Name: Fabricação escalável de Stretchable, Dual Channel, órgão Microfluidic Chips (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 44 s
Description: Aprenda a fabricação escalável de chips microfluídicos orgânicos esticáveis com canais duplos usando moldes de silicone impressos em 3D. Este método permite recriar funções de órgãos in vitro com estiramento mecânico e perfusão.

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Agradecemos a M. Rousseau e S. Kroll para ajudar com fotografia e videografia e M. Ingram, J. Nguyen, Shea D. e s. Wen de contribuições para o desenvolvimento do protocolo de fabricação inicial. Esta pesquisa foi patrocinada pelo Instituto Wyss biologicamente inspirados engenharia na Universidade de Harvard e o Defense Advanced Research Projects Agency sob contratos cooperativo #W911NF-12-2-0036 e #W911NF-16-C-0050 e FDA conceder # HHSF223201310079C, NIH concede #R01-EB020004 e #UG3-HL141797-01, e Fundação Bill e Melinda Gates concede #OPP1163237 e #OPP1173198 que o DEI. As opiniões e conclusões contidas neste documento são as dos autores e não deve ser interpretadas como representando as políticas oficiais, expressa ou implícita, do Defense Advanced Research Projects Agency, Food e Drug Administration, o Institutos nacionais de saúde, ou o governo dos EUA.

