Name: Preparação de uma cultura de célula primária de alta qualidade do peixe Pituitaries (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Aprenda a preparar culturas primárias de células hipofisárias de medaka (Oryzias latipes) com viabilidade superior a 90%. Este método otimiza temperatura, osmolalidade e pH para simular condições fisiológicas e estudar funções endócrinas.

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Este projecto foi financiado pela Universidade Norueguesa de Ciências da vida e o Conselho de pesquisa da Noruega, número de concessão, 243811 e 244461 (programa de aquicultura). Estamos gratos à Lourdes Carreon Tan na Universidade Norueguesa de Ciências da vida para manter as instalações de peixe.

As experiências com animais realizadas neste estudo foram aprovadas pela Universidade Norueguesa de Ciências da vida, seguir as orientações para o cuidado e bem-estar dos animais de pesquisa.
1. preparação de soluções
<ol><li>Calibre os instrumentos de medidor de aparelhos e pH de acordo com as instruções do fabricante para garantir uma medição correta.</li>
	<li>
Preparar 500 mL de Ca2 +- e Mg2 +-livre fosfato salino de Dulbecco (dPBS), ajustar o pH a 7.75 (etapa 1.2.1) e a pressão osmótica para 290 mOsm/kg (etapa 1.2.2) antes de uma filtração estéril (etapa 1.2.3).
	<ol>
<li>Ajuste o pH a 7.75 com um medidor de pH calibrado cuidadosamente adicionando gotas de uma solução de NaOH 1 M, agitando cuidadosamente a solução.</li>
		<li>Medir a osmolalidade da solução usando um aparelhos calibrados e calcular a quantidade de manitol, necessário para aumentar a pressão osmótica para 290 mOsm/kg. Adicione a quantidade necessária de manitol e em seguida medir a osmolalidade da solução novamente para garantir o ajuste correto. Nota: A quantidade de manitol necessário depende a osmolalidade medida, que normalmente varia entre diferentes lotes. Uma molécula de manitol é igual a 1 partícula osmótica.</li>
		<li>Estéril-filtrar a solução de dPBS usando um filtro de 0,2 µm. Nota: A solução pode ser armazenada a 4 ° C pelo menos 3 meses.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar 500 mL de meio de cultura Leibovitz (L-15) sem L-glutamina e bicarbonato e complementar com 10mm NaHCO3 (passo 1.3.1), glicose de 4,5 mM (etapa 1.3.2) e glutamina comercialmente disponível de 2 mM (etapa 1.3.3). Ajustar a solução para 290 mOsm/kg (etapa 1.3.4), filtro estéril (passo 1.3.5) e adicionar 2,5 mL de uma solução de penicilina-estreptomicina (etapa 1.3.6). Nota: A solução pode ser armazenada a 4 ° C pelo menos 4 semanas.<ol>
<li>Adicione 420 mg de NaHCO3 por 500 mL de meio de cultura para alcançar uma solução de 10 mM.</li>
		<li>Adicione 405 mg de glucose por 500 mL de meio de cultura para alcançar uma solução de 4,5 mM.</li>
		<li>Adicione 5 mL de 100 ações de x de uma solução de glutamina em 500 mL de meio de cultura para alcançar uma solução de 2 mM. Mexa até que todos os solutos são dissolvidos.</li>
		<li>Ajuste a solução para 290 mOsm/kg com manitol usando um aparelhos (como o realizado na etapa 1.2.2).</li>
		<li>Realize uma filtração estéril do meio de L-15 usando um filtro de 0,2 µm.</li>
		<li>Após a filtração estéril, adicione 2,5 mL de uma solução de penicilina-estreptomicina, correspondente a 50 U/mL de penicilina e 50 µ g/mL de estreptomicina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare-se 50 mL de uma solução de tripsina usando 1 mg/mL (0,1%) tipo de tripsina QUE II-S dissolvido na dPBS modificados (preparado na etapa 1.2). Faça alíquotas de 2 mL em tubos de plástico estéril e armazená-los a-20 º C até o uso. Nota: Alíquotas de 2 mL podem ser armazenadas a-20 º C pelo menos 3 meses.</li>
	<li>Prepare-se 50 mL de uma solução de inibidor de tripsina usando 1 mg/mL de (0,1%) tripsina inibidor tipo S e completá-lo com 2 µ g/mL de DNase eu dissolvido na dPBS modificados (preparado na etapa 1.2). Faça alíquotas de 2 mL em tubos de plástico estéril e armazená-los a-20 º C até o uso. Nota: Alíquotas de 2 mL podem ser armazenadas a-20 º C pelo menos 3 meses.</li>
</ol>2. preparação do equipamento
