar este protocolo para diferentes tipos de células eferocíticas, ou diferentes alvos de células apoptóticas, é importante testar a faixa de proporções de células apoptóticas para células eferocíticas. Normalmente, proporções de 10 para um ou 30 para um funcionam melhor.

Este procedimento pode ser facilmente modificado para rastrear a ativação da molécula de sinalização ou o tráfego intracelular, expressando genes repórteres fluorescentes nas células eferocíticas, permitindo assim que esses processos sejam visualizados durante a eferocitose.