1. preparação geral
<ol><li>Para evitar detritos, limpe a área de trabalho usando fita adesiva e limpe a área com uma limpeza de salas limpas e álcool isopropílico.</li>
	<li>Para todas as etapas que exigem PDMS, misture PDMS na proporção de 10:1 (10 g de cruz ligando agente, 100 g de elastômero base). Misture com a mão ou com um misturador comercialmente disponível. Use um misturador planetário centrífugo aqui: mistura por 2 minutos a 2000 rpm e, em seguida, o PDMS de desgasificação por 2 minutos em 2200 rpm.</li>
	<li>Limpar tudo molda com pistola de ar para explodir fora detritos antes de usar. Atenção: Não use pinça de metal para remover detritos, pois danificará a superfície dos moldes.</li>
</ol>2. preparação do canal top
<ol><li>Limpe o lado brilhante de cada peça de poliuretano com toalhitas de etanol e salas limpas. Certifique-se de todos os etanol residual é secado da superfície de poliuretano.</li>
	<li>Coloque o lado brilhante do poliuretano sobre o lado aberto do molde para criar um selo no lado aberto do molde, deixando apenas uma abertura bem como na parte superior do molde para PDMS derramando MiP. Nota: Verifique se cada molde é coberto com segurança por peça de poliuretano ou o PDMS irá vazar de moldes durante o vazamento.</li>
	<li>Coloque os molde e poliuretano os assemblies em um gabarito de MiP, com o lado texturizado contra o fim do gabarito MiP. Continue a fazer isto até que todos os moldes foram colocados no jig.</li>
	<li>Aperte o jig MiP girando o identificador usando uma chave inglesa até que o espaçamento do gabarito é de 25 mm de largura.</li>
	<li>Fazer um barco de papel de alumínio que cercam o gabarito de MiP para evitar excesso PDMS vazem nas superfícies.</li>
	<li>Despeje PDMS em cada um dos moldes bem até completamente. Nota: Cada componente superior chip requer cerca de 3 mL de PDMS.</li>
	<li>Uma vez que a rapaziada toda é preenchida, coloque o gabarito em dessecador a vácuo. Puxe vácuo em kPa-80 para 1 h desgaseificar PDMS.</li>
	<li>Depois de 1 h, remova o gabarito de MiP exsicador e coloque no forno de 60 ° C durante pelo menos 4 h curar PDMS.</li>
	<li>Desmonte o gabarito de MiP, usando uma chave inglesa, soltar o jig girando o punho no sentido horário. Uma vez que os moldes são livres de compressão, remova os moldes do gabarito.</li>
	<li>Remova as tiras de poliuretano de cada molde e descarte.</li>
	<li>Cuidadosamente de moldar peças PDMS de seus moldes e colocá-los lado do recurso acima.</li>
	<li>Alinhar a lâmina do raspador de telha no entalhe de tabulação final e cortar cada extremidade para singulate os componentes principais.</li>
	<li>Verifique as peças para qualquer um dos seguintes modos de falha e descartar quaisquer peças insatisfatórias: arranhões no canal principal, grandes destroços acima da área do canal, grandes bolhas, deformado canais de vácuo.</li>
	<li>Armazene peças acabadas em pratos de Petri quadrados dentro de armários positivo de pressão, à temperatura ambiente.</li>
</ol>3. preparação do canal inferior
<ol><li>Despeje cerca de 10,5 g de PDMS em moldes até o PDMS atinge o topo da cavidade.<ol>
<li>Inspecione o molde do canal inferior para PDMS curado no fundo do molde.</li>
		<li>Se suja, raspe velho PDMS da parte inferior do molde como uma superfície irregular na parte inferior do molde pode causar a espessura desigual das peças finais. Observação: para pequenas < 2 cm2 áreas que são descobertas, a arma de ar podem ser usadas muito suavemente para mover PDMS no espaço.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque moldes no exsicador de vácuo por 1h.</li>
	<li>Depois de 1 h, mova os moldes em um forno de nível 60 ° C para > 4h.</li>
	<li>Coloque o molde na tabela no capô de fluxo laminar. Desaperte o PDMS de uma borda do molde.</li>
	<li>Agarre um canto e descole delicadamente o PDMS da superfície do molde.</li>
	<li>Quando totalmente removido, colocar na superfície de trabalho, para que canal características são o rosto acima.</li>
	<li>Corte as peças ao longo de bordas externas com cortadores de azulejo, colocação de lâmina de corte de azulejo em PDMS entalhado como na etapa 2.12.</li>
	<li>Deite as peças lado recurso nas fita para remover os detritos.</li>
	<li>Retire parte da fita de embalagem. Arraste a extremidade solta da parte do slide. A ponta solta será laminado com o vidro. Nota: É fundamental para evitar que a parte de alongamento enquanto ela estabelece. Se a bolha está preso entre a parte e vidro, delicadamente levante a parte com a pinça e re-colocar.</li>
	<li>Execute inspeção de controle de qualidade das peças. Verifique as peças para qualquer modos de falha e descartar quaisquer peças insatisfatórias, incluindo aqueles que contêm arranhões no canal principal, detritos grandes, grandes bolhas ou canais de vácuo deformados.</li>
	<li>Recursos com fita de cobre.</li>
	<li>Armazenar as peças em uma armário à temperatura ambiente de pressão positiva.</li>
</ol>4. preparação de membrana PDMS
<ol><li>Verificar que as bolachas estão livres de PDMS na parte de trás.</li>
	<li>Coloque cada bolacha de membrana nas ranhuras designadas nas bandejas AMF.</li>
	<li>Use a seringa de 1 mL para colocar 0,09 mL de PDMS para o centro de cada matriz de post de bolacha de membrana. Deixe o PDMS sentar durante um período mínimo de 5 min para permitir PDMS a espalhar os posts de bolacha a membrana. Nota: Não prossiga para a próxima etapa até pelo menos 75% da matriz de post é coberto de PDMS. A qualidade das membranas melhora quanto mais o PDMS é permitido para pavio em região do post para que mais longos tempos de espera nesta etapa são preferidos.</li>
	<li>Plasma tratar faixa de policarbonato de 20 W para 45 s, gás de2 O a 0,80 mbar em uma máquina de plasma.</li>
	<li>Retire a folha do policarbonato da máquina plasma e use uma tesoura para cortar as folhas de policarbonato em quadrados de 45 x 45 mm. Nota: Minimizar o contato com o plasma superfície tratada para evitar a poeira de degola para o policarbonato.</li>
	<li>Gentilmente colocar do lado do plasma Tratado das praças para o líquido PDMS centrado sobre a bolacha de membrana em policarbonato. Certifique-se de que o policarbonato e o PDMS estão em contato. Nota: Evite bolsões de ar entre o policarbonato e o PDMS.</li>
	<li>Coloque o espaçador PDMS pré-cortados no centro da Praça de policarbonato.</li>
	<li>Coloque a folha de policarbonato texturizado pré-cortados no bloco de PDMS para manter o conjunto de ligação para a placa de compressão.</li>