<ol><li>Prepare-se pipetas de vidro pelo fogo da ponta para a dissociação de célula de polimento. Fazer dicas com 2 categorias de tamanho diferentes (uma abertura média de 0,6-0,8 µm e uma pequena abertura de 0,4 – 0,6 µm), jogando com o tempo e a distância entre a chama rodando simultaneamente a pipeta. Coloque as pipetas de vidro em um recipiente de vidro limpo e autoclave-los (usando o modo sólido a 105 ° C por 45 min).</li>
	<li>Prepare uma caixa de isopor com gelo.</li>
	<li>Prepare um tubo de plástico com 1,5 mL de dPBS modificados (preparado na etapa 1.2) para transferir os pituitaries para durante a dissecção e mantê-lo no gelo.</li>
	<li>Prepare um tubo de 15 mL com 10 mL de dPBS modificados (preparado na etapa 1.2) e mantê-lo no gelo até a dissociação de célula.</li>
	<li>Prepare fresco ou descongelar alíquotas das soluções de inibidor de tripsina (preparadas em etapas 1.4 e 1.5) e tripsina e mantê-los no gelo até o uso.</li>
	<li>Configure o banho de água a 26 ° C antes de iniciar a dissecação para permitir que a água atingir a temperatura desejada antes a dissociação química dos pituitaries.</li>
	<li>Limpe todas as ferramentas de dissecação com etanol a 70% antes, durante e após o uso, incluindo a pinça fina para usar para a dissecção e agulhas finas e uma placa de cera para fixar os peixes. Usar luvas limpas (alterar e limpar frequentemente) durante todo o procedimento para evitar uma potencial contaminação das células.</li>
</ol>3. na hipófise dissecção e dissociação de célula
<ol><li>Eutanásia o peixe por imersão em lama de gelo (0 ° C). Deixe o peixe da lama de gelo pelo menos 1 min garantir um choque hipotérmico irreversível. Nota: Perda de imobilização e equilíbrio ocorrerá após alguns segundos. Verifique se o peixe está completamente submersa na água gelo e não reside em cima do gelo, como o último conduzirá à asfixia e potencial pele queima em vez de um choque hipotérmico rápido e humano.</li>
	<li>Rapidamente o peixe em uma rede de transferência para uma placa de cera sob o microscópio de dissecação e destruir a coluna por um soco de agulha no pescoço.</li>
	<li>Pino da cabeça do peixe para a placa de cera usando agulhas finas, inserindo uma agulha na parte dianteira (sobre a boca) e um em cada lado da cabeça (atrás do cérebro) para estabilizar a cabeça perante a dissecação.</li>
	<li>Ver o peixe sob o microscópio de dissecação e delicadamente, raspe as escamas na parte superior da cabeça usando a pinça fina com uma ponta em ângulo.</li>
	<li>Cuidadosamente Introduza a ponta angular da pinça fina sob a pele do lado da cabeça e remover o teto do crânio, movendo lentamente a pinça na direção da boca, mantendo um aperto firme para a pinça encerram o teto do crânio.</li>
	<li>Corte a medula espinhal completamente usando a pinça com ponta em ângulo. Nota: O tempo é um fator importante, para trabalhar eficientemente e com precisão limitar o tempo gasto desde a dissecação dos pituitaries até que as células são banhadas no prato. Depois de alguma prática, dissecação da hipófise deve levar em torno de 2 – 3 min por peixe, dos quais apenas cerca de 10 s são necessários para atender a hipófise quando o cérebro já está exposto.</li>
	<li>Vire cuidadosamente o cérebro em direção a boca para expor a hipófise e dissecá-lo com uma pinça limpa com uma ponta reta. Transferir a pituitária para um tubo de plástico contendo 1,5 mL modificado dPBS (para obter detalhes, consulte Passo 2.3) colocado no gelo. Verifique se a ponta da pinça sob o microscópio para garantir que a hipófise com êxito é adicionada ao tubo e nada é deixado a fórceps. Nota: Disse como muitos pituitaries conforme necessário, dependendo do número de pratos de cultura que vão ser preparados simultaneamente. Como regra geral, calcule pelo menos 10 pituitaries de peixe adulto por prato para ter uma densidade adequada de células (que depende da aplicação a jusante).</li>
	<li>Spin para baixo as pituitaries em uma centrífuga de mesa para 1-2 s à temperatura ambiente. Retire o dPBS usando uma pipeta de vidro cuidadosamente e tome cuidado para evitar a remoção de qualquer pituitaries.</li>