	<li>Colocar bandeja bandeja 3 é na parte de trás, bandeja 2 está no meio, e a bandeja 1 é na frente. Bandeja 1 tem um entalhe para o alinhamento.</li>
	<li>Abra a válvula de pressão de saída e abra lentamente a válvula de pressão de entrada. Só então feche a válvula de pressão de saída. Nota: Isto é para que a saída de 4 kg de força gradualmente é aplicada para cada wafer de membrana em oposição instantaneamente, que pode quebrar as bolachas.</li>
	<li>Ligue o interruptor de fungos de micorrizas Arbusculares para ON para começar o ciclo de polimerização. Cura da bolacha abaixo dos 4 kg (16 kPa) de compressão e um ciclo de temperatura rampa listados na tabela 1.</li>
</ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:323px;" width="322"><colgroup>
<col>
<col>
<col>
</colgroup>
<tbody>
<tr height="39">
<td height="39" style="height:39px;width:91px;">Passo</td>
			<td style="width:131px;">Temperatura (° C)</td>
			<td style="width:101px;">Duração (min)</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td align="right" height="20" style="height:20px;">1</td>
			<td align="right">20</td>
			<td align="right">20</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td align="right" height="20" style="height:20px;">2</td>
			<td align="right">35</td>
			<td align="right">10</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td align="right" height="20" style="height:20px;">3</td>
			<td align="right">45</td>
			<td align="right">10</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td align="right" height="20" style="height:20px;">4</td>
			<td align="right">50</td>
			<td align="right">60</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td align="right" height="20" style="height:20px;">5</td>
			<td align="right">60</td>
			<td align="right">120</td>
		</tr>
<tr height="18">
<td align="right" height="18" style="height:19px;">6</td>
			<td align="right">20</td>
			<td>Segure</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1 - membrana condições de cura
<ol start="12"><li>Feche a válvula de pressão de entrada e abra a válvula de pressão de saída para libertar a pressão dos cilindros de ar.</li>
	<li>Remova as bandejas e trazê-los para o capô do fluxo laminar.</li>
	<li>Cuidadosamente Retire o policarbonato texturizado e cuidadosamente remova o espaçador PDMS. Nota: Cuidado com o espaçador PDMS para garantir que também não descascar fora o transportador de policarbonato, se isso ocorrer início descascando um canto diferente.<ol>
<li>Inspecionar a membrana PDMS através do portador de policarbonato para áreas com através de furos e use um marcador para traçar o contorno da área do através de-furo e marcar todos os furos ou defeitos nas membranas.</li>
		<li>Usando bolacha manipulação fórceps, solte da bandeja de discos (wafers).</li>
		<li>Remova cada membrana a bolacha e coloque no prato de Petri. Nota: A membrana PDMS moldará a partir a hóstia de membrana e vai respeitar o policarbonato de apoio. Se PDMS começa a desanexação do compartimento de policarbonato, casca de uma região diferente.</li>
		<li>Armazenar as membranas e bolachas em placas de Petri em uma pressão positiva do armário à temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. top de montagem e preparação
<ol><li>Usando fita fosca, limpe as membranas do PDMS, bem como no interior da caixa de Petri para remover os resíduos.</li>
	<li>Completamente a fita do lado da característica de cada componente superior para remover os resíduos.</li>
	<li>Coloque o canal superior parte ("parte superior") característica para cima em placa de Petri com membrana PDMS. Nota: Esteja ciente de que algumas membranas podem ser utilizadas para uma ou duas peças superiores dependendo do tamanho da área utilizável. Os principais canais de cada parte superior devem caber dentro da área marcada da membrana.</li>
	<li>Carrega os pratos de Petri para a máquina de plasma.</li>
	<li>Plasma tratar membrana e superior a 20 W para 45 s, gás de2 O a 0,80 mbar.</li>
	<li>Uma vez os ciclos de ligação terminou, retire os pratos e fixar as peças ativadas lado recurso em cima da membrana e certifique-se de parte é totalmente laminada com membrana com nenhuma bolha.</li>
	<li>Coloque as peças no forno de 60 ° C durante pelo menos 2 h recozer.</li>
	<li>Usando um bisturi, traço em torno do perímetro do top ligado para separar o conjunto top-membrana do compartimento de policarbonato. Nota: Não corte a transportadora.</li>
	<li>Uma vez que a parte é traçada, descasque o assembly do que o policarbonato. A membrana PDMS ligada ao topo deve descascar do porta-aviões.</li>
	<li>Usando a pinça com ponta afiada, retire as portas que acessar o canal inferior a membrana e remover quaisquer detritos ou pó com pinça sob um estereoscópio. Nota: Não deixe nenhuma parte da membrana cobrindo a porta de acesso.</li>
</ol>6. chip Assembly
<ol><li>Recurso para cima, assemblies de deleite de plasma com componentes inferiores, usando as condições na etapa 5.5.</li>
	<li>Sob um microscópio invertido, alinhe o conjunto superior com lâmina de microscópio ao fundo metade.</li>
	<li>Coloque no forno de 60 ° C durante pelo menos 2 h.</li>
	<li>Inspeção de controle de qualidade do chip Nota: Preste muita atenção aos principais portos e canal do chip. Seleção de modos de falha pelo olho e também sob o microscópio.<ol>
<li>Para verificar que o chip é ligado totalmente, puxe levemente a cada canto do chip para verificar se há partes descolar.</li>
		<li>Veja o canal do chip para verificar se há uma membrana enrugada ou flacidez, que aparecerá como um padrão ondulado ou um leve desvio no canal.</li>
		<li>Realize uma inspeção de microscópio para inspecionar para detritos no canal principal. Nota: Os detritos em áreas não-críticas, como os canais de vácuo é aceitável.</li>
		<li>Com o chip ainda no microscópio invertido, inspecione o canal principal e os canais de vácuo de delaminação. Nota: Delaminação em áreas não-críticas (por exemplo, a borda do chip) é aceitável.</li>
		<li>Verifique os principais canais estão alinhados para dentro de 50-60 µm (poros de membrana de 1-2). Nota: É fundamental que os canais não se sobrepõem com canais de vácuo.</li>
		<li>Verifique se está intacta, sem qualquer aparentes buracos a membrana entre os principais canais e os canais de entrada e saída. Nota: Qualquer buraco na membrana pode levar a um chip com vazamento ou crescimento celular fora dos canais.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Loja de chips em placas de Petri em uma armário à temperatura ambiente de pressão positiva.</li>
</ol>