	<li>Adicione 1 mL da solução de tripsina (preparada na etapa 1.4) para lavar as pituitaries, girá-los para baixo em uma centrífuga de mesa para 1-2 s e remover a maior parte do líquido usando uma pipeta de vidro antes de adicionar um adicional 1 mL de solução de tripsina.</li>
	<li>Incubar o tubo em um banho de água a 26 ° C durante 30 minutos, de preferência com agitação suave, ou alternativamente, agite o tubo algumas vezes durante o período de incubação.</li>
	<li>Spin para baixo as pituitaries em uma centrífuga de mesa para 1-2 s à temperatura ambiente e certifique-se de todos os pituitaries estão localizados na parte inferior do tubo. Remover a maior parte da solução de tripsina com uma pipeta de vidro e adicione 1 mL da solução de inibidor de tripsina (preparada na etapa 1.5) para inactivar a tripsina e lavar os pituitaries.</li>
	<li>Recolha os pituitaries na parte inferior do tubo girando-os para baixo em uma centrífuga de mesa para 1-2 s à temperatura ambiente. Remover a maior parte do líquido com uma pipeta de vidro e adicione 1 mL da solução de inibidor de tripsina (preparada na etapa 1.5). Colocar o tubo em um banho de água a 26 ° C durante 20 minutos, de preferência com agitação suave, ou alternativamente, agite o tubo algumas vezes durante o período de incubação para inactivar a tripsina.</li>
	<li>Prepare um prato de cultura de célula poli-d-lisina-revestido de 35 milímetros com um fundo de vidro central adicionando 2 mL do meio de L-15 e deixar que incube durante pelo menos 10 min a 26 ° C e com 1% de CO2 para que conseguir atingir a temperatura e o pH antes de chapear as pilhas. Nota: Também pode ser usada numa placa de cultura de células de plástico. A principal vantagem de usar um prato com um fundo de vidro centralizado é que a área onde as células são banhadas é menor, e portanto, menos células da hipófise são necessárias por prato. Algumas aplicações a jusante também podem requerer um fundo de vidro (ou seja, algumas técnicas de imagem).</li>
	<li>Defina a refrigeração centrífuga para tubos de 15 mL a 4 ° C, para permitir-lhe chegar à temperatura desejada antes de iniciar a dissociação mecânica.</li>
	<li>Recolher os pituitaries na parte inferior do tubo por girando para baixo o tubo com a solução de inibidor de tripsina (da etapa 3.11) em uma centrífuga de mesa para 1-2 s à temperatura ambiente e certifique-se de todos os pituitaries estão localizados na parte inferior do tubo antes cuidadosamente remover a maior parte da solução do inibidor de tripsina utilizando uma pipeta de vidro. Nota: Execute todas as etapas seguintes do protocolo em uma bancada de fluxo laminar (LAF) certificadas pelo trabalho de célula evitar uma contaminação das células.</li>
	<li>Adicione 1 mL de gelado dPBS modificados (preparado na etapa 2.4) para as peças de tecido na hipófise e chupar delicadamente os pedaços de tecido e descer (6 – 7. x) em uma pipeta de vidro polido fogo (preparada no passo 2.1). Nota: A temperatura é um aspecto essencial, portanto, mantenha todas as soluções a 4 ° C. Deste ponto em diante, execute todas as etapas no gelo quando possível.</li>
	<li>Gire para baixo as peças de tecido em uma centrífuga de mesa para 1-2 s à temperatura ambiente e transferir cuidadosamente a parte superior do dPBS contendo as células dissociadas (quase 1 mL) para um novo tubo de 15 mL colocado no gelo. Evite se mover da pipeta para o fundo do tubo, onde ficam as peças de tecido.</li>
	<li>Repita a etapa 3.16 – 3.17, dissociando as células em 1 mL de dPBS gelada de cada vez, até que todos os 10 mL de dPBS é usado. Comece usando uma pipeta de vidro com uma abertura de tamanho médio e alternar para uma pipeta de vidro com uma abertura menor no final (para os último 3 – 4 mL de dPBS adicionado) da dissociação. Se há pedaços de tecido ainda visível no final do processo de dissociação, aumentar a pipetagem de aproximadamente 10 x para as 2 últimas etapas de dPBS para dissociação e finalmente deixar os pedaços de tecido residual. Ressuspender as células suavemente e evitar a criação de bolhas como pode causar danos nas células quando as células anexa à superfície das bolhas. Nota: Esta é uma etapa crítica do presente protocolo e requer algum treinamento para obter um bom resultado.</li>