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</ol>

D.E.I. é dos fundadores e detém participações em emular, Inc. e preside o Conselho Consultivo Científico. J.P. atualmente é funcionário da R.N. emular, Inc., Y.C., J.P., e D.E.I. são inventores em propriedade intelectual que foi licenciado para emular, Inc.

O processo de fabricação baseia-se em moldes impressos 3D de alta resolução padrão os PDMS superior e inferior órgão Chip componentes do corpo juntamente com micromolded membranas porosas de PDMS. Esta abordagem crítica foi selecionada devido à facilidade de prototipagem, combinada com uma rápida transição para dimensionado para fabricação e substituição de ferramentas. Os moldes do componente superior destinam-se às portas padrão em locais precisos com perfis verticais definidos durante a etapa de fundição. Isto não só ...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58151/scalable-fabrication-stretchable-dual-channel-microfluidic-organ">Scalable Fabrication of Stretchable, Dual Channel, Microfluidic Organ Chips</a>.  The Representative Results, Discussion, and References sections have been updated.
In the Representative Results section, the legend for Figure 5 has been updated from:
Figure 5: Permeability of inert tracer Cascade Blue through the microporous PDMS membrane. Cascade Blue hydrazide dye in medium was loaded into the top channel of the Organ Chip and perfused at 60 µL/h to measure the flux of the dye across the membrane into the bottom channel containing medium. Empty chips were compared to Gut Chips with Caco2-BBe1 cells in the apical channel and human vascular endothelial cells (HUVEC) in the basal channel cultured for 6 days. Error bars indicate standard error of the mean.
to:
Figure 5: Permeability of inert tracer Cascade Blue through the microporous PDMS membrane. Cascade Blue hydrazide dye in medium was loaded into the top channel of the Organ Chip and perfused at 60 µl/h to measure the flux of the dye across the membrane into the bottom channel containing medium. Empty chips were compared to Gut Chips with Caco2-BBe1 cells in the apical channel and human vascular endothelial cells (HUVEC) in the basal channel cultured for 6 days. The apparent permeability (Papp, cm/s) of the microporous PDMS membrane was determined using the dye concentration in the outlet channels. The gut chip cell layers provide a significantly increased barrier to permeability. Error bars indicate standard error of the mean.
In the Discussion section, the fourth paragraph has been updated from:
Troubleshooting the resulting Organ Chips takes place at two levels: during the fabrication process and during Organ Chip culture. We have developed a visual method for quality assurance (QA) of through-hole formation in the cast membranes that greatly accelerates the production process while improving the quality and reliability of assembled Organ Chips. This QA method allows for process troubleshooting, and we recommend keeping a record of process conditions to enable tracking fabrication problems that may occur during cell culture. During Organ Chip culture, inert tracer dyes are the simplest method of measuring barrier function to troubleshoot the fabrication process and cell culture steps. Lucifer Yellow has been used historically due to its small molecular mass and innate fluorescence, but Cascade Blue offers similar properties with a narrower emission spectrum that is less likely to interfere with downstream assays. Larger molecules, such as poly-ethyleneglycol (PEG)- or dextran-conjugated fluorophores are larger and consequently result in lower permeability overall and lower sensitivity. The apparent permeability (Papp, cm/s) of tracer dyes can be used to determine barrier function properties of organs or tissues (Figure 4). The following equation can be used to calculate Papp between the dosing channel and receiving channel and is derived from equations used primarily for Transwell studies19,20 and corrects for tracer dye loss caused by absorption into PDMS by comparing the two output flows and not relying on mass balance assumptions at the outflow.
<img alt="Papp formula for permeation rate analysis in a scientific study, featuring equation variables." src="/files/ftp_upload/58151/58151eq1.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Equation 1">
to:
Troubleshooting the resulting Organ Chips takes place at two levels: during the fabrication process and during Organ Chip culture. We have developed a visual method for quality assurance (QA) of through-hole formation in the cast membranes that greatly accelerates the production process while improving the quality and reliability of assembled Organ Chips. This QA method allows for process troubleshooting, and we recommend keeping a record of process conditions to enable tracking fabrication problems that may occur during cell culture. During Organ Chip culture, inert tracer dyes are the simplest method of measuring barrier function to troubleshoot the fabrication process and cell culture steps. Lucifer Yellow has been used historically due to its small molecular mass and innate fluorescence, but Cascade Blue offers similar properties with a narrower emission spectrum that is less likely to interfere with downstream assays. Larger molecules, such as poly-ethyleneglycol (PEG)- or dextran-conjugated fluorophores are larger and consequently result in lower permeability overall and lower sensitivity. The apparent permeability (Papp, cm/s) of tracer dyes can be used to determine barrier function properties of organs or tissues (Figure 5). The following equation derived by Tran, et al.19 can be used to calculate Papp between the dosing channel and receiving channel, which partially corrects for tracer dye loss caused by absorption into PDMS by averaging the two output flows and not relying on mass balance assumptions at the outflow.
<img alt="Permeability coefficient equation, Papp, showing variables for diffusion analysis." src="/files/ftp_upload/58151/58151eq1v2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Equation 1">
The References section has been updated from:
<ol start="19">
	<li>Blaser, D.W. Determination of drug absorption parameters in Caco-2 cell monolayers with a mathematical model encompassing passive diffusion, carrier-mediated efflux, non-specific binding and phase II metabolism. at &lt;http://edoc.unibas.ch/655/1/DissB_7998.pdf&gt; (2007).</li>
	<li>Hubatsch, I., Ragnarsson, E.G.E., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nature Protocols. 2 (9), 2111-2119 (2007).</li>
	<li>Henry, O.Y.F. et al. Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function. Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).</li>
	<li>Maoz, B.M. et al. Organs-on-Chips with combined multi-electrode array and transepithelial electrical resistance measurement capabilities. Lab on a Chip. 17 (13), 2294-2302 (2017).</li>
	<li>Benam, K.H. et al. Matched-Comparative Modeling of Normal and Diseased Human Airway Responses Using a Microengineered Breathing Lung Chip. Cell Systems. 3 (5), 456-466.e4 (2016).</li>
</ol>
to:
<ol start="19">
	<li>Tran, T.T. et al. Exact kinetic analysis of passive transport across a polarized confluent MDCK cell monolayer modeled as a single barrier. Journal of Pharmaceutical Sciences. 93 (8), 2108–2123 (2004).</li>
	<li>Henry, O.Y.F. et al. Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function. Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).</li>
	<li>Maoz, B.M. et al. Organs-on-Chips with combined multi-electrode array and transepithelial electrical resistance measurement capabilities. Lab on a Chip. 17 (13), 2294-2302 (2017).</li>
	<li>Benam, K.H. et al. Matched-Comparative Modeling of Normal and Diseased Human Airway Responses Using a Microengineered Breathing Lung Chip. Cell Systems. 3 (5), 456-466.e4 (2016).</li>
</ol>

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58151/scalable-fabrication-stretchable-dual-channel-microfluidic-organ">Scalable Fabrication of Stretchable, Dual Channel, Microfluidic Organ Chips</a>.&#160; The Representative Results, Discussion, and References sections have been updated.

Erratum: Scalable Fabrication of Stretchable, Dual Channel, Microfluidic Organ Chips

Aqui, descrevemos a fabricação de canal duplo, vascularizado órgão-em-um-microplaqueta (órgão Chip) microfluidic cultura dispositivos que utilizam um protocolo escalável favorável para uso por grupos de pesquisa, falta de acesso a salas limpas e ferramentas tradicionais litografia macia. Estes dispositivos foram desenvolvidos para recapitular as funções de nível de órgão humano para compreensão normal e fisiologia da doença, bem como drogas respostas em vitro1,2. Crítica à engenharia essa funcionalidade são dois canais microfluídicos perfundidos, separados por uma membrana semi-permeável (Figura 1). Este projeto permite a recriação de interfaces de tecido-tecido entre pelo menos dois tipos de tecidos, geralmente células parenquimais do órgão em um lado da membrana porosa e endotélio vascular do outro, bem como sua exposição ao fluxo do fluido. Além disso, porque o polímero elastomérico, poli (dimetil siloxano) (PDMS), é usado para fabricar o corpo do órgão Chip e componentes de membrana, esforços mecânicos cíclicos podem ser aplicados a engenharia de todo o tecido-tecido da interface através do elástico membrana para imitar o microambiente física natural de órgãos vivos, tais como respiração movimentos no pulmão e peristaltismo no intestino.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58151/58151fig1.jpg"> Figura 1: seção transversal de órgão Chip. Chips de órgão consistem em dois canais separados por uma membrana porosa, elástica que pode ser inoculada com células de ambos os lados. Canal superior seções transversais são 1 mm de largura x altura, inferior 1 mm canal Cruz seções são 1 mm de largura x canais de alta e vácuo de 0,2 mm em ambos e partes de baixo são de 0,3 mm de largura, 0.5 mm alto e espaçados 0,3 mm dos canais fluídico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58151/58151fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Estes stretchable, duplo canal, órgão Chips têm sido utilizados para demonstrar o impacto da respiração movimento na absorção de nanopartículas no pulmão e edema pulmonar induzido3,4; efeitos de movimento peristáltico na diferenciação5 e supercrescimento bacteriano no intestino5,6,7; e influência de deformações cíclicas devido a pulsação do coração na diferenciação e maturação de podócitos glomerulares no rim8. Além disso, estes dispositivos de dois lumens que contêm um canal vascular endotélio-alinhado, separado por uma matriz extracelular (ECM)-revestido de membrana de células parenquimais dentro de um canal separadamente acessível são adequados para caracterização de droga PK parâmetros e nova descoberta de alvo, que tem sido limitada em perfusão única canal de sistemas. Além disso, vários Chips de órgão pode ser ligados entre si através de seus canais vasculares para efetivamente criar um humano corpo em chips, que poderiam oferecer uma plataforma atraente humana em vitro para terapêutica desenvolvimento9, 10. Ao contrário de mais fisiológica de micro sistemas (MPS)11,12,13, os Chips de órgão contêm dois canais microfluídicos, separados por uma membrana porosa que facilita interações vascular parenquimatosa para recapitular a função de órgão in vivo . Isso não apenas simplifica a ligação dos diferentes órgãos juntos por perfusing um meio comum através dos canais vasculares, mas a compartimentação dos tecidos e fluidos imita funções na vivo e suporta experimentação farmacocinética e modelagem, bem como em vitro-no vivo extrapolação9,10 que é difícil ou impossível em um único canal MPS14,15,16. A popularidade de PDMS em dispositivos microfluídicos tem levado ao desenvolvimento de ferramentas para superar a capacidade inerente do material para absorver pequenas moléculas10,17. No entanto, o grande número de chips necessários para apoiar estudos biológicos, onde o uso de agentes microbianos e compostos de absorção de PDMS fazer reutilização de órgão Chips difícil exige um processo de fabricação escalável até para grupos de pesquisa pequena. O protocolo descrito aqui apresenta um método para a fabricação de dispositivo apropriado para o uso em laboratórios acadêmicos, incluindo aqueles que faltam o acesso às salas limpas e litografia macia. Este protocolo visa alargar o acesso às fichas de órgão por uma vasta gama de investigadores que pretendam usar os dispositivos stretchable, dual-channel para explorar processos biológicos básicos, bem como desenvolvimento de terapêutico translacional.
Uma abordagem robusta utilizando práticas recomendadas pela micromanufacturing campos juntamente com o projeto para fabricação, foi desenvolvida para a fabricação de dispositivos de órgão Chip em grandes quantidades com rendimento e alta reprodutibilidade. O protocolo de fabricação descrito aqui fornece um método dimensionável para produção de Chip de órgão. Nós descrevemos o uso de um opcional molde-em-lugar Jig (MiP; detalhes de design em Materiais suplementares) juntamente com tiras de poliuretano gaxeta para permitir a ampliação de fundição componentes PDMS. O lado brilhante das tiras de poliuretano produzir peças PDMS opticamente suaves enquanto o lado texturizado facilita a desmoldagem. Descrevemos também o uso de um opcional Automated membrana Fabricator (AMF) que proporciona compressão uniforme de moldes de wafer de membrana durante a cura para até 24 membranas por lote de fabricação. O projeto é amplamente aplicável para estudos de órgãos que são compostos de tecidos que experimentam a esforços mecânicos e perfusão, e esses chips podem ser produzidos com baixa variabilidade de chip-a-chip em quantidades necessárias para atender às necessidades de pequenas e grandes grupos de pesquisa parecidos. O fluxo de trabalho é favorável a um formato de lote ou linha de montagem e prontamente compatível com os protocolos de avaliação de qualidade para controle de processos de produção, treinamento de pessoal e responsivo a solução de problemas. Esperamos que este protocolo vai expandir o acesso para os recursos do canal duplo, stretchable, Chips de órgão de investigação básica e de translação.