	<li>Equilibrar o tubo no centrifugador (pre-resfriado a 4 ° C) e spin-down as células a 200 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Certifique-se de marcar a lateral do tubo onde será o centrifugado.</li>
	<li>Retire cuidadosamente o tubo de centrífuga e suavemente, transferir o sobrenadante com uma pipeta de vidro para um tubo de plástico vazia 15 mL diretamente após a centrifugação. Não se esqueça de remover a maior parte do sobrenadante, mas tome cuidado para não perder o pequeno centrifugado (muitas vezes invisíveis).</li>
	<li>Cuidadosamente Ressuspender as células em 50 a 100 µ l de meio de cultura de L-15. Nota: Neste passo, é possível contar as células e/ou executar um teste de viabilidade (como uma célula de contagem na presença de azul de trypan usando um hemocytometer), mas cuidado que utilizando parte da suspensão de células para o efeito irá diminuir o rendimento. Evite usar um volume grande de suspensão como aumentará o risco de células difusão fora do centro do prato.</li>
	<li>Escorrer cuidadosamente as células dissociadas no meio do prato de cultura de células contendo 2 mL do meio de L-15 (preparado na etapa 3.13). Permitir que as células para afundar até o fundo do prato por aproximadamente 5 min antes de movê-los para a incubadora, para evitar que as células espalhar fora da parte submersa da parte inferior de vidro.</li>
	<li>Incube o prato no 26 ° C e 1% CO2 para permitir que todas as células afundar completamente e anexar para o fundo do prato.</li>
	<li>Depois de 30 min, olhe para as células no microscópio para certificar-se de que eles têm ligado para o prato de cultura.</li>
	<li>Continue a incubar as células a 26 ° C e 1% de CO2.</li>
	<li>Cuidadosamente, mudar da maioria (mas não todos) o médio a cada 3-4 dias. Nota: Evite alterar o meio mais frequentemente, que possa perturbar as células e fazê-los desanexar da parte inferior do vidro. Use as células para experiências dentro de uma semana após a semeadura-los.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a declarar.

Sistemas de cultura in vitro células fornecem ferramentas poderosas para os investigadores responder a uma infinidade de questões biológicas diferentes se usado no caminho certo1. É importante lembrar que células dissociadas que perderam suas conexões com as células vizinhas ter obtido diferentes propriedades funcionais do que tinham originalmente em vivo. Para evitar ser correndo o risco de má interpretação dos resultados obtidos em experimentos em vitro , é importante ...

Cultura de pilha é uma das principais ferramentas usadas em pesquisa biológica molecular, proporcionando um excelente modelo sistema para responder perguntas biológicas diferentes, variando de fisiologia celular normal a droga triagem e carcinogênese1. As células primárias, isoladas diretamente do tecido animal usando métodos enzimáticos e/ou mecânicos, são muitas vezes consideradas biologicamente mais relevantes do que linhas celulares como a resposta biológica pode estar mais perto a situação na vivo . Protocolos para a preparação de culturas de células primárias devem ser otimizados para cada tipo de espécie e célula de interesse, a fim de imitar as características para que uma célula é adaptada e obter resultados significativos fisiologicamente.
Inúmeros protocolos descrevem as condições de cultura para sistemas de células de mamíferos, enquanto protocolos semelhantes descrevendo as condições de cultura primária de células de peixes são bastante escassos em comparação. As células são vulneráveis a mudanças rápidas de temperatura, pH e pressão osmótica e são particularmente frágeis durante o procedimento de dissociação. Soluções de sal comerciais e meios de cultura utilizados para culturas de células de mamíferos não são ideais para peixes teleósteos, especialmente em termos de sistema (s) tampão de pH e pressão osmótica. É, portanto, importante medir e ajustar as soluções aos níveis fisiologicamente relevantes desses parâmetros na espécie de interesse.