<table><tbody><tr><td>Equipamento de proteção individual</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hairnet</td><td>VWR</td><td>89107-770</td><td></td></tr><tr><td>Jaleco Tyvek</td><td>VWR</td><td>13450-506</td><td></td></tr><tr><td>Luvas de punho estendido</td><td>VWR</td><td>89521-898</td><td></td></tr><tr><td>Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tapete de corte</td><td>VWR</td><td>102096-430</td><td></td></tr><tr><td>Cortador de azulejos</td><td>McMaster-Carr</td><td>26765A31</td><td></td></tr><tr><td>Moldes superiores Mold-in-place (MIP)</td><td>Protolabs, Inc.</td><td>impresso sob medida</td> em moldes de fundo <td>Prototherm 12120</td></tr><tr><td>Mold-in-place (MIP)</td><td>Protolabs, Inc.</td><td>impresso sob medida</td><td>em Prototherm 12121</td></tr><tr><td>Pinça curva Bico de pato</td><td>VWR</td><td>63041-864</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de ponta afiada</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>72700-D</td><td></td></tr><tr><td>Espátula de metal</td><td>VWR&</td><td>nbsp; 82027-528</td><td></td></tr><tr><td>Gravação de íons reativos profundos (DRIE)&nbsp; wafers de matriz de pilares</td><td>Sensera, Inc.</td><td>personalizado</td><td>Quatro matrizes de pilares de 50 x 50 mm por wafer; pilares de 7 um de largura, 50 um de altura, espaçados hexagonalmente 40 um de distância</td></tr><tr><td>Policarbonato texturizado de 0,01" de espessura</td><td>McMaster-Carr</td><td>85585K33</td><td>cortado em blocos PDMS quadrados de 45 mm</td></tr><tr><td>(40 x 40 x 5 mm)</td><td>n/a</td><td>personalizado</td><td></td></tr><tr><td>Capuz de fluxo laminar</td><td></td><td>BVBI</td><td>fundido internamente</td></tr><tr><td>Pistola</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>de ar comprimido60&deg; Dessecador a vácuo do forno</td><td></td><td></td><td></td>de nível C</tr><tr><td>Precisão do balanço</td><td></td><td></td> de massa <td>para 0,1 g</td></tr><tr><td>Máquina de plasma</td><td>Diener</td><td>A</td><td>capacidade de plasma de nano oxigênio é crítica</td></tr><tr><td>SuprimentosKit de</td><td></td><td></td><td></td></tr> base<tr><td></td>/agente de cura Sylgard 184 poli (dimetilsiloxano) (PDMS) Ellsworth Adhesives&<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> nbsp;</td><td></td><td></td>4019862</tr><tr><td>Copo</td><td></td><td></td> de mistura <td>Assegure uma ventilação adequada ao manusear o pré-polímero devido aos baixos níveis de etilbenzeno</td></tr><tr><td>Seringa de 1 mL</td><td>VWR</td><td>10099-395</td><td></td></tr><tr><td>Toalhetes para salas limpas</td><td>VWR</td><td>TWTX1080</td><td></td></tr><tr><td>lâminas de microscópio de vidro de 25 x 75 mm</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Fita de embalagem</td><td>VWR</td><td>500043-724</td><td></td></tr><tr><td>Fita adesiva</td><td>VWR</td><td>500026-873</td><td></td></tr><tr><td>Tiras de poliuretano (PU) cortadas</td><td>Atlantic Gasket, Inc.</td><td>Personalizado: AGWI2X3</td><td>&nbsp; 1/8" grosso; 60 durômetros de poliuretano preto; 2" x 3"</td></tr><tr><td>Filme de policarbonato .005" de espessura</td><td>McMaster-Carr</td><td>85585K102</td><td></td></tr><tr><td>100 x 100 x 15 mm placas de Petri quadradas gradeadas</td><td>VWR</td><td>60872-480</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Folha de alumínio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipamento opcional</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thinky Misturador PDMS</td><td>Thinky</td><td>ARE-310</td><td></td></tr><tr><td>Gabarito de</td><td>compressão de braçadeira de parafuso</td><td>interno</td><td></td></tr><tr><td>Fabricante automatizado de membranas (AMF)</td> matriz <td>interna</td><td></td> de <td>pistão de compressão pneumática com aquecedor programável</td></tr></tbody></table>

fabricação escalável de stretchable, dual channel, órgão microfluidic chips

Scalable Fabrication of Stretchable, Dual Channel, Microfluidic Organ Chips

Um número significativo de compostos de chumbo falha no pipeline de farmacêutica, pois estudos em animais, muitas vezes, não conseguem prever respostas clínicas em pacientes humanos. Órgão-em-um-microplaqueta (órgão Chip) microfluidic celular cultura dispositivos humana, que fornecem uma plataforma experimental em vitro para avaliar a eficácia, toxicidade e farmacocinéticos (PK) perfis em seres humanos, podem ser melhores preditores de eficácia terapêutica e segurança na clínica comparada com estudos em animais. Estes dispositivos podem ser usados para modelar a função de praticamente qualquer tipo de órgão e podem ser fluidically através de microcanais comum de endotélio-alinhado para realizar estudos em vitro na fisiologia humana de órgãos-nível e de todo corpo sem ter que realizar experiências com as pessoas. Esses Chips de órgão consistem em dois canais microfluídicos perfundidos, separados por uma membrana polimérica permeável com células parenquimais órgão específico, de um lado e endotélio microvascular do outro, que pode ser esticado ciclicamente para fornecer órgão específico pistas mecânicas (por exemplo, respiração movimentos no pulmão). Este protocolo detalha a fabricação de flexível, dual channel, Chips de órgãos através de fundição de peças usando 3D impresso moldes, permitindo a combinação de vários casting e pós-processamento em etapas. Porosa poli (dimetil siloxano) membranas (PDMS) são expressos com micrômetro de tamanho usando matrizes de pilar silício sob compressão através de buracos. Fabricação e montagem de Chips de órgãos envolve equipamentos e etapas que podem ser implementadas fora de uma sala de limpeza tradicional. Este protocolo fornece aos pesquisadores acesso a tecnologia de Chip de órgão para em vitro estudos de nível de órgão e corpo na descoberta da droga, segurança e testes de eficácia, bem como estudos mecanicistas dos processos biológicos fundamentais.

O protocolo aqui apresentado descreve a fabricação escalável de PDMS órgão Chips. Estes dispositivos permitem a cultura de dois tipos de tecidos perfundidos distintos em uma membrana elástica porosa (Figura 1). Os canais PDMS são expressos usando 3D moldes impressos, que acelera a prototipagem de novos projetos (Figura 2A e 2B). Top canais são moldadas em moldes sob compressão contra uma vedação compatível com po...

Aqui, apresentamos um protocolo que descreve a fabricação do stretchable, dual channel, dispositivos de cultura de célula órgão microplaqueta microfluidic para recapitulando a funcionalidade de nível de órgão em vitro.

Fabricação escalável de Stretchable, Dual Channel, órgão Microfluidic Chips

A significant number of lead compounds fail in the pharmaceutical pipeline because animal studies often fail to predict clinical responses in human ...

O objetivo geral deste protocolo é descrever a fabricação de dispositivos microfluidos de órgãos para recapitulação da funcionalidade do nível do órgão in vitro. Este protocolo descreve uma maneira de fabricar dispositivos lascados de órgãos recapitulando a função de nível de órgão in vitro. Os func, os dispositivos, como estes, são realmente fabricados usando moldes impressos em 3D a partir de uma borracha de silício macia.Esta borracha nos permite realmente imbuir esses dispositivos com pistas mecânicas que nos permite esticar o tecido como você entrar, digamos, um pulmão ou um intestino. Também adicionamos profusão, que imita o fluxo sanguíneo e o fluxo de outros fluidos corporais dentro dos sistemas de órgãos. Agora juntos, esses dispositivos nos permitem realmente recriar e tentar entender a complexa fisiologia que acontece in vivo.Mas faça isso in vitro. Então, essencialmente, estamos experimentando em humanos, mas não em pessoas. E por isso é uma maneira muito eficaz de fazer a ponte entre estudos em animais, que são sempre feitos no desenvolvimento pré-clínico da terapêutica, e depois antes dos estudos humanos, que são chamados de ensaios clínicos, onde há um risco muito maior para o ser humano, para a segurança humana.E assim esses dispositivos ajudam a fazer a ponte entre a divisão e nos permitem desenvolver novas terapêuticas e entender a biologia básica que realmente acontece em sistemas complexos como o humano. Preparação do canal superior. Limpe o lado brilhante de cada peça de poliuretano com etanol e limpe os lenços de quarto.Coloque o lado brilhante do poliuretano sobre o lado aberto do molde no molde do lugar. Coloque os conjuntos de e poliuretano no gabarito, lado texturizado contra a extremidade do gabarito. Continue a fazer isso até que todos os moldes tenham sido colocados dentro do gabarito.Aperte o gabarito girando a pega usando uma chave inglesa, até que o espaçamento do gabarito seja de 25 milímetros de largura. Faça um barco de papel alumínio em torno do molde no gabarito do lugar. Despeje PDMS em cada molde até ficar cheio.Uma vez que todo o gabarito esteja preenchido, coloque o gabarito no desiccador de vácuo. Depois de uma hora, remova do desiccator. E coloque em forno centígrado de 60 graus por pelo menos quatro horas.Desmonte o gabarito usando uma chave inglesa. Remova as tiras de poliuretano de cada molde. E descarte.Desmoldou cuidadosamente peças PDMS de seus moldes e as coloca lado a lado. Alinhe a lâmina do raspador de ladrilho no entalhe da aba final. E corte cada extremidade para cingular os componentes superiores.Armazenar peças finalizadas em pratos quadrados de Petri. Armazene peças em armários de pressão positivos à temperatura ambiente. Preparação do canal inferior.Despeje 10,5 gramas de PDMS no molde. A pistola de ar pode ser usada muito suavemente para mover o PDMS sobre o espaço. Coloque moldes no desiccator de vácuo.Depois de uma hora, mova os moldes para um forno centígrado de nível 60 graus. Coloque o molde sobre a mesa em um capô de fluxo laminar. Solte o PDMS da borda do molde.Segure um canto e retire delicadamente o PDMS da superfície do molde. Quando estiver totalmente removido, inverta e coloque na superfície de trabalho para que os recursos do canal sejam voltados para cima. Corte ao longo das bordas externas com cortador de azulejos.Com fórceps de remo planas, peças leigas colocam lado para cima na fita para remover quaisquer detritos. Remova parte da fita de embalagem. Arraste a ponta solta da peça através do slide.A ponta solta vai laminar com o vidro. Características de capa com fita adesiva. Armazene peças em armários de pressão positivos à temperatura ambiente.Preparação da membrana PDMS. Verifique se os wafers estão livres de PDMS na parte de trás. Coloque cada wafer de membrana nas ranhuras designadas.Use a seringa de um mL para colocar 09 mL de PDMS no centro de cada matriz de postagem de wafer de membrana. Deixe o PDMS sentar por um mínimo de cinco minutos. Permita que o PDMS se espalhe por todo o poste do wafer de membrana.Não prossiga para o próximo passo até que pelo menos 75% da matriz de postagem esteja coberta em PDMS. O plasma trata a tira de policarbonato usando as condições descritas no protocolo. Remova a folha de policarbonato da máquina de plasma e use uma tesoura para cortar as folhas de policarbonato em quadrados de 45 milímetros por 45 milímetros.Coloque o lado tratado de plasma dos quadrados de policarbonato sobre o PDMS, centrado no wafer de membrana. Coloque espaçador PDMS no centro do quadrado de policarbonato. Em seguida, coloque policarbonato texturizado pré-cortado.Insira bandejas para que a bandeja três esteja na parte de trás, a bandeja dois esteja no meio e a bandeja uma esteja na frente. A bandeja um tem um entalhe para alinhamento. Abra a válvula de pressão de saída e abra lentamente a válvula de pressão de entrada.Isto é para que os quatro quilos de força seja gradualmente aplicado a cada wafer de membrana, em oposição à instantaneamente que pode quebrar os wafers. Ligue o interruptor AMF para iniciar o ciclo de cura. Em seguida, feche a válvula de pressão de entrada e abra as válvulas de pressão de saída para liberar a pressão dos cilindros de ar.Remova as bandejas e leve-as para o capô de fluxo laminar. Retire cuidadosamente o policarbonato texturizado. Remova cuidadosamente o espaçador PDMS.Inspecione a membrana PDMS em busca de áreas com furos. Use um marcador para traçar o contorno da área do furo. Também marque quaisquer orifícios ou defeitos nas membranas.Este é um exemplo de uma membrana não marcada e marcada. Usando pinças de manuseio de wafer, solte wafers da bandeja. Retire cada membrana do wafer e coloque na placa de Petri.A membrana PDMS será desmoldada do wafer e será ligada ao apoio de policarbonato. Armazene peças em armários de pressão positivos à temperatura ambiente. Montagem superior e preparação.Usando fita adesiva fosca, limpe as membranas PDMS, bem como o interior da placa de Petri para remover detritos. Grave completamente o lado do recurso de cada topo de canal alto para remover detritos. Coloque tops na placa de Petri com membrana PDMS.Esteja ciente de que algumas membranas podem tomar uma ou duas partes superiores. Os principais canais de cada parte superior devem caber dentro da área marcada dentro da membrana. Coloque as placas de Petri no plasma.Membrana de tratamento de plasma e topo de acordo com o protocolo escrito. Uma vez terminado o ciclo de ligação, remova os pratos e coloque as partes superiores ativadas na membrana. Coloque em forno centígrado de 60 graus por pelo menos duas horas.Usando um bisturi, rastreie o perímetro da parte superior ligada para separá-lo do portador de policarbonato. Uma vez que a peça é rastreada, retire a parte superior do policarbonato. A membrana PDMS que se uniu ao topo deve descascar do portador também.O uso de pinças remove a membrana das portas que acessam o canal inferior. Não deixe nenhuma parte da membrana que cubra a porta de acesso. Além disso, remova quaisquer detritos ou poeira com pinças.Montagem de chips. Característica lado para cima, plasma tratar montagens superiores com fundos. Sob um microscópio invertido, alinhe o conjunto superior com a metade inferior.Coloque em forno centígrado de 60 graus por pelo menos duas horas. Resultados. O protocolo aqui apresentado descreve a fabricação escalável de chips de órgãos PDMS. Estes dispositivos permitem a cultura de dois tipos distintos de tecido profuso em uma membrana porosa elástica.Os canais PDMS são lançados usando moldes impressos em 3D, o que acelera a prototipagem de novos designs. Os canais superiores são lançados em moldes sob compressão contra uma junta de poliuretano compatível para produzir componentes com portas moldadas. Enquanto os componentes inferiores do canal são lançados em bandejas e manuseados no apoio de slides do microscópio.Esta abordagem de fabricação combina a padronização em várias escalas das peças em um único passo, o que economiza tempo, melhora a reprodutibilidade e a rastreabilidade e reduz os detritos gerados por perfuração da porta e múltiplas etapas de corte. As membranas porosas são críticas para a função do chip de órgão, e a abordagem de fabricação baseada na fundição contra wafers de silício padronizados resulta em membranas de espessura consistente e acabamento superficial. O manuseio via transportadores de policarbonato permite maior produção e armazenamento em lote.O chip de órgão montado consiste em dois canais de profusão em um pacote opticamente transparente. Na região sobreposta, uma membrana PDMS porosa permite a interação tecido-tecido de metabólitos, proteínas, terapêuticas, patógenos e células para recapitular a função do chip de órgão, enquanto dois canais paralelos de cada lado são usados para fornecer tensão mecânica, usando atolação cíclica do vácuo. A porosidade da membrana PDMS suporta biomeiadamente o fluxo de metabólitos, fatores de crescimento e até células entre a vasculatura e o órgão parenchyma.A aparente permeabilidade da membrana foi determinada utilizando-se a concentração di nos canais de saída com e sem células intestinais caco-2. As camadas de células do chip intestinal fornecem uma barreira significativamente maior à permeabilidade. O chip de órgão pode ser acionado usando os canais de vácuo paralelos para aplicar quantitativamente e reproduibavelmente o carregamento de cepa cíclica na membrana e, portanto, os tecidos cultivados.Esta cepa cíclica combinada com a profusão de mídia suporta diferenciação celular para melhor imitar a fisiologia de órgãos in vivo, como a formação de villi no chip intestinal. Usando o protocolo descrito aqui, agora você deve ser capaz de fabricar um chip de órgão PDMS elástico.