Foram feitas culturas primárias da hipófise de várias espécies de peixes teleósteos, incluindo a carpa comum (Cyprinus carpio)2,3, capim (Ctenopharyngodon idella)4, peixe dourado (Carassius auratus deda carpa )5, truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss)6, enguia europeia (Anguilla anguilla)7, tilápia (Oreochromis mossambicus)8, peixe-zebra (Danio rerio)9, e Bacalhau do Atlântico (Gadus morhua)10. Para ajustar a temperatura de incubação para as espécies de interesse, além de vários desses protocolos têm incubadas as células em condições semelhantes a mamíferos que podem ser ideais para as espécies de interesse, com um pH de 7.2 a 7.5 em um ambiente umidificado contendo 3-5% de CO2. Além disso, é claro se a pressão osmótica de soluções utilizadas para a preparação de várias destas culturas de célula primária foram ajustada e estável entre diferentes soluções.
O protocolo atual é baseado no trabalho anterior com culturas primárias do bacalhau do Atlântico10 e inclui ajustes de temperatura de incubação, osmolaridade, pH e sistemas-tampão pH, incluindo a pressão parcial de dióxido de carbono (pCO2), para a fisiologia do medaka (o. latipes). Medaka é um peixe de água doce pequeno (3 – 4 cm), nativo do sudeste da Ásia. Hoje em dia, é usado como uma espécie de modelo em muitos laboratórios de pesquisa ao redor do mundo, como é relativamente fácil para procriar e altamente resistente a muitos peixes comuns doenças11. Existem várias vantagens de usar o medaka como um modelo, incluindo uma tolerância de temperatura de 4 – 40 ° C11, um tempo de geração curto, embriões transparentes, um sexo-determinando gene12e um genoma sequenciado13, bem como muitos outros recursos genéticos disponíveis.
As condições de cultura primária neste protocolo são otimizadas para coincidir com a temperatura de 26 ° C que medakas são mantidos na instalação de peixe. Além disso, a osmolalidade é reduzida de 320 mOsm/kg de bacalhau do Atlântico vivem em água salgada para 290 mOsm/kg para medaka vivem em água doce e de acordo com a osmolalidade normal de medaka plasma14. Em comparação, a osmolalidade típica dos mamíferos plasma está na faixa de 275-295 mOsm15. Vive em uma variedade de temperaturas e possuem brânquias que estão em contacto directo com a água, tornando a capacidade de buffer e o pH do sangue e fluido extracelular em peixes diferentes em mamíferos. Meios de cultura mamíferos geralmente incluem sistemas tampão que resultam em um pH de cerca de 7,4 quando a mídia está equilibrada para uma atmosfera padrão de 5% de CO2 no ar umidificado a 37 ° C. O pH é dependente de temperatura e o valor de pH neutro (em água) aumenta com uma diminuição de temperatura16. Típico de peixes teleósteos plasma pH varia de 7,7 a 7,917. A otimização do presente protocolo incluíram uma redução de pH 7,85 bacalhau mantida a 12 ° C pH 7.75 para medaka mantida a 26 ° C, aumentando o CO2 de 0,5% a 1%.