scalable-fabrication-stretchable-dual-channel-microfluidic-organ

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Geração de um chip de barreira hematoencefálica baseada no iPSC humano

Apresentamos um sistema microfluido para estudos de alto rendimento em máquinas de vida complexas, que consiste em 1500 unidades culturais, uma matriz de bombas peristálticas aprimoradas e um módulo de mistura no local. O chip microfluido permite a análise das condições microambientais altamente complexas e dinâmicas in vivo.

Geração de Condições Ambientais Dinâmicas usando um dispositivo microfluido de alto rendimento

O presente protocolo descreve as capacidades e as modalidades de cultura essenciais do Open-Top Organ-Chip para o estabelecimento e maturação bem-sucedidos de culturas organ-on-chip de espessura total de tecidos primários (pele, alvéolo, vias aéreas e intestino), proporcionando a oportunidade de investigar diferentes aspectos funcionais da interface epitelial/mesenquimal e vascular humana in vitro.

Reconstituindo a citoarquitetura e a função de tecidos epiteliais humanos em um chip de órgão de topo aberto

Aprenda a fabricação escalável de chips microfluídicos orgânicos esticáveis com canais duplos usando moldes de silicone impressos em 3D. Este método permite recriar funções de órgãos in vitro com estiramento mecânico e perfusão.

Fabricação escalável de Stretchable, Dual Channel, órgão Microfluidic Chips

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