Além disso, a capacidade de tampão bicarbonato é bastante diferente em peixes e mamíferos. CO2 é facilmente trocado sobre as brânquias em peixes e o pCO2 na água é apenas uma pequena fração da pCO2 no pulmão18. Alterar a temperatura ou o pCO2 alterará o pH e o tampão do meio. Consequentemente, o pH, nem o pCO2 recomendado pela incubação de células de mamíferos é ideal para células de peixe e, portanto, os meios de cultura devem ser otimizados com sistemas tampão contendo valores fisiologicamente relevantes para os peixes e os determinada espécie de interesse. Este protocolo descreve como preparar culturas de células primárias de pituitaries medaka e incluem ajustes de pH, osmolaridade, pH e temperatura reserva do sistema de incubação, além de outros parâmetros importantes a considerar ao preparar a célula primária culturas de espécies não-mamíferos.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Solução salina tamponada com fosfato (dPBS), sem cloreto de cálcio e cloreto de magnésio</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Alemanha)</td><td>D8537</td><td>Ajuste a solução para pH 7,75 com NaOH 1M e 290 mOsm com manitol.</td></tr><tr><td>Meio L-15 (Leibovitz), sem L-glutamina</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Alemanha)</td><td>L5520</td><td>Suplemento 500 ml de meio de cultura com 10 mM de NaHCO3, 4,5 mM de glicose, 2 mM de Glutamax. Ajuste a solução para 290 mOsm com manitol e filtre a solução através de um 0,2 &micro; m Filtro estéril PES, antes de adicionar 2,5 mL de solução de penicilina-estreptomicina (veja abaixo os detalhes).</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Alemanha)</td><td>S5881</td><td>Adicione gotas de solução 1 M para aumentar o pH de dPBS e meio de cultura para 7,75.</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Alemanha)</td><td>S5761</td><td>10 mM NaHCO3 é igual a 420 mg por 500 mL de meio de cultura.</td></tr><tr><td>D-manitol</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Alemanha)</td><td>63565</td><td>Use para aumentar a osmolalidade de dPBS e meio de cultura. Calcule a quantidade correta necessária para atingir uma osmolalidade de 290 mOsm.</td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Alemanha)</td><td>G5400</td><td>4.5 mM&nbsp; A D-glicose é igual a 405 mg por meio de cultura de 500 mL.</td></tr><tr><td>Suplemento GlutaMAX</td><td>Gibco (Life Technologies, Paisley, Reino Unido)</td> <td>35050-061</td><td>Alternativa à L-glutamina, com maior estabilidade. 2 mM Glutamax equivale a 5 ml de estoque 100x em meio de cultura de 500 mL.</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Alemanha)</td><td>P0781</td><td>Solução estoque 10.000 unidades de penicilina e 10 mg de estreptomicina por mL. Utilizar 2,5 mL de solução-estoque em meio 500 mL L-15 (equivalente a 50 U/mL de penicilina e 50 &micro; g/ml de estreptomicina).</td></tr><tr><td>Tripsina tipo II-S</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Alemanha)</td> <td>T7409</td><td>Preparar 1 mg/ml em solução de dPBS.</td></tr><tr><td>Inibidor de tripsina tipo I-S</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Alemanha)</td><td>T6522</td><td>Prepare 1 mg/mL em solução dPBS, suplemente com 2 &micro; g / ml de Dnase I (veja os detalhes abaixo).</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Alemanha)</td><td>D5025</td><td>Uso em solução inibidora de tripsina (veja acima).</td></tr><tr><td>0,2 &micro; m Sistema de filtro estéril de polietersulfona (PES)</td><td>Corning Inc. (Corning, NY)</td><td>431097</td><td>Use para filtração estéril de dPBS e meio L-15 após ajustes.</td></tr><tr><td>Placa de cultura de células de 35 mm com fundo de vidro, revestida com poli d-lisina</td><td>MatTek Corporation (Ashland, MA)</td><td>P35GC-1.5-10-C</td><td>Também pode ser substituída por uma placa de plástico, dependendo da aplicação a jusante.</td></tr><tr><td>Pinça fina Dumont #5</td><td>Ferramentas de Ciência Fina (CA)</td><td>11254-20</td><td>Ponta reta</td></tr><tr><td>Pinça fina Dumont #5/45</td><td>Ferramentas de Ciência Fina (CA)</td><td>11253-25</td><td>Ponta angular de 45&deg;</td></tr><tr><td>Microscópio estéreo SZ61</td><td>Olympus Corp. (Tóquio, Japão)</td><td></td><td>Use para dissecação de hipófise.</td></tr><tr><td>Alegra X-22R Centrufuge</td><td>Beckman Coulter Inc. (Brea, CA)</td><td></td><td>Com opção de resfriamento (semelhante ao modelo atual XR-30).</td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>Techne (Staffordshire, Reino Unido)</td><td></td><td>Qualquer banho-maria com possibilidade de ajuste de temperatura serve.</td></tr><tr><td>Pipetas de vidro Pasteur</td><td>VWR (NY)</td><td>612-1701</td><td>Diâmetro exterior 1,6 mm, polidor de fogo e autoclave antes da utilização.</td></tr><tr><td>Centrífuga de mesa Galaxy MiniStar</td><td>VWR (NY)</td><td>521-2844</td><td>Qualquer centrífuga de mesa pequena serve.</td></tr><tr><td>Agulhas finas/alfinetes de insetos</td><td>Fine Science Tools (CA)</td><td>26001-40</td><td>Diâmetro 0,03 mm. Outras agulhas finas podem ser usadas em seu lugar.</td></tr><tr><td>Placa</td><td></td><td></td> de cera <td>Feita à medida adicionando cera de parafina derretida em uma grande placa de Petri.</td></tr></tbody></table>

preparação de uma cultura de célula primária de alta qualidade do peixe pituitaries

Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries

Cultura de pilha primária é uma poderosa ferramenta comumente usada pelos cientistas para estudar as propriedades celulares e mecanismos de células isoladas em um ambiente controlado. Apesar das vastas diferenças na fisiologia entre mamíferos e peixes, protocolos de cultura de célula primária de peixe são frequentemente com base em condições de cultura mamíferos, frequentemente com apenas pequenas modificações. As diferenças ambientais afetam não só a temperatura do corpo, mas também soro sanguíneo parâmetros tais como a osmolaridade, pH e capacidade tampão de pH. Como meios de cultura celular e soluções de trabalho semelhantes são feitas para imitar as características do líquido extracelular e/ou soro de sangue para que uma célula é adaptada, é fundamental que esses parâmetros são ajustados especificamente para o animal em questão.
O atual protocolo descreve as condições de cultura primária otimizado para medaka (Oryzias latipes). O protocolo fornece etapas detalhadas sobre como isolar e manter saudável dissociado células da hipófise para mais de uma semana e inclui as seguintes etapas: 1. a adaptação da osmolalidade para os valores encontrados no plasma de sangue medaka, 2. a adaptação do temperatura de incubação à temperatura normal medaka (aqui na instalação de aquário) e 3. o ajuste do pH e bicarbonato buffer para valores comparáveis a outras espécies de peixes vivem em temperaturas semelhantes. Os resultados apresentados usando o protocolo descrito promovem resultados fisiologicamente significativos para medaka e podem ser usados como um guia de referência pelos cientistas fazer culturas de células primárias de outras espécies não-mamíferos.

Este protocolo descreve a preparação de uma cultura de célula primária de pituitaries medaka e fornece as células saudáveis que podem ser mantidas em uma cultura pelo menos uma semana. O protocolo é baseado em valores correspondentes fisiológicos medaka14 e além disso é otimizado para o tecido da hipófise em peixes adultos, usando um pH de 7.75 e uma osmolalidade de 290 mOsm/kg durante todo o procedimento desde a colheita de tecidos para o chapeado células em cultu...

Aqui descrevemos um protocolo para preparar e manter as culturas de células da hipófise primário de medaka (Oryzias latipes). As condições otimizadas no presente protocolo considerar parâmetros importantes, tais como temperatura, pH e pressão osmótica imitando as condições fisiológicas dos peixes, possibilitando resultados fisiologicamente mais significativos.

Preparação de uma cultura de célula primária de alta qualidade do peixe Pituitaries

Primary cell culture is a powerful tool commonly used by scientists to study cellular properties and mechanisms of isolated cells in a controlled ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da endocrinologia sobre como as células hipofisárias funcionam e interagem em um ambiente controlado. As principais vantagens desta técnica são que ela promove resultados fisiologicamente significativos para o medaka e fornece um guia de referência para fazer culturas de células primárias de outras espécies. Comece prendendo a cabeça do medaka à placa de cera com uma agulha fina inserida sobre a boca e uma de cada lado da cabeça atrás do cérebro.Coloque o peixe sob um microscópio de dissecação e use uma pinça fina com uma ponta angular para raspar suavemente as escamas do topo da cabeça. Insira cuidadosamente a pinça sob a pele da lateral da cabeça e mova lentamente a pinça em direção à boca para remover o teto do crânio. Corte a medula espinhal completamente com a pinça e vire cuidadosamente o cérebro em direção à boca para expor a hipófise.Colha a glândula com uma pinça limpa com uma ponta reta em um tubo de plástico contendo 1,5 mililitros de DPBS modificado no gelo. Quando todas as hipófises tiverem sido coletadas, gire os tecidos com uma microcentrífuga por um a dois segundos em temperatura ambiente e use uma pipeta de vidro para remover cuidadosamente a DPBS, tomando cuidado para não perturbar o pellet hipofisário. Lave o tecido com um mililitro de solução de tripsina por mais um a dois segundos na microcentrífuga e use a pipeta de vidro para aspirar a maior parte do sobrenadante.Quando toda a tripsina tiver sido removida, adicione outro mililitro de tripsina à amostra e incube o tecido em banho-maria a 26 graus Celsius por 30 minutos com movimentos suaves ocasionais. No final da incubação, centrifugue as hipófises por um a dois segundos e use uma pipeta de vidro para remover a maior parte da tripsina sem perturbar o tecido. Em seguida, lave a amostra com um mililitro de solução inibidora de tripsina para inativar a tripsina e centrifugue por um a dois segundos.Depois de remover o sobrenadante, adicione outro mililitro de solução inibidora de tripsina ao tubo e incube a amostra em banho-maria a 26 graus Celsius por 20 minutos com movimentos. Enquanto o tecido está incubando, adicione dois mililitros de meio L-15 a uma placa de cultura de células codificada em poli-D-lisina de 35 milímetros com fundo de vidro central e equilibre a placa a 26 graus Celsius e 1% de dióxido de carbono por pelo menos 10 minutos. No final da incubação, centrifugue as hipófises por um a dois segundos e aspire cuidadosamente toda a solução inibidora de tripsina do tubo.Em uma coifa de fluxo laminar, adicione um mililitro de DPBS modificado gelado aos pedaços de tecido hipofisário e use uma pipeta de vidro polido a fogo para triturar suavemente os tecidos seis a sete vezes no gelo, tomando cuidado para evitar bolhas. Após mais um a dois segundos de centrifugação, transfira suavemente cerca de um mililitro da célula dissociada contendo a camada superior de DPBS para um novo tubo de 15 mililitros no gelo. Repita a trituração e a coleta de células dissociadas mais nove vezes até que todos os 10 mililitros do DPBS tenham sido usados, começando com a ponta da pipeta com uma abertura de tamanho médio e mudando para uma ponta de pipeta com a abertura menor nos últimos três a quatro mililitros de DPBS.A dissociação mecânica com uma pipeta de vidro é uma etapa crítica deste protocolo e requer algum treinamento para alcançar um bom resultado. Pipete a solução celular suavemente para evitar danificar as células dissociadas frágeis. Após a 10ª trituração, marque o lado de cada tubo onde estará o pellet e gire a amostra em uma centrífuga pré-resfriada.No final da centrifugação, remova cuidadosamente o tubo da centrífuga e use uma pipeta de vidro para transferir imediata mas suavemente o sobrenadante para um tubo de plástico de 15 mililitros, tendo o cuidado de remover a maior parte do sobrenadante sem perturbar o pequeno pellet frequentemente invisível, em seguida, ressuspenda cuidadosamente o pellet em 50 a 100 microlitros de meio de cultura L-15. Goteje cuidadosamente as células dissociadas no meio da placa de cultura de células previamente preparada e deixe as células afundarem no fundo da placa por aproximadamente cinco minutos antes de mover a placa para a incubadora para evitar que as células se espalhem para fora da área afundada do fundo do vidro. Após 30 minutos a 26 graus Celsius e 1% de dióxido de carbono, verifique as células por microscopia de luz para confirmar se elas se fixaram no fundo do prato e retorne a cultura de células hipofisárias dissociadas à incubadora por não mais de sete dias.A colheita de cerca de 10 hipófises medaka adultas geralmente resulta em uma densidade de cerca de 50.000 a 100.000 células por prato após a semeadura. O número de células morrendo é quase constante ao longo do tempo, com mais de 95% das células viáveis após um dia e mais de 90% ainda vivas após três dias, com um pequeno declínio na viabilidade observado em uma semana de cultura. Registros eletrofisiológicos de células gonadotróficas do hormônio luteinizante GFP demonstram que as células hipofisárias dissociadas são capazes de disparar potenciais de ação espontaneamente após quatro dias em cultura.Além disso, após a estimulação do hormônio liberador de gonadotrofina, uma hiperpolarização transitória inicial da membrana celular é seguida por um aumento dramático na frequência de disparo que é concomitante com a despolarização e aumento da duração dos potenciais de ação. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de trabalhar de maneira precisa e eficiente para manter as células da hipófise em um estado saudável. Após este procedimento, outros métodos, como qPCR ou técnicas avançadas de imagem, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre como tratamentos específicos podem alterar a fisiologia das células hipofisárias.